蠶用消毒劑藥效評價試驗技術(shù)指導(dǎo)原則

1、蠶用消毒劑藥效評價試驗技術(shù)指導(dǎo)原則一、概述（一）定義與目的 蠶用消毒劑藥效評價試驗技術(shù)指導(dǎo)原則是為蠶用消毒劑進行臨床試驗制定的。蠶用消毒劑臨床消毒效果評價以家蠶為主要對象，其目的是為了評價一種蠶用消毒劑是否對家蠶病原微生物具有消毒（殺滅）作用，并確定臨床應(yīng)用的推薦用法與用量。廣譜蠶用消毒劑必須對本指導(dǎo)原則中列出的所有菌、毒種進行消毒試驗，專用消毒劑可選擇1種或幾種菌、毒種進行試驗。（二）適用范圍本指導(dǎo)原則適用于蠶室蠶具消毒劑、蠶用煙熏劑和桑葉葉面消毒劑對各種病原體的消毒效果評價。二、試驗設(shè)計（一）試驗用蠶1.品種：用一化性或二化性的現(xiàn)行普通四眠蠶品種，所用蠶種為雜交種。2.來源：有生產(chǎn)許可證單

2、位生產(chǎn)的合格蠶種。（二）試驗材料1.受試藥物及來源：受試藥物應(yīng)與擬上市的制劑完全一致，有完整的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有合乎規(guī)定格式的說明書。受試藥物應(yīng)來源于同一批號，由申報單位自行研制并在GMP驗收合格的車間生產(chǎn)的樣品，并提供中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所或農(nóng)業(yè)部認定的其他獸藥檢驗機構(gòu)出具的產(chǎn)品檢驗合格報告。2.標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基：下列標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和稀釋液用于試驗菌、毒種的制備。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、稀釋液（胰蛋白胨生理鹽水溶液）、沙堡液體培養(yǎng)基、沙堡瓊脂培養(yǎng)基、有機干擾物（3%牛血清白蛋白）。上述培養(yǎng)基配方參見附錄A。3.試驗菌、毒種應(yīng)采用大學(xué)或省級以上專業(yè)研究機構(gòu)鑒定保藏的菌種。如果采用自然感染病例分離的菌株

3、，應(yīng)詳細記錄其來源，并應(yīng)經(jīng)有資質(zhì)的部門鑒定方可用于試驗。試驗菌、毒種的制備、計數(shù)、保藏及試驗菌片的制備等見附錄B。（三）殘留消毒劑的去除和中和劑選擇觀察藥物的殺菌（消毒）作用時，必須在藥物與菌體接觸一定時間后立即去除菌體周圍的藥物或消除藥物的殺菌作用。去除殘留消毒劑的方法可用化學(xué)中和法和離心沉淀法等。1.化學(xué)中和法是目前最常用的一種方法。做法是向標(biāo)本回收液中加入適當(dāng)量的中和劑，使消毒劑濃度得到稀釋，并且消毒作用受到化學(xué)中和。中和劑選擇試驗方法見附錄C。2.離心沉淀法將消毒處理后的標(biāo)本用磷酸鹽緩沖液反復(fù)離心洗滌3次，最后將沉淀物轉(zhuǎn)種到合適培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。無論用何種方法，事先必須用實驗證明該法可

4、中止消毒劑的作用且對實驗菌、毒種無抑制作用，對培養(yǎng)基無不良影響。（四）試驗分組進行蠶用消毒劑試驗時應(yīng)分以下各組。1.空白對照（不感染不處理）組。2.感染不處理組（陰性對照組）：根據(jù)各種試驗的規(guī)定，用稀釋液代替消毒劑溶液，按試驗組同樣的方法進行試驗。所得結(jié)果代表菌液原有濃度，以其作為計算殺滅對數(shù)或滅活率的初始濃度。3.試驗組：根據(jù)本原則中所列試驗菌、毒種，選定所有的試驗菌種和不同消毒劑濃度以及作用時間進行試驗；如試驗?zāi)康氖茄兄茖Ｓ玫男Q用消毒劑，根據(jù)本原則中所列試驗菌、毒種，選定相應(yīng)的試驗菌、毒種和不同消毒劑濃度以及作用時間進行試驗。4.藥物對照組（陽性對照組）。每個組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)（單元）

5、用50條2齡起蠶。（五）試驗方法蠶用消毒劑進行消毒試驗時，常用的試驗方法有：懸液定量殺滅試驗、載體浸泡定量殺滅試驗、載體噴霧定量殺滅試驗和煙熏定量殺滅試驗等。進行蠶室蠶具消毒劑研制時，一般采用懸液定量殺滅試驗或載體浸泡定量殺滅試驗；或追加載體噴霧定量殺滅試驗；進行煙熏劑研制時，采用煙熏定量殺滅試驗。1.細菌芽孢消毒試驗 進行細菌芽孢消毒試驗時，有下列4種方法可供選擇，按測試目的選擇1種方法進行試驗。（1）懸液定量殺滅試驗操作程序消毒液配制：首先按試驗設(shè)計或產(chǎn)品說明書要求配制消毒液。無特殊說明者，一律使用無菌硬水配制，配制的濃度為待測濃度的1.25倍（例如要評價的消毒液濃度為200 mg/L，則

