產(chǎn)AmpC酶的克雷伯菌藥敏結(jié)果分析及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC和ESBLs耐藥基因檢測(cè)(1)

1、產(chǎn)AmpC酶的克雷伯菌藥敏結(jié)果分析及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC和ESBLs耐藥基因檢測(cè)(1)】 目的 了解克雷伯菌的耐藥性及產(chǎn)AmpC菌株同時(shí)產(chǎn)ESBLs藥敏的變化。方法 采用Vitek 60型和Vitek 32型、紙片擴(kuò)散法(KB法)測(cè)定42株產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs克雷伯菌的藥敏結(jié)果，并與24株產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs克雷伯菌和138株不產(chǎn)AmpC酶但產(chǎn)ESBLs的克雷伯菌藥敏結(jié)果對(duì)比分析；采用PCR分析產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的AmpC基因型。結(jié)果 產(chǎn)AmpC不管是否產(chǎn)ESBLs的克雷伯菌對(duì)亞胺培南敏感，對(duì)其他抗生素均有不同程度的耐藥；單純產(chǎn)ESBLs時(shí)，第四代頭孢菌素如

2、頭孢吡肟對(duì)其活性較好，但產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs時(shí)，令頭孢吡肟幾乎失去活性。肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs的20株菌中7株檢出blaDHA基因，占35%，1株檢出blaMIR基因，占5%。另外同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的20株肺炎克雷伯菌中100%檢出blaTEM基因，90%檢出blaCTXM1基因，100%檢出blaSHV基因，85%檢出blaDHA基因，15%檢出blaMIR基因，90%檢出不同的氨基糖苷類修飾酶基因。結(jié)論 克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶和同時(shí)產(chǎn)ESBLs的耐藥性比單純產(chǎn)AmpC酶的耐藥性更高、更顯著；肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶的主基因型為DHA，對(duì)同時(shí)存在26種不同類

3、型耐藥基因的克雷伯菌，碳青霉烯類藥物亞胺培南的體外活性最好。 【關(guān)鍵詞】 克雷伯菌 耐藥基因 AmpC ESBLsABSTRACT Objective To investigate the drug resistance of Klebsiella and the durg susceptibilitiy variation of ESBLs and AmpC simultaneouslyproducing stains. Methods The drug susceptibility of 42 AmpC and ESBLs producing Klebsiella were detecte

4、d by KirbyBauer motheds, Vitek 60 and Vitek 32 method. And the results were compared with those of 24 Klebsiella producing AmpC but nonproducing ESBLs and those of 138 Klebsiella producing ESBLs but nonproducing AmpC. The genotypes of AmpC were identified by PCR. Results All AmpCproducing Klebsiella

5、 were susceptible to imipenem and different degree of resistance to other tested antibiotics. The fourth generation of cephlosporin such as cefepime had potent activities to Klebsiella, but had little activity against Klebsiella simultaneouslyproducing AmpC and ESBLs. Of 20 strains of Klebsiella pro

6、ducing AmpC but nonproducing ESBLs, 7 strains were detected blaDHA gene and 1 strain with blaMIR gene; blaTEMgenes were amplified in 20 strains (100%), blaCTXM1 genes were detected in 18 strains (90%), blaSHV genes were examined in 2 strains (10%), blaDHA genes in 17 strains (85%), blaMIR genes in 3

7、 strains (15%) and three types of AMEsencoding genes were tested in 18 strains (90%). Conclusions The antimicrobial resisitant rates of Klebsiella simutaneoulyproducing AmpC and ESBLs are higher than that to Klebsiella producing AmpC but nonproducing ESBLs. The genotypes of Klebsiella producing AmpC

8、 are mainly DHA type. Imipenem is the first choice of the antibiotics against Klebsiella carrying 26 kinds of resistance genes in clinic.KEY WORDS Klebsiella; Resisitance gene; AmpC; ESBLsAmpC酶是由革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的能使包括第三代頭孢菌素在內(nèi)的許多內(nèi)酰胺酶類抗生素失活的頭孢菌素酶，既可由染色體介導(dǎo)，也可以由質(zhì)粒介導(dǎo)；產(chǎn)ESBLs酶是質(zhì)粒介導(dǎo)的能水解甲氧氨基內(nèi)酰胺抗生素如頭孢噻肟、頭孢他啶以及氨曲南的內(nèi)酰胺

