雙色熒光原位雜交檢測c-erbB-2基因擴(kuò)增及應(yīng)用

1、    雙色熒光原位雜交檢測c-erbB-2基因擴(kuò)增及應(yīng)用        c-erbB-2(HER-2/neu)癌基因編碼一種跨膜酪氨酸激酶受體蛋白，該蛋白與表皮生長因子受體家族有廣泛的同源性。有研究表明，c-erbB-2蛋白與某些實體腫瘤細(xì)胞間的信號傳遞有關(guān)。c-erbB-2基因的過度表達(dá)可影響細(xì)胞受體的激酶活性，從而影響或改變細(xì)胞的生長、增殖特性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，c-erbB-2原癌基因的過度擴(kuò)增或蛋白異常表達(dá)與乳腺癌、胃癌等實體瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，而且具有c-er

2、bB-2基因過度表達(dá)的乳腺癌可對一種人源化的重組抗c-erbB-2抗體(Herceptin)有較好的治療反應(yīng)1，2。因此，c-erbB-2基因過度表達(dá)的確定，不僅可作為判斷腫瘤病人預(yù)后、估計病情病期的重要參數(shù)，而且對于指導(dǎo)治療有十分重要價值。我們采用雙色熒光原位雜交(dual-colors fluorescence in situ hybridization)技術(shù)檢測胃癌病理切片中c-erbB-2基因擴(kuò)增，以了解c-erbB-2基因在這類腫瘤中是否擴(kuò)增及其發(fā)生率，并對該基因診斷的價值進(jìn)行初步評價。一、材料與方法1.病理切片來源及一般資料：（1）胃癌病理切片20份，來自我院病理科，均為手術(shù)或活檢

3、標(biāo)本，甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片；病理形態(tài)學(xué)類型包括腺癌16例(級)，印戒細(xì)胞癌4例。（2）一般資料：20例胃癌患者，男11例，女9例，年齡范圍2567歲，平均年齡43.5歲。乳腺癌組織病理切片(c-erbB-2：CEP 17號染色體陽性)來自美國南加州大學(xué)病理科，用作陽性對照。2雙色FISH檢測c-erbB-2基因擴(kuò)增：（1） 檢測試劑：PathVysionTMHER-2 DNA探針盒購自美國Vysis公司，該探針盒內(nèi)含LSI HER-2 spectrum orange(含低拷貝E. Coli載體數(shù))/ CEP 17 Spectrum Green DNA探針(E.Coli質(zhì)粒)，其中Sp

4、ectrum Green熒光標(biāo)志的-衛(wèi)星DNA探針作為17號染色體標(biāo)志；Spectrum Orange熒光標(biāo)志的DNA探針作為c-erbB-2基因位點標(biāo)志。NP-40蛋白酶由試劑盒提供，DAPI反染色液，20×SSC由本室配制。（2） 熒光顯微鏡系Olympus BX-50型，DAPI/FITC/TXRD三波段濾鏡由Chroma Technology公司特制。（3）熒光原位雜交大致程序：病理切片預(yù)處理，依次用二甲苯脫蠟，100%乙醇脫水、干片；拷片；然后用蛋白酶消化，洗滌，干片；熒光原位雜交程序：樣本DNA變性；探針預(yù)處理；雜交：每片加10 l探針混合液到腫瘤細(xì)胞靶區(qū)域(HE染色閱片

5、證實，大約20 mm×20 mm范圍)，加塑料蓋玻片，37孵育過夜；雜交后洗滌，加10 l/片DAPI反染色液，熒光顯微鏡下計數(shù)熒光信號。（4）靶信號計數(shù)及結(jié)果判定：根據(jù)試劑盒提供的雙色信號計數(shù)指導(dǎo)，使用1 000×油鏡，計數(shù)每個細(xì)胞核內(nèi)的綠色及桔紅色熒光點，選擇胞核不相互重疊，熒光信號不相互重疊的區(qū)域進(jìn)行計數(shù)。每片計數(shù)20個間期細(xì)胞核的熒光信號，算出“紅色信號綠色信號”比率的均值，以c-erbB-2:CEP17信號比率2.0判定為c-erbB-2基因擴(kuò)增。二、結(jié)果1.c-erbB-2基因擴(kuò)增陽性的乳腺癌病理切片F(xiàn)ISH結(jié)果：來自c-erbB-2基因擴(kuò)增的乳腺癌病理切片陽性

6、對照結(jié)果顯示，該例存在c-erbB-2基因的過度表達(dá)。c-erbB-2:CEP17=3.51，c-erbB-2基因拷貝信號呈“叢集”趨勢，而17號染色體標(biāo)志信號在細(xì)胞核中表現(xiàn)為2個綠色熒光點（1）。證明該實驗體系工作。2.胃癌組織c-erbB-2基因的表達(dá)：20份胃癌病理切片，c-erbB-2:CEP17比值有16份<2.0，其平均比值為1.2；4份比值>2.0，平均比值為4.40，提示有c-erbB-2基因擴(kuò)增，c-erbB-2基因過度表達(dá)在本組胃癌病例的發(fā)生率為20%。值得注意的是4例 c-erbB-2基因擴(kuò)增的胃癌均為腺癌級，平均年齡也偏大( 53.0歲)，而4例印戒細(xì)胞癌，