6、應(yīng)配制250mg/L），置20±1 水浴備用。試驗菌液配制：按照“附錄B 試驗菌、毒種的制備、計數(shù)、保藏及試驗菌片的制備”規(guī)定的方法配制實驗用菌懸液，濃度為1×108cfu/ml5×108cfu/ml。消毒處理：取消毒試驗用無菌大試管，先加入0.5ml試驗用菌懸液，再加入0.5ml有機干擾物，混勻，置 20±1 水浴中 5min后，用無菌吸管吸取上述濃度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混勻并立即記時。中和：待試驗菌與消毒劑相互作用至各預(yù)定時間，分別吸取0.5ml試驗菌與消毒劑混合液加于 4.5ml 經(jīng)滅菌的中和劑中，混勻。活菌計數(shù)：各管試驗菌與消毒劑

7、混合液經(jīng)加中和劑作用10min 后，分別吸取 1.0ml樣液，按活菌培養(yǎng)計數(shù)方法測定存活菌數(shù)，每管樣液作兩次活菌計數(shù)即可。如平板上生長的菌落數(shù)較多時，可進行系列10倍稀釋后，再進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。對照：同時用稀釋液代替消毒液，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。以不作任何處理的作為空白對照組。培養(yǎng)與觀察：所有試驗樣本均在 37 溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 72h 觀察最終結(jié)果。重復(fù)與計量：試驗重復(fù)3次，計算各組的活菌濃度（cfu/ml），并換算為對數(shù)值（N），然后按下式計算殺滅對數(shù)值:殺滅對數(shù)值（KL）對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（No）試驗組活菌濃度對數(shù)值（Nx）計算殺滅對數(shù)值時，取小數(shù)點后兩位

8、值，可以進行數(shù)字修約。如果消毒試驗組消毒處理后平均生產(chǎn)菌落數(shù)，小于等于1時，其殺滅對數(shù)值，即大于等于對照組平均活菌濃度的對數(shù)值。（2）載體浸泡定量殺滅試驗操作程序消毒處理：取無菌小平皿，標(biāo)明所注入消毒液的濃度。按每片 5.0ml 的量，吸取相應(yīng)濃度的消毒劑溶液注入平皿中。將盛有消毒劑的平皿置 20±1 溫箱內(nèi) 5 min 后，用無菌鑷子分別放入預(yù)先制備的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。中和與活菌計數(shù)：待菌藥相互作用至各預(yù)定時間，用無菌鑷子將菌片取出分別移入一含 5.0ml 中和劑試管中。用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬茉谑终粕险袂?80 次，使菌片上的細菌被洗脫進入中和液中，再放

9、置5 min以上，使中和作用充分。最終進一步混勻后，吸取 1.0 ml 直接接種平皿，每管作兩次活菌計數(shù)，測定存活菌數(shù)。對照：另取無菌小平皿，按每片5.0ml 的量，吸取相應(yīng)的稀釋液注入平皿中，置 20±1 溫箱內(nèi)5min 后，用無菌鑷子分別放入預(yù)先制備的菌片 3 片，并使之浸透于稀釋液中，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。以不作任何處理的作為空白對照組。培養(yǎng)與觀察：所有試驗樣本均在 37 溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 72h 觀察最終結(jié)果。重復(fù)與計量：試驗重復(fù) 3 次 （包括對照），計算各組的活菌量（cfu/片），并換算為對數(shù)值（N），然后按“懸液定量殺滅試驗”中的公式計算殺滅對數(shù)

10、值。（3）載體噴霧定量殺滅試驗操作程序選定消毒劑的濃度與作用時間：根據(jù)所試菌種和消毒劑對該菌的殺滅能力，選定1個消毒劑濃度（試驗設(shè)計中設(shè)定的濃度）和至少3 個不同作用時間進行試驗。載體設(shè)置：試驗時，每種載體菌片各取 3 片，以等邊三角形或三角形陣列，均勻排布于一未沾有任何消毒劑的清潔無菌玻璃板上（如無菌平皿內(nèi)）。消毒處理：每批試驗以同一濃度消毒劑溶液對上述排列的菌片進行均勻噴霧。每次噴霧的距離和壓力保持一致，以盡量使噴到菌片上的霧粒大小和數(shù)量一致。噴霧量以不使菌片濕透、流液為度。中和與活菌計數(shù)：待試驗菌與消毒劑相互作用至各規(guī)定時間，取每種載體菌片 1 片，各放入一含 5.0ml 中和劑的無菌試

11、管中。將試管用電動混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上細菌被洗脫進入中和液中。吸取 1.0ml 上述洗脫液，按活菌培養(yǎng)計數(shù)方法測定存活菌數(shù)，每管作兩次活菌計數(shù)。每批試驗均應(yīng)換一塊未沾有任何消毒劑的清潔無菌玻璃板。噴霧器換裝新濃度消毒劑前，應(yīng)將原殘留消毒劑洗凈，再換裝新濃度消毒劑。對照：用稀釋液代替消毒液，按同樣的噴霧方法進行處理，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。以不作任何處理的作為空白對照組。培養(yǎng)與觀察：所有試驗樣本均在 37 溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 72h 觀察最終結(jié)果。重復(fù)與計量：試驗重復(fù) 3 次，計算各組的活菌數(shù)（cfu/片），并換算為對數(shù)值（N），然后按“懸液定

