免疫親和層析凈化高效液相色譜法測(cè)定醬油醋中黃曲霉毒素B_1

1、儀器與應(yīng)用免疫親和層析凈化高效液相色譜法測(cè)定醬油醋中黃曲霉毒素B1王晶1張鵬2張藝兵2王雄3(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心北京1000131(青島出入境檢驗(yàn)檢疫局2660022(北京中檢維康技術(shù)有限公司1000443E2mail:jing wang20318摘要試樣經(jīng)過(guò)甲醇2水提取,提取液經(jīng)過(guò)濾、水稀釋、用鍵合有黃曲霉毒素B1特殊抗體的免疫親和柱凈化,通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定黃曲霉毒素B1。免疫親和層析凈化高效液相色譜柱后衍生法,測(cè)定醬油和醋中黃曲霉毒素B1的檢出限為1g/kg;添加回收率在80%上。該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速、安全。關(guān)鍵詞免疫親和層析;高效液相色譜;黃曲霉毒素B1;醬油;醋中圖分類號(hào)R15

2、Determination of A flatoxin B1in Soy and Vinegar by ImmunoaffinityColumn and H igh Performance Liquid ChromatographyWang Jing1,Zhang Peng2,Zhang Y ibing2,Wang X iong3(National Research Center for Certified Reference M aterials,Beijing,100013,China1(QingDao Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau

3、,Qingdao,266002,China2(Beijing Clover T echnology Ltd.,Beijing,100044,China3AbstractA fter being extracted with CH3OH2H2O,the sam ple extract was filtered,diluted with water and applied to affinity column containing m onoclonal specific antibody for aflatoxin B1.A flatoxin B1in soy and vinegar were

4、quanti2 tated by HP LC with fluorescence detection and postcolumn.The detection lim its of A flatoxin B1reached1g/kg.The rates of recovery were m ore than80%by this method.This method was accurate,sim ple,rapid and safet.K ey w ordsimmunoaffinity column;HP LC;aflatoxin B1;soy;vinegar黃曲霉毒素是從所周知的最危險(xiǎn)的毒

5、素之一,黃曲霉毒素是曲霉菌及曲霉寄生菌族類產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似的有毒化合物。在合適的溫度、濕度條件下,這類真菌會(huì)在各種食品或糧谷類作物中生長(zhǎng),并產(chǎn)生毒素。1993年,黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WH O的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物。由于黃曲霉毒素與環(huán)境因素密切相關(guān),是一種天然的毒素,普通的食物處理方法不會(huì)減少黃曲霉毒素的含量,因此國(guó)際上對(duì)黃曲霉毒素的限量要求也日益嚴(yán)格。國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局、國(guó)家衛(wèi)生部從2000年加大力度監(jiān)督抽查大米、小麥、植物油、醬油、食醋等五大類糧油食品,其中黃曲霉毒素B1是一項(xiàng)重要的指標(biāo)。我國(guó)規(guī)定發(fā)酵食品(醬油、食用醋黃曲霉毒素B1限量小于等于5g/kg。控制這類由真菌

6、污染而形成的真菌毒素的最佳方法是防止食品受污染或食入已污染的食品,快速、有效的檢驗(yàn)方法是檢測(cè)食品中是否受黃曲霉毒素污染的最有效手段。通過(guò)檢驗(yàn)食品中的黃曲霉毒素含量,以保證生產(chǎn)的食品安全、無(wú)毒。目前我國(guó)傳統(tǒng)黃曲霉毒素分析一般采用薄層色譜(T LC法、高效液相色譜(HP LC法1,2。T LC雖然簡(jiǎn)便,但靈敏度差;HP LC雖然靈敏度高,但樣品前處理煩瑣,操作復(fù)雜,時(shí)間長(zhǎng)。特別對(duì)我國(guó)特有的醬油和醋調(diào)味品,傳統(tǒng)方法不是很適用。免疫親和柱(Immunoaffinity C olumn,I AC的使用不僅比T LC法和酶聯(lián)免疫吸附法準(zhǔn)確,還可以避免傳統(tǒng)T LC和HP LC的缺點(diǎn),同時(shí)免疫親和柱與T LC

7、和HP LC法結(jié)合可以大大提高工作效率,提高靈敏度和收稿日期:2002-07-28作者簡(jiǎn)介:王晶,1968年生,高級(jí)工程師,博士,畢業(yè)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),一直從事食品安全技術(shù)研究工作。55現(xiàn)代科學(xué)儀器20032準(zhǔn)確度,達(dá)到既定量準(zhǔn)確又快速簡(jiǎn)便的要求3,4。免疫親和層析凈化與T LC和HP LC法用在測(cè)定醬油和醋中卻不多見(jiàn),還沒(méi)有報(bào)道免疫親和層析凈化高效液相色譜法對(duì)醬油和醋中黃曲霉毒素的測(cè)定。根據(jù)國(guó)內(nèi)需求,本文主要介紹免疫親和層析凈化高效液相色譜法(I AC/HP LC法測(cè)定醬油和醋中黃曲霉毒素B1。1理論部分試樣經(jīng)過(guò)甲醇水提取,提取液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、稀釋后,濾液經(jīng)過(guò)交聯(lián)在免疫親和層析介子上有黃曲霉毒素特