9、酶，它的主類型是TEM類和SHV類，分別由blaTEM1、blaTEM2和blaSHV1基因發(fā)生單個(gè)點(diǎn)突變或多個(gè)點(diǎn)突變，導(dǎo)致1個(gè)或多個(gè)氨基酸改變而來(lái)1。自1983年德國(guó)首先發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌以來(lái)，臨床發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs的克雷伯菌越來(lái)越多，并且同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的克雷伯菌也時(shí)有報(bào)道，其耐藥機(jī)制比較復(fù)雜2。本文僅從克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的特性與藥敏結(jié)果的關(guān)系進(jìn)行研究，并進(jìn)一步對(duì)產(chǎn)AmpC酶的質(zhì)粒進(jìn)行基因型檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下。1 材料與方法1.1 材料(1)實(shí)驗(yàn)菌株 536株肺炎克雷伯菌、15株產(chǎn)酸克雷伯菌、3株臭鼻克雷伯菌共554株克雷伯菌分離于2000年1月至2005

10、年12月溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和臺(tái)州市立醫(yī)院的住院患者，其中來(lái)自痰液289株，尿液111株，膿液、創(chuàng)面液、分泌物、膽汁、血液、腹水、穿刺液等標(biāo)本共154株。經(jīng)Vitek60與Vitek32全自動(dòng)細(xì)菌分析儀鑒定。同一患者同類標(biāo)本多次分離到的菌株不重復(fù)計(jì)入。ESBLs檢測(cè)質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603由解放軍117醫(yī)院惠贈(zèng)；AmpC酶檢測(cè)質(zhì)控菌株陰溝腸桿菌029M和陰溝腸桿菌1194E由中國(guó)施貴寶公司惠贈(zèng)。作質(zhì)粒介導(dǎo)的供AmpC酶的基因檢測(cè)菌株有20株，為產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌。(2)儀器與試劑 Vitek60與Vitek32全自動(dòng)細(xì)菌分析儀，GNS506、GNS12

11、0藥敏檢測(cè)卡均為法國(guó)BioMerieux公司產(chǎn)品，藥敏紙片為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品，MH瓊脂為浙江杭州天和微生物公司產(chǎn)品。PCR基因擴(kuò)增試劑盒為無(wú)錫市克隆遺傳研究所產(chǎn)品，DNA Marker為Fermentas公司提供，瓊脂糖凝膠為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。1.2 方法(1)酶液提取 挑取血平板上過(guò)夜培養(yǎng)的數(shù)個(gè)菌落加入12ml胰胨肉湯，置于35恒溫?fù)u床上(200r/min)孵育46h，4 4000r/min離心25min。去沉淀物置-80反復(fù)凍融5次，1.5ml 0.01mol/L PBS(pH7.4)漩渦混勻，4 9000r/min離心1h，去上清液即為酶提取液。(2)ESBLs檢測(cè) 采用

12、酶提取物三維試驗(yàn)。根據(jù)ESBLs能水解第三代頭孢菌素，但不能被氯唑西林抑制的特點(diǎn)，參考文獻(xiàn)3操作，按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法操作，取相當(dāng)于1.5108CFU/ml的標(biāo)準(zhǔn)大腸埃希菌ATCC25922菌液，接種MH瓊脂平板，平板中心貼一片30g頭孢曲松(CRO)紙片，再距紙片中心5mm放射狀切四條狹縫，將40l的酶提取液加入狹縫內(nèi)，用36l酶提取液加上4l 2mol/L氯唑西林取代40l的酶提取液加入另一狹縫，余狹縫加陰性和陽(yáng)性對(duì)照，35孵育過(guò)夜，若狹縫與抑菌環(huán)交界處出現(xiàn)生長(zhǎng)區(qū)域，視為三維試驗(yàn)陽(yáng)性，即ESBLs陽(yáng)性。肺炎克雷伯菌ATCC700603為ESBLs陽(yáng)性對(duì)照，大腸埃希菌ATCC25922、陰溝腸桿