12、量殺滅試驗”中的公式計算殺滅對數(shù)值。（4）煙熏定量殺滅試驗操作程序根據(jù)試驗設(shè)計或產(chǎn)品說明書的要求，選定試驗菌種與消毒劑的濃度和作用時間進行試驗。熏煙容器：煙熏定量殺滅試驗在一個容積為1m3正方形的密閉箱子內(nèi)進行，箱子的每個內(nèi)壁都安裝有寬約20cm的平臺，分三層，供消毒時放置菌片用。如需要特定的溫度條件，試驗時箱子內(nèi)的溫度必須達到要求的溫度。試驗時，每種載體菌片各取 12片，分上、中、下三層放置，每片菌片放置在一清潔無菌玻璃板上（如無菌平皿內(nèi)），每層4片菌片，分別放在不同的平臺上。消毒處理：每批試驗根據(jù)試驗設(shè)計的要求進行，如該產(chǎn)品注明必須利用煙霧進行消毒，要做到消毒時無明火，且藥劑發(fā)煙充分徹底。

13、中和與活菌計數(shù)：待試驗菌與消毒劑相互作用至各規(guī)定時間，打開箱子，分別從每層取載體菌片 1 片（共3片），一起放入一含 5.0ml 中和劑的無菌試管中。將試管用電動混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上細菌被洗脫進入中和液中。吸取 1.0ml 上述洗脫液，按活菌培養(yǎng)計數(shù)方法測定存活菌數(shù)，每管作兩次活菌計數(shù)。對照：在相同的溫度下將菌片放置在不作消毒處理的箱子內(nèi)相同時間，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。以不作任何處理的作為空白對照組。培養(yǎng)與觀察：所有試驗樣本均在 37 溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 72h 觀察最終結(jié)果。重復(fù)與計量：試驗重復(fù) 3 次，計算各組的活菌數(shù)（cfu/片），并

14、換算為對數(shù)值（N），然后按“懸液定量殺滅試驗”中的公式計算殺滅對數(shù)值。（5）評價規(guī)定產(chǎn)品申報新蠶用消毒劑時，要求在產(chǎn)品說明書指定的濃度與3個作用時間，重復(fù)試驗3次。在產(chǎn)品指定最低濃度與最短作用時間，以及最短作用時間的1.5倍時，要求懸液定量殺滅試驗中各次的殺滅對數(shù)均應(yīng)5.00。要求載體浸泡定量殺滅試驗、載體噴霧定量殺滅試驗和煙熏定量殺滅試驗中，各次的殺滅對數(shù)均應(yīng)3.00，可判定為消毒合格。在產(chǎn)品指定濃度與最短作用時間的0.5倍時，可容許在部分重復(fù)次數(shù)中，出現(xiàn)不合格結(jié)果。產(chǎn)品鑒定時，在產(chǎn)品說明書指定的最低濃度與最低作用時間，重復(fù)試驗3次。要求懸液定量殺滅試驗中，各次的殺滅對數(shù)值均5.00，可判定

15、為消毒合格。要求載體浸泡定量殺滅試驗、載體噴霧定量殺滅試驗和煙熏定量殺滅試驗中，各次的殺滅對數(shù)值均3.00，可判定消毒合格。報告中應(yīng)將各次試驗的結(jié)果全部以表格的形式列出。感染不處理組（陰性對照組）應(yīng)列出各次試驗菌濃度，以及平均試驗菌濃度。試驗組應(yīng)列出殺滅對數(shù)值，殺滅對數(shù)值大于5.00時，應(yīng)表示為5.00，而不必列出具體的數(shù)字；殺滅對數(shù)值小于5.00時，應(yīng)列出具體的數(shù)字（例如2.58，4.65）。（6）注意事項試驗中所使用的中和劑、稀釋液和培養(yǎng)基等，各批次均應(yīng)進行無菌檢查，發(fā)現(xiàn)有菌生長，則全部試驗需換用未污染試劑或培養(yǎng)基重做。懸液定量殺滅試驗時，有機干擾物一般采用3%（W/V）牛血清白蛋白貯存溶

16、液，取0.5ml加入到消毒體系中（稀釋10倍），進行消毒試驗。如果某消毒劑使用說明書中規(guī)定，產(chǎn)品只用于清潔物品或器械的消毒或只作清洗消毒，可采用0.3%（W/V）牛血清白蛋白貯存溶液，取0.5ml加入到消毒體系中（稀釋10倍），進行消毒試驗。進行煙熏定量殺滅試驗時要密切觀察，防止明火產(chǎn)生，注意安全。2.真菌消毒試驗（1）試驗程序常用殺滅試驗有：懸液定量殺滅試驗、載體浸泡定量殺滅試驗、載體噴霧定量殺滅試驗、煙熏定量殺滅試驗等。選擇的試驗菌種一般為白僵菌和黃曲霉，試驗用培養(yǎng)基一般為沙堡瓊脂培養(yǎng)基和沙堡液體培養(yǎng)基。其操作程序同“細菌芽孢消毒試驗”?；罹囵B(yǎng)計數(shù)時，對白僵菌，在25培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h7