7、無1例出現(xiàn)c-erbB-2基因擴(kuò)增。2顯示c-erbB-2基因擴(kuò)增陰性的胃癌病理切片F(xiàn)ISH結(jié)果。三、討論c-erbB-2是酪氨酸激酶超家族內(nèi)皮生長因子受體（EGFR）家族中的成員，該激酶是細(xì)胞通過激酶級聯(lián)傳遞信號途徑中的重要環(huán)節(jié)，參與細(xì)胞生長及分裂的調(diào)節(jié)。c-erbB-2基因定位于染色體17q1221.3，編碼的蛋白系HER2/P185 erbB2。HER2/neu基因的過度表達(dá)主要見于乳腺癌、下頜癌、胃癌細(xì)胞株MNK-7等，它通常與腫瘤分級及預(yù)后相關(guān)。Brien等3用FISH技術(shù)分析61例胃腺癌病理切片中的c-erbB-2基因表達(dá)，并與其他分析指標(biāo)（包括cyclin A, cyclin B

8、1, P34cdc2, P120, 增殖細(xì)胞核抗原）等進(jìn)行比較。結(jié)果表明，43%的胃腺癌存在c-erbB-2基因擴(kuò)增，并與胃癌的病理學(xué)分級及患者的生存期呈相關(guān)。Ishikawa等4報道用FISH技術(shù)檢測胃腺癌組織c-erbB-2基因，105份標(biāo)本中有19份表現(xiàn)出高水平的c-erbB-2基因擴(kuò)增(陽性率為18.1%)，其中15例表現(xiàn)出癌基因熒光信號成簇分布。本組20例胃癌病例，4例表現(xiàn)有c-erbB-2基因擴(kuò)增，發(fā)生率為20%；而僅從胃腺癌角度考慮，其發(fā)生率為25%，與Ishikawa等4報道的結(jié)果相似。值得注意的是，4例胃印戒細(xì)胞癌，無1例有c-erbB-2基因過度表達(dá)，這是偶然現(xiàn)象或是必然事

9、件，有待擴(kuò)大樣本量才能結(jié)論，而4例c-erbB-2過度表達(dá)的胃癌，病理分級均為級，患者平均年齡偏大(范圍3867歲，平均53歲)，提示c-erbB-2基因擴(kuò)增與胃癌病理分級相關(guān)。 1雙色FISH檢測乳腺癌組織切片c-erbB-2基因擴(kuò)增（陽性對照），綠點代表CEP17，紅點為c-erbB-2基因雙色熒光原位雜交×1 0002示1例胃腺癌病理切片：雙色FISH檢測c-erbB-2基因，c-erbB-2:CEP17比值在1.0左右，表示不存在c-erbB-2基因擴(kuò)增雙色熒光原位雜交×1 000我們的結(jié)果表明，用FISH技術(shù)可以較準(zhǔn)確地反映c-erbB-2基因過度表達(dá)與否，并能分

10、析間期細(xì)胞c-erbB-2基因的拷貝數(shù)，結(jié)果直觀、可靠。新近，美國已經(jīng)將一種針對c-erbB-2基因產(chǎn)品的重組基因工程產(chǎn)品Herceptin用于具有c-erbB-2過度表達(dá)的乳腺癌患者，取得較好的臨床效果5。對于具有c-erbB-2過度表達(dá)的其他實體瘤（如胃癌、涎腺癌等），也有使用Herceptin的指征。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測實體瘤組織c-erbB-2基因擴(kuò)增與否，不僅幫助揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理，而且對于Herceptin治療適應(yīng)征的選擇，具有實際的導(dǎo)向意義?；痦椖浚好绹腥A醫(yī)學(xué)基金會資金資助項目(99-698)作者單位：張廣森（湖南醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院分子血液病研究室4100

11、11 長沙）肖樂（湖南醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院分子血液病研究室410011 長沙）陳永恒（湖南醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院分子血液病研究室410011 長沙）周見遠(yuǎn)（美國南加州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系）張新民（湖南醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科）參考文獻(xiàn)1，Mizutani T, Onda M, Tokunaga A, et al. Relationship of c-erbB-2 protein expression and gene amplification to invasion and metastasis in human gastric cancer. Cancer, 1993,72:2083-2088

12、.2，Ross JS, Fletcher JA. The HER-2/neu oncogene in breast cancer: prognostic factor, predictive factor, and target for therapy. Stem Cells, 1998,16:413-428.3，Brien TP, Depowski PL, Sheehan CE, et al. Prognostic factors in gastric cancer. Mod Pathol, 1998,11:870-877.4，Ishikawa T, Kobayashi M, Mai M, et al. Amplification of the c-erbB-2 (c-erbB-2) gene in gastric cancer cells. Detection by fluorescence in situ hybridization. Am J Pathol, 1997,151:761-768.5，Pegram MD, Lipton A, Hayes DF, et al. Phase study of receptor-enhanced chemosensitivity using recombinant humanized ant