13、菌029M為ESBLs陰性對(duì)照。【摘】目的 了解克雷伯菌的耐藥性及產(chǎn)AmpC菌株同時(shí)產(chǎn)ESBLs藥敏的變化。方法 采用Vitek 6型和Vitek 32型、紙 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。(3)AmpC酶檢測(cè) 按參考文獻(xiàn)3操作，將1.5108CFU/ml的大腸埃希菌ATCC25922菌液密涂于MH瓊脂平板，稍干后在平板中心貼一片30g的頭孢西丁紙片。用無(wú)菌刀片在離紙片5mm處放射狀的切一條狹縫，用微量加樣器加樣品25l酶提取液加入狹縫內(nèi)，

14、避免酶液溢出狹縫，待酶液稍干后置于35孵育箱內(nèi)過(guò)夜。若在狹縫與抑菌環(huán)的交界處出現(xiàn)擴(kuò)大的長(zhǎng)菌區(qū)域，判為三維試驗(yàn)陽(yáng)性，即AmpC酶陽(yáng)性。(4)藥敏試驗(yàn) Vitek60型和Vitek32型全自動(dòng)細(xì)菌分析儀及KB瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)細(xì)菌的藥敏結(jié)果，嚴(yán)格按照求操作，并參考CLSI/NCCLS(2004年)標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。(5)基因檢測(cè)質(zhì)粒AmpC酶基因檢測(cè) 每反應(yīng)體系P1、P2引物各0.5l，Taq DNA酶1U，dNTP、擴(kuò)增緩沖液、Mg2 等按常規(guī)PCR配比加入，總反應(yīng)體積20l，其中模板5l。擴(kuò)增參數(shù)：93預(yù)變性2min，93變性30s，55褪火30s，72延伸60

15、s，循環(huán)35個(gè)周期，最后一個(gè)循環(huán)72延長(zhǎng)至5min。PCR產(chǎn)物檢測(cè)經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(已加入溴化乙錠)，出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照分子相當(dāng)?shù)臈l帶，并與DNA Marker相比較分析，陽(yáng)性對(duì)照DHA為DHA1型陰溝腸桿菌。MIR為MIR型陰溝腸桿菌，純水為陰性對(duì)照。AmpC酶基因PCR擴(kuò)增使用引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增 PCR引物序列見(jiàn)表2。與ESBLs有關(guān)的基因blaCTXM1群引物能擴(kuò)增CTXM1、3、6、7、10、TOHO1群編碼基因，blaCTXM2群引物能擴(kuò)增CTXM2、4、5群編碼基因，blaCTXM3群引物能擴(kuò)增CTXM 8、9群編碼基因。擴(kuò)增體系為每反應(yīng)系P1、P2引物各0.5mol，

16、KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 2mmol/L，MgCl2 2mmol/L，TrisHCl (pH9.8) 10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%，Taq DNA聚合酶1U?？偡磻?yīng)體表1 AmpC酶基因PCR擴(kuò)增引物表2 ESBLs、AMEs酶基因PCR引物序列積為20l，其中模板液5l。與氨基糖苷類修飾酶(AMEs)有關(guān)的基因引物aac(3)II、aac(6)I、ant(3)I與質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC有關(guān)的基因引物blaDHA、blaMIR引物的擴(kuò)增參數(shù)：93預(yù)變性2min，93變性30s，55退火30s，72延伸60s，35個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)72延長(zhǎng)至5min。與

17、ESBLs有關(guān)的基因blaTEM、blaCTXM1群、blaCTXM2群、blaCTXM1群、blaSHV、blaPER引物擴(kuò)增參數(shù)為：93預(yù)變性2min，93變性60s，55退火60s，72延伸60s，35個(gè)循環(huán)，延伸5min。PCR產(chǎn)物檢測(cè)經(jīng)1.5%2%瓊脂糖凝膠電泳(已加入溴化乙錠)，出現(xiàn)于陽(yáng)性對(duì)照分子相當(dāng)?shù)臈l帶，并與DNA Marker相比較分析，純水為陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照CTXM1群為CTXM3型大腸埃希菌，CTXM2群為CTXM5型大腸埃希菌，CTXM3群為CTXM9型大腸埃希菌，SHV為SHV2型大腸埃希菌，PER為PER1型銅綠假單胞菌，DHA為DHA1型陰溝腸桿菌。MIR為MI