17、2h 觀察最終結(jié)果。對黃曲霉，在30培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h72h觀察最終結(jié)果。（2）評價規(guī)定和注意事項與“（五）1（5）細菌芽孢消毒試驗”相同。3.病毒消毒試驗常用殺滅試驗方法有懸液定量殺滅試驗、載體浸泡定量殺滅試驗、載體噴霧定量殺滅試驗和煙熏定量殺滅試驗等，按測試目的選擇1種方法進行。（1）懸液定量殺滅試驗操作程序消毒液配制：按試驗設(shè)計要求配制消毒液。無特殊說明者，一律使用無菌硬水配制，配制的濃度為待測濃度的1.25倍（例如要評價的消毒液濃度為200 mg/L，則應(yīng)配制250mg/L），置20±1 水浴備用。病毒液配制：按照“附錄B 試驗菌、毒種的制備、計數(shù)、保藏及試驗菌片的制備”中規(guī)

18、定的方法配制實驗用家蠶核型多角體病毒多角體或質(zhì)型多角體病毒多角體懸液，濃度為1×109個/ml。消毒處理：取消毒試驗用無菌大試管，先加入0.5ml試驗用病毒多角體懸液，再加入0.5ml有機干擾物，混勻，置 20±1 水浴中 5min后，用無菌吸管吸取上述濃度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混勻并立即記時。中和：待試驗病毒多角體與消毒劑相互作用至各預(yù)定時間，分別吸取0.5ml試驗病毒與消毒劑混合液加于 4.5ml 經(jīng)滅菌的中和劑中，混勻。添食：各管試驗病毒與消毒劑混合液經(jīng)加中和劑作用 10min 后，將中和后的混合液均勻地涂抹于直徑2cm的圓形桑葉背面，每片圓葉涂抹50m

19、l混合液，每區(qū)（單元）50頭2齡起蠶，每區(qū)（單元）喂飼涂抹混合液的圓葉6片，每種處理設(shè)3個重復(fù)。對照：同時用稀釋液代替消毒液，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。以不作任何處理的作為空白對照組。飼養(yǎng)管理、觀察與計量：待蠶將以上涂抹混合液的桑葉食盡后，改喂普通無菌桑葉。根據(jù)各種蠶病潛伏期的長短，在2527下飼養(yǎng)觀察一定時間（一般核型多角體病5d，質(zhì)型多角體病10d，期間出現(xiàn)病死蠶應(yīng)及時調(diào)查確認），飼養(yǎng)過程中隨時觀察蠶體的生長發(fā)育情況，做好病蠶的隔離消毒工作，防止交叉感染。根據(jù)各種病的發(fā)病癥狀并結(jié)合顯微鏡進行逐條檢查，記錄發(fā)病蠶頭數(shù)。計算各組發(fā)病率，然后按下式計算滅活率：重復(fù)：試驗重復(fù)3

20、次，計算平均滅活率。（2）載體浸泡定量殺滅試驗操作程序消毒處理：取無菌小平皿，標(biāo)明所注入消毒液的濃度。按每片 5.0ml 的量，吸取相應(yīng)濃度的消毒劑溶液注入平皿中。將盛有消毒劑的平皿置 20±1 溫箱內(nèi) 5min 后，用無菌鑷子分別放入預(yù)先制備的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。中和與添食：待菌藥相互作用至各預(yù)定時間，用無菌鑷子將菌片取出分別移入一含 5.0ml 中和劑試管中。用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬茉谑终粕险袂?80 次，使菌片上的病毒被洗脫進入中和液中，再放置5min以上，使中和作用充分。最終進一步混勻后，將中和后的混合液均勻地涂抹于直徑2cm的圓形桑葉背面，每片圓葉涂

21、抹50ml混合液，每區(qū)（單元）50頭2齡起蠶，每區(qū)（單元）喂飼涂抹混合液的圓葉6片，每種處理設(shè)3個重復(fù)。對照：另取無菌小平皿，按每片5.0ml 的量，吸取相應(yīng)的稀釋液注入平皿中，置 20±1 溫箱內(nèi)5min 后，用無菌鑷子分別放入預(yù)先制備的菌片 3 片，并使之浸透于稀釋液中，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。以不作任何處理的作為空白對照組。飼養(yǎng)管理、觀察與計量：待蠶將以上涂抹混合液的桑葉食盡后，改喂普通無菌桑葉。根據(jù)各種蠶病潛伏期的長短，在2527下飼養(yǎng)觀察一定時間（一般核型多角體病5d，質(zhì)型多角體病10d，期間出現(xiàn)病死蠶應(yīng)及時調(diào)查確認），飼養(yǎng)過程中隨時觀察蠶體的生長發(fā)育

22、情況，做好病蠶的隔離消毒工作，防止交叉感染。根據(jù)各種病的發(fā)病癥狀并結(jié)合顯微鏡進行逐條檢查，記錄發(fā)病蠶頭數(shù)。計算各組發(fā)病率，然后按下式計算滅活率：重復(fù)：試驗重復(fù)3次，計算平均滅活率。（3）載體噴霧定量殺滅試驗操作程序選定消毒劑的濃度與作用時間：根據(jù)所試病毒和消毒劑對該病毒的殺滅能力，選定1個消毒劑濃度（試驗設(shè)計中設(shè)定的濃度）和 至少3 個不同作用時間進行試驗。載體設(shè)置：每種病毒所染菌片應(yīng)分開進行試驗。試驗時，每種載體菌片各取 3 片，以等邊三角形或三角形陣列，均勻排布于一未沾有任何消毒劑的清潔無菌玻璃板上（如無菌平皿內(nèi)）。消毒處理：每批試驗以同一濃度消毒劑溶液對上述排列的菌片進行均勻噴霧。每次噴

23、霧的距離和壓力保持一致，以盡量使噴到菌片上的霧粒大小和數(shù)量一致。噴霧量以不使菌片濕透、流液為度。中和與添食：待試驗菌片與消毒劑相互作用至各規(guī)定時間，取每種載體菌片 1 片，各放入一含 5.0ml 中和劑的無菌試管中。將試管用電動混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上細菌被洗脫進入中和液中。將中和后的混合液均勻地涂抹于直徑2cm的圓形桑葉背面，每片圓葉涂抹50ml混合液，每區(qū)（單元）50頭2齡起蠶，喂飼涂抹混合液的圓葉6片，重復(fù)3區(qū)（單元）。待蠶將以上涂抹混合液的桑葉食盡后，改喂普通無菌桑葉。消毒處理注意事項：每批試驗均應(yīng)換一塊未沾有任何消毒劑的清潔無菌玻璃板。噴霧器換裝新濃度消毒

24、劑前，應(yīng)將原殘留消毒劑洗凈，再換裝新濃度消毒劑。對照：用稀釋液代替消毒液，按同樣的噴霧方法進行處理，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。以不作任何處理的作為空白對照組。飼養(yǎng)管理、觀察與計量：根據(jù)各種蠶病潛伏期的長短，在2527下飼養(yǎng)觀察一定時間（一般核型多角體病5d，質(zhì)型多角體病10d，期間出現(xiàn)病死蠶應(yīng)及時調(diào)查確認），飼養(yǎng)過程中隨時觀察蠶體的生長發(fā)育情況，做好病蠶的隔離消毒工作，防止交叉感染。根據(jù)各種病的發(fā)病癥狀并結(jié)合顯微鏡進行逐條檢查，記錄發(fā)病蠶頭數(shù)。計算各組發(fā)病率，然后按下式計算滅活率：重復(fù)：試驗重復(fù) 3 次，計算平均滅活率。（4）煙熏定量殺滅試驗操作程序根據(jù)試驗設(shè)計，選定試驗病

25、毒與消毒劑的濃度和作用時間進行試驗。消毒容器與消毒處理：煙熏定量殺滅試驗在一個容積為1m3正方形的密閉箱子內(nèi)進行，箱子的每個內(nèi)壁都安裝有寬約20cm的平臺，分三層，供消毒時放置菌片用。如需要特定的溫度條件，試驗時箱子內(nèi)的溫度必須達到要求的溫度。每種病毒所染菌片應(yīng)分別在不同的箱子內(nèi)進行試驗。試驗時，每種載體菌片各取 12片，分上、中、下三層放置，每片菌片放置在一清潔無菌玻璃板上（如無菌平皿內(nèi)），每層4片菌片，分別放在不同的平臺上。每批試驗根據(jù)試驗設(shè)計或產(chǎn)品說明書的要求進行，如該產(chǎn)品注明必須利用煙霧進行消毒，要做到消毒時無明火，且藥劑發(fā)煙充分徹底。中和與添食：待試驗菌片與消毒劑相互作用至各規(guī)定時間

26、，打開箱子，分別從每層取載體菌片1片（共3片），一起放入一含 5.0ml 中和劑的無菌試管中。將試管用電動混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上病毒被洗脫進入中和液中。各管試驗病毒與消毒劑混合液經(jīng)加中和劑作用 10min 后，將中和后的混合液均勻地涂抹于直徑2cm的圓形桑葉背面，每片圓葉涂抹50ml混合液，每區(qū)（單元）50頭2齡起蠶，每區(qū)（單元）喂飼涂抹混合液的圓葉6片，每種處理設(shè)3個重復(fù)。對照：在相同的溫度下將菌片放置在不作消毒處理的箱子內(nèi)相同時間，進行平行試驗，作為感染不處理組（陰性對照組）。以不作任何處理的作為空白對照組。飼養(yǎng)管理、觀察與計量：待蠶將以上涂抹混合液的桑葉食盡