18、R陰溝腸桿菌，aac(6)I為鮑曼不動(dòng)桿菌(AY536033)，aac(3)II為肺炎克雷伯菌(AY553610)，ant(3)I為鮑曼不動(dòng)桿菌(AY551438)4。(6)藥敏結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0作2檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 克雷伯菌分類及產(chǎn)AmpC酶產(chǎn)ESBLs情況554株克雷伯菌中肺炎克雷伯菌占96.75%，產(chǎn)酸克雷伯菌占2.71%，臭鼻克雷伯菌占0.54%；產(chǎn)AmpC酶66株，陽(yáng)性率為11.91%；產(chǎn)ESBLs 180株，陽(yáng)性率為32.49%，其中既產(chǎn)AmpC又產(chǎn)ESBLs的有42株，陽(yáng)性率為7.58%。2.2 產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)或不產(chǎn)ESBLs菌株的藥敏(1)產(chǎn)AmpC酶同

19、時(shí)產(chǎn)ESBLs菌株的藥敏結(jié)果與產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs菌株的藥敏結(jié)果見(jiàn)表3。(2)產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs的藥敏結(jié)果與不產(chǎn)AmpC酶但產(chǎn)ESBLs的藥敏結(jié)果見(jiàn)表4。2.3 基因型(1)肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs 20株檢測(cè)到產(chǎn)物長(zhǎng)度為405bp的blaDHA基因有7株，檢出率35%(7/20)，檢測(cè)到產(chǎn)物長(zhǎng)度為302bp的blaMIR基因有1株，檢測(cè)率5%(1/20)；未檢測(cè)到其它基因。它們的表型與AmpC基因型見(jiàn)表5。(2)肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs 20株菌內(nèi)酰胺類藥物的耐藥表型和基因型檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。(3)肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs 20

20、株菌的AMEs基因型分型見(jiàn)表7。3 討論(1)AmpC酶和ESBLs是介導(dǎo)革蘭陰性桿菌耐藥的最主兩種酶，它們均能水解第三代頭孢菌素，但兩者又有重區(qū)別，ESBLs可被內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制，不被氯唑西林抑制，且大部分產(chǎn)ESBLs菌對(duì)頭孢西丁敏感；AmpC酶則不被內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制，可被氯唑西林抑制，產(chǎn)酶株對(duì)頭孢西丁耐藥，因此準(zhǔn)確檢測(cè)和區(qū)分這兩類酶對(duì)臨床選擇用藥有重意義5。 表3 克雷伯菌產(chǎn)AmpC同時(shí)產(chǎn)ESBLs與產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs的藥敏結(jié)果比較表4 肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs株與不產(chǎn)AmpC酶但產(chǎn)ESBLs株的藥敏結(jié)果比較近年來(lái)由于質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的出現(xiàn)6，導(dǎo)致耐藥性

21、的廣泛傳播。質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶是1988年由美國(guó)發(fā)現(xiàn)，它與染色體介導(dǎo)的AmpC酶不同，可以高水平持續(xù)表達(dá)，可通過(guò)轉(zhuǎn)化、接合等方式轉(zhuǎn)移給其它細(xì)菌而造成耐藥性的廣泛傳播。除DHA1型外，大多數(shù)質(zhì)粒型AmpC酶是不可誘導(dǎo)的4，7。(2)對(duì)于頭孢菌素來(lái)說(shuō)，由于產(chǎn)AmpC酶和不產(chǎn)ESBLs陰性的菌株均能水解第三代頭孢菌素(如表3所示)，其耐藥率都很高(65%72%)，而產(chǎn)AmpC酶表6 肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs對(duì)內(nèi)酰胺類藥物的耐藥表型和基因型檢測(cè)結(jié)果表7肺炎克雷伯菌產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs20株菌的AMEs基因型分型同時(shí)產(chǎn)ESBLs的菌株耐藥性更高(幾乎達(dá)100%)；對(duì)AmpC酶穩(wěn)