27、后，改喂普通無菌桑葉。根據(jù)各種蠶病潛伏期的長短，在2527下飼養(yǎng)觀察一定時間（一般核型多角體病5d，質(zhì)型多角體病10d，期間出現(xiàn)病死蠶應(yīng)及時調(diào)查確認），飼養(yǎng)過程中隨時觀察蠶體的生長發(fā)育情況，做好病蠶的隔離消毒工作，防止交叉感染。根據(jù)各種病的發(fā)病癥狀并結(jié)合顯微鏡進行逐條檢查，記錄發(fā)病蠶頭數(shù)。計算各組發(fā)病率，然后按下式計算滅活率：重復(fù)：試驗重復(fù)3次，計算平均滅活率。（5）評價規(guī)定病毒消毒試驗，可用于評價消毒劑對家蠶病毒的滅活效果。感染不處理組（陰性對照組）的發(fā)病率95.0%。3次試驗的平均滅活率99.0%，可判為對家蠶病毒消毒合格。（6）注意事項試驗操作時盡量使用移液器與無菌一次性吸頭。飼養(yǎng)觀察過

28、程中必須做好病蠶隔離消毒工作，防止二次感染。進行煙熏定量殺滅試驗時要密切觀察，防止明火產(chǎn)生，注意安全。4.微孢子蟲消毒試驗常用殺滅試驗方法有：懸液定量殺滅試驗、載體浸泡定量殺滅試驗、載體噴霧定量殺滅試驗、煙熏定量殺滅試驗等。根據(jù)測試目的選擇其中1種方法進行試驗，4種方法的操作程序同“3.病毒消毒試驗”。使用2齡起蠶進行試驗，消毒接種蠶體后飼養(yǎng)觀察時間為9d，饑餓1d。評價規(guī)定和注意事項同“3.病毒消毒試驗”。三、試驗報告為公正、科學(xué)地評價藥物消毒效果，對試驗報告內(nèi)容做如下要求：1.試驗?zāi)康摹?.試驗家蠶應(yīng)注明品種、齡期。3.試驗時間與地點。4.試驗設(shè)計者、負責(zé)人、參加者及電子郵箱。5. 對照藥

29、物需注明蠶藥名稱、生產(chǎn)廠家、規(guī)格、生產(chǎn)批號及用法與用量。受試藥物需注明蠶藥名稱、生產(chǎn)廠家、規(guī)格、生產(chǎn)日期及生產(chǎn)批號等。6.試驗數(shù)據(jù)，應(yīng)有詳細的試驗原始記錄。原始資料保存處、聯(lián)系人、電話。7. 用于消毒試驗的病原微生物需注明其來源、名稱、菌液制備方法、攻毒方法、劑量。8. 歸納總結(jié)藥物的消毒效果，確定受試藥物的用途、推薦劑量、給藥次數(shù)和給藥間隔等。9.試驗單位（加蓋公章）。附錄A 消毒試驗用試劑和培養(yǎng)基配方1.磷酸鹽緩沖液 （PBS，0.03mol/L，pH7.2）無水磷酸氫二鈉 2.83g磷酸二氫鉀 1.36g蒸餾水加至 1000ml將各成分加入到 1000ml 蒸餾水中，待完全溶解后，調(diào) p

30、H 至 7.27.4，于 121 壓力蒸氣滅菌 20min備用。2.有機干擾物 牛血清白蛋白 30g 蒸餾水 1000ml溶解后用微孔濾膜（孔徑為0.45m）濾過除菌，冰葙保存?zhèn)溆谩?.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 氯化鈉 5g 瓊脂 15g 蒸餾水 1000ml除瓊脂外其他成份溶解于蒸餾水中，調(diào) pH 至 7.27.4，加入瓊脂，加熱溶解，分裝，于121 壓力蒸汽滅菌 20min備用。4.營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 氯化鈉 5g 蒸餾水 1000ml將各成分溶解于蒸餾水中，調(diào) pH 至 7.27.4，分裝，于 121 壓力蒸汽滅菌 20min備用。5.稀釋液：胰

31、蛋白胨生理鹽水溶液（TPS）胰蛋白胨 1.0g氯化鈉 8.5g先用900ml以上蒸餾水溶解，并調(diào)節(jié)pH值在7.0±0.2，最終用蒸餾水加至1000ml，分裝后，經(jīng)121壓力蒸汽滅菌后使用。6.沙堡瓊脂培養(yǎng)基葡萄糖 40g 蛋白胨 10g 瓊脂 20g 蒸餾水 1000ml將上述成分混合后，加熱至完全溶解，調(diào)pH 至5.6±0.2，于 115壓力蒸汽滅菌 30min備用。7.沙堡液體培養(yǎng)基 葡萄糖 40g 蛋白胨 10g 蒸餾水 1000ml將上述成分混合后，加熱至完全溶解，調(diào)pH 至5.6±0.2，于 115壓力蒸汽滅菌 30min備用。附錄B 試驗菌、毒種的制備

32、、計數(shù)、保藏及試驗菌片的制備試驗菌、毒種有：蘇蕓金芽孢桿菌卒倒亞種（Bacillus thuringiensis subsp. sotto Ishiwata）芽孢、球孢白僵菌Beauveria bassiana （Bals.） Vuill. 和黃曲霉（Aspergillus flavus Link）、家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus, BmNPV）多角體病毒和家蠶質(zhì)型多角體病毒（Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis Virus, BmCPV）多角體病毒、家蠶微孢子蟲（Nosema bombyci

33、s Naegeli）孢子。1.細菌芽孢懸液的制備、計數(shù)及保藏（1）細菌芽孢懸液的制備凍干保藏的細菌芽孢：制備芽孢懸液時，開封凍干保藏的安瓿后，懸浮于少許營養(yǎng)肉湯中，吸出少量菌液接種營養(yǎng)肉湯，于37，培養(yǎng)24h；在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，37，培養(yǎng)24h，挑取典型菌落接種營養(yǎng)肉湯，37培養(yǎng)24h，吸取培養(yǎng)物接種羅氏瓶內(nèi)瓊脂表面，或中管瓊脂斜面表面，37培養(yǎng)5d7d，于室溫放置3d5d（亦可不放），取少許菌苔作芽孢染色，鏡檢。當(dāng)每個視野內(nèi)的芽孢數(shù)達9095%以上時，用無菌生理鹽水洗下菌苔（用L形玻璃棒刮），無菌過濾菌液，注入有玻璃球的無菌瓶中，用手充分振蕩， 3000r/min離心10min，如此

34、反復(fù)3次，將菌液懸浮于無菌生理鹽水中，制成適當(dāng)濃度的菌液，于45水浴24h，再80水浴10min，放置4冰箱保存?zhèn)溆谩?（2）活菌計數(shù)稀釋：先將菌液用比濁法或分光光度計測定法初步估測菌液含菌濃度，然后用培養(yǎng)基作10倍系列稀釋。接種：吸取0.1ml菌液于合適的固體培養(yǎng)基平皿內(nèi)。每個稀釋度接種3個平皿，接23個稀釋度。將平皿上菌液搖勻后，置37培養(yǎng)。計數(shù)：選每個平皿菌落數(shù)在30300個者計數(shù)（未稀釋的原液不足30者亦應(yīng)計數(shù)）。將計數(shù)結(jié)果換算成每毫升原液的菌落數(shù)，并計算該稀釋度的平均菌數(shù)。平板間或稀釋度間的誤差率超過10%應(yīng)重做。計數(shù)好的細菌芽孢懸液放置4冰箱保存，有效期為3個月。（3）細菌芽孢的保

35、藏細菌芽孢可用凍干保藏法和定期移植保藏法等方法進行保藏。凍干保藏法可保藏細菌芽孢10年。用定期移植法保藏細菌芽孢時，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上移植培養(yǎng)，移植次數(shù)不超過5次，移植培養(yǎng)好后放置于4冰箱內(nèi)保藏，每次保藏不超過6個月，移植次數(shù)超過5次時，必須在蠶體上進行接種復(fù)壯后才能繼續(xù)使用。2.白僵菌分生孢子懸液的制備、計數(shù)及保藏（1）繁殖與培養(yǎng)物獲取取定期移植保藏的菌種管，在無菌操作下打開，挑取少些分生孢子，接種于沙堡瓊脂斜面上，于 25 培養(yǎng) 5d7d， 即得到白僵菌分生孢子新鮮培養(yǎng)物。取新鮮培養(yǎng)的菌種管一支，用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml5.0ml 稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。

36、隨后，用 5.0ml 吸管將洗液移至另一無菌試管中，加入少量的橡皮顆粒（可用普通橡皮自制），用電動混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使分生孢子懸浮均勻。（2）剔除菌絲與其它雜物用濾過法除去菌絲。濾過后，顯微鏡下（400-640倍）觀察是否存在菌絲，若懸液中有菌絲存在，可經(jīng) 5000 r/min6000 r/min，離心 20min。再次在顯微鏡下觀察，若懸液中仍有菌絲存在，須再離心。懷疑有污染時，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭氏染色與生化試驗等法進行鑒定。（3）分生孢子液儲存白僵菌分生孢子懸液在4 儲存，當(dāng)天使用，不得過夜。（4）分生孢子液配制使用時，可用稀釋液適當(dāng)稀釋。懸液試驗時菌懸液的含菌量

37、為1×107 cfu/ml5×107 cfu/ml。菌懸液的含菌量按活菌計數(shù)的要求進行。（5）制備染菌樣片制備染菌樣片時染菌方法為滴染法，每片加菌懸液10l。染菌后，置室溫下自然陰干后再使用。（6）菌物回收回收菌數(shù)應(yīng)達5×105cfu/片5×106cfu/片，也可依試驗要求確定。（7）試驗菌種保存用定期移植法保藏白僵菌菌種。在沙堡瓊脂培養(yǎng)基上移植培養(yǎng)，移植次數(shù)不超過5次，移植培養(yǎng)好后放置于4冰箱內(nèi)保藏，每次保藏不超過3個月，移植次數(shù)超過5次時，必須在蠶體上進行接種復(fù)壯后才能繼續(xù)使用。3.黃曲霉分生孢子懸液的制備、計數(shù)及保藏（1）繁殖與培養(yǎng)物獲取取定期移植