22、定的頭孢吡肟8在單純產(chǎn)AmpC酶的菌株中耐藥率達(dá)54.2%，在雙重產(chǎn)酶株中其耐藥率達(dá)85.7%。從表3可以看出，產(chǎn)AmpC酶同時(shí)產(chǎn)ESBLs菌株的藥敏結(jié)果，除第一代頭孢菌素(如頭孢唑林)無(wú)差異外，其它耐藥率明顯高于單純產(chǎn)AmpC酶的菌株，兩者有極顯著性的差異。從表4可以看出，當(dāng)單純產(chǎn)ESBLs時(shí)，頭孢吡肟有較好的活性，但當(dāng)產(chǎn)AmpC同時(shí)產(chǎn)ESBLs時(shí)，頭孢吡肟幾乎失去活性。頭孢唑林也類似，但頭孢曲松、頭孢他啶卻100%耐藥。(3)從表3還可以看出，AmpC酶幾乎不能被含有克拉維酸的酶抑制劑所抑制，但含有三唑巴坦和舒巴坦的酶抑制劑對(duì)AmpC酶有一定的抑制作用，這與文獻(xiàn)9，10報(bào)道的結(jié)果一致；對(duì)氨

23、基糖苷類來(lái)說(shuō)，阿米卡星、慶大霉素對(duì)雙重產(chǎn)酶株與單純產(chǎn)AmpC酶菌株的藥敏結(jié)果無(wú)差異，而妥布霉素卻有顯著差異。妥布霉素對(duì)雙重產(chǎn)酶株有一定的抑菌作用，但對(duì)單純產(chǎn)AmpC酶菌株效果不佳；對(duì)喹諾酮類藥物左氧氟沙星、環(huán)丙沙星來(lái)說(shuō)，雙重產(chǎn)酶株的藥敏結(jié)果比單純產(chǎn)AmpC酶菌株效果還好，兩者有顯著性差異，其中原因需進(jìn)一步研究?！菊磕康?了解克雷伯菌的耐藥性及產(chǎn)AmpC菌株同時(shí)產(chǎn)ESBLs藥敏的變化。方法 采用Vitek 6型和Vitek 32型、紙 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯

24、您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。(4)對(duì)于碳青霉烯類亞胺培南，不管是否產(chǎn)AmpC酶還是產(chǎn)ESBLs酶，它的耐藥率總為0，所以說(shuō)碳青霉烯類是治療產(chǎn)AmpC酶和ESBLs的克雷伯菌的首選藥物，并且是最好的藥物；對(duì)頭霉素藥物頭孢替坦等，雖然它們的耐藥率也很低，但由于它們有很強(qiáng)的誘導(dǎo)DHA型質(zhì)粒AmpC酶的作用，臨床也很少選用。(5)對(duì)產(chǎn)AmpC酶但不產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌的ampC基因檢測(cè)的結(jié)果來(lái)看，blaDHA基因是肺炎克雷伯菌的產(chǎn)AmpC酶的主基因。對(duì)20株產(chǎn)AmpC酶和同時(shí)產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測(cè)，75%菌株同時(shí)檢測(cè)到ESBLs基因型TEM、CTXM1及AmpC基因型DHA；20株

25、菌中100%菌株檢測(cè)到基因型TEM，10%菌株檢測(cè)到ESBLs基因型SHV、DHA，90%檢測(cè)到CTXM1，15%檢測(cè)到MIR，提示在浙江的溫州和臺(tái)州地區(qū)存在基因型TEM、CTXM1 ESBLs和DHA基因型AmpC流行?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Dubois S K, Marriott M S, Amyes S G. TEMandSHVderived extendedspectrumbetalactamases: Relationship between selection, structure and function J. J Antimicrob Chemother,1995,35:72 王林峰

26、，王選錠. 肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展J. 中國(guó)抗生素雜志，2004，29(6)：3243 Coudron P E, Moland E S, Thomson K S. Occurrence and detection of AmpC betalactamase among Escherichia coli, Klebsiella pnemoniae, and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center J. J Clin Microbiol,2000,38:19714 Bradford P A, Urban C, Mariano N, et al