38、保藏的菌種管，在無菌操作下打開，挑取少些分生孢子，接種于沙堡瓊脂斜面上，于 30 培養(yǎng) 5d7d， 即得到黃曲霉分生孢子新鮮培養(yǎng)物。取新鮮培養(yǎng)的菌種管一支，用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml5.0ml 稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用 5.0ml 吸管將洗液移至另一無菌試管中，加入少量的橡皮顆粒，用電動混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使分生孢子懸浮均勻。（2）剔除菌絲與其它雜物要求同2.（2）白僵菌。（3）分生孢子液儲存黃曲霉分生孢子懸液在4 儲存，儲存不能超過 2 d，使用前，混合均勻，在顯微鏡下觀察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，則棄之不用。（4）分生孢子

39、液配制要求同2.（4）白僵菌。（5）制備染菌樣片要求同2.（5）白僵菌。（6）菌物回收要求同2.（6）白僵菌。（7）試驗菌種保存要求同2.（7）白僵菌。4.家蠶核型多角體病毒多角體的制備、計數(shù)及保藏（1）家蠶核型多角體病毒多角體的制備將家蠶核型多角體病毒多角體用蒸餾水配成1×106個/ml濃度的多角體懸液涂抹在桑葉上，給4齡起蠶添食8h左右，接種病毒后的蠶用清潔桑葉在2425的溫度下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至5齡蠶充分發(fā)病時，用剪刀剪破病蠶的腹足和尾角，收集病蠶體液。收集的體液3000 r/min離心10min，離心后取沉淀物，將沉淀用生理鹽水充分懸浮，300r/min離心3min，取上清，反復(fù)差

40、速離心多次，直至基本無雜質(zhì)為止。將純凈的多角體用無菌生理鹽水懸浮，制成多角體懸液。（2）家蠶核型多角體病毒多角體的計數(shù)用血球計數(shù)板進行計數(shù)，計數(shù)好的懸液用無菌生理鹽水調(diào)成1×109個/ml的多角體懸液，置4冰箱內(nèi)備用。（3）家蠶核型多角體病毒多角體的保藏置4冰箱內(nèi)保藏，有效使用期為6個月。5.家蠶質(zhì)型多角體病毒多角體的制備、計數(shù)及保藏（1）家蠶質(zhì)型多角體病毒多角體的制備將家蠶質(zhì)型多角體病毒多角體用蒸餾水配成1×106個/ml濃度的多角體懸液涂抹在桑葉上，給2齡起蠶添食8h左右，接種病毒后的蠶用清潔桑葉在2527的溫度下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至齡蠶充分發(fā)病時，解剖病蠶，收集病蠶中腸。收集

41、的病蠶中腸先研磨，用紗布過濾，去除大的中腸組織碎片，然后以300 r/min、3 min 與3000 r/min、10 min進行差速離心，離心后去除沉淀物中上、下層的雜質(zhì)，反復(fù)離心多次，直至基本無雜質(zhì)為止。將純凈的多角體用無菌生理鹽水懸浮，制成多角體懸液。（2）家蠶質(zhì)型多角體病毒多角體的計數(shù)用血球計數(shù)板進行計數(shù)，計數(shù)好的懸液用無菌生理鹽水調(diào)成1×109個/ml的多角體懸液，置4冰箱內(nèi)備用。（3）家蠶質(zhì)型多角體病毒多角體的保藏置4冰箱內(nèi)保藏，有效使用期為6個月。6.家蠶微孢子蟲孢子的制備、計數(shù)和保藏（1）家蠶微孢子蟲孢子的制備將家蠶微孢子蟲孢子用生理鹽水配成1×1041&#

42、215;105個/ml濃度的孢子懸液涂抹在桑葉上，給2齡起蠶添食8h左右，接種孢子后的蠶用清潔桑葉在2527的溫度下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至蠶充分發(fā)病時，解剖病蠶，收集已病變的絲腺和中腸組織，或收集病蛾。收集的病蠶組織或病蛾先充分研磨，用紗布或其它濾網(wǎng)、裝置等過濾，去除組織碎片。然后以500 r/min、5 min 與3000 r/min、10 min進行差速離心，離心后去除沉淀物中上、下層的雜質(zhì)，反復(fù)差速離心多次，直至基本無雜質(zhì)為止。將純凈的孢子用無菌水懸浮，制成孢子懸液。（2）家蠶微孢子蟲孢子的計數(shù)用血球計數(shù)板進行計數(shù)，計數(shù)好的懸液用無菌水調(diào)成1×109個/ml的孢子懸液，置4冰箱內(nèi)備用。（3）家蠶微孢子蟲孢子的保藏置4冰箱內(nèi)保藏，有效使用期為6個月。7.試驗菌片的制備為了測定消毒劑或消毒方法對不同物品上微生物的殺滅作用，常用代表性的材料制備染菌樣片，比較常用的有布片、鋁片、玻璃片、紙片、竹片等。試驗前應(yīng)將材料制成0.5×1.0cm2或1×1cm2、1.5×1.5cm2的樣片，用洗衣粉煮沸后用自來水沖洗、晾干、經(jīng)高壓滅菌備用。常用的染菌方法有滴染、浸染和噴染三種。