8、殊抗體的免疫親和柱凈化,此抗體對(duì)黃曲霉毒素B1具有專一識(shí)別能力,黃曲霉毒素鍵合在分離柱中的抗體上。用蒸餾水將免疫親和柱上雜質(zhì)除去,以甲醇通過(guò)分離柱洗脫,于HP LC柱后衍生化后測(cè)定試樣甲醇洗脫液黃曲霉毒素B1。2實(shí)驗(yàn)部分2.1試劑除特殊說(shuō)明外,試劑為分析純,水為重蒸餾水。甲醇:色譜純乙腈:色譜純苯2乙腈(98+2氯化鈉(NaClpH7磷酸鹽緩沖溶液0.1%吐溫/P BS溶液黃曲霉毒素B1:純度99%(美國(guó)sigma公司黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液:用苯2乙腈(98+2溶液配制0.100mg/m L的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)貯備液,保存于4備用。黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液:根據(jù)需要準(zhǔn)確移取適量的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)

9、貯備液,用苯2乙腈(98+2溶液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液。柱后衍生溶液(0.05%碘溶液:稱取0.1g碘溶液,溶解于20m L甲醇后,加水定容至200m L,以0. 45m的尼龍濾膜過(guò)濾,4避光保存。2.2主要儀器高速均質(zhì)器(美國(guó)Vicam公司玻璃纖維濾紙直徑11cm,孔徑1.5m(美國(guó)Vicam 公司免疫親和柱(美國(guó)Vicam公司:內(nèi)含單株抗體對(duì)黃曲霉毒素B1具有專一性?？諝鈮毫Ρ?美國(guó)Vicam公司玻璃試管(12mm×75mm,無(wú)熒光特性玻璃注射器HP1100型高效液相色譜(具有365nm激發(fā)波長(zhǎng)和大于420nm發(fā)射波長(zhǎng)的熒光檢測(cè)器微量注射器C18色譜柱2.3樣品提取方法2.3.1醬油稱

10、取試樣25.0g于250m L具塞錐形瓶中,加入2.5g氯化鈉及100m L甲醇2水(8+2,以均質(zhì)器高速攪拌提取1min。定量濾紙過(guò)濾,準(zhǔn)確移取10.0m L濾液并加入40.0m L水稀釋,用玻璃纖維濾紙過(guò)濾1次,至濾液澄清,備用。2.3.2食醋稱取5.0g樣品,加入1.0g氯化鈉,以pH7磷酸鹽緩沖溶液稀釋至25m L,混勻,過(guò)濾。取10m L濾液加入10m L緩沖液,混勻。以玻璃纖維濾紙過(guò)濾1次,至濾液澄清,備用。2.4凈化方法將免疫親和柱連接于20m L玻璃注射器下。準(zhǔn)確 移取10m L樣品濾液過(guò)免疫親和柱,用10m L0.1%的吐溫/P BS清洗。再以10m L水清洗柱子2次,棄去全

11、部流出液,并使23m L空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入1.0m L液相色譜級(jí)甲醇洗脫,流速為12m L/min,收集洗脫液于玻璃試管中,供檢測(cè)用。2.5測(cè)定方法于高效液相色譜儀測(cè)定樣品甲醇洗脫液中黃曲霉毒素B1。2.5.1測(cè)定條件C18色譜柱:150×4.6mm,5m。流動(dòng)相:甲醇:水(45:55,用前脫氣。流動(dòng)相流速:0.8ml/mim。熒光檢測(cè)器:激發(fā)波長(zhǎng)365nm,發(fā)射波長(zhǎng)440nm。柱后衍生化系統(tǒng):衍生溶液:0.05%碘溶液,衍生溶液流速:0.2m L/mim,反應(yīng)溫度:70,反應(yīng)時(shí)間:1min。2.5.2樣液測(cè)定取黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液100L注入HP LC系統(tǒng)中,得到標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(圖

12、1。圖1黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)譜圖取樣品洗脫液1m L加入超純凈水定容至2m L,取100L注入HP LC系統(tǒng)中,得到樣品色譜圖。經(jīng)過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)液譜圖比較得到黃曲霉毒素B1濃度。65M odern Scientific Instruments200323結(jié)果與討論3.1方法線性關(guān)系和檢出限在此色譜條件下,免疫親和層析凈化高效液相色譜法測(cè)定黃曲霉毒素B1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性方程相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999以上,黃曲霉毒素B1的保留時(shí)間為6.7(圖1。在上述分析條件下,免疫親和層析凈化高效液相色譜法測(cè)定醬油和醋中的黃曲霉毒素B1的檢出限為1g/kg。此測(cè)定方法的檢出限達(dá)到我國(guó)黃曲霉毒素B1限量檢測(cè)要求,而且遠(yuǎn)低

13、于我國(guó)黃曲霉毒素B1限量標(biāo)準(zhǔn)要求。3.2準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)表1免疫親和層析凈化高效液相色譜法測(cè)定醬油和醋中黃曲霉毒素B1的回收率和精密度樣品添加濃度(g/kg實(shí)側(cè)值(g/kg回收率(% 變異系數(shù)CV(%醬油1.00.8888.48.422.0 1.8090.13.72 5.04.2585.0 4.40醋1.00.8282.4 3.772.0 1.6683.04.015.0 4.2284.8 3.26分別對(duì)醬油和醋進(jìn)行3個(gè)水平濃度添加回收率試驗(yàn),重復(fù)操作7次,回收率試驗(yàn)平均值和變異系數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。免疫親和層析凈化高效液相色譜法回收率在80%以上,對(duì)醬油的添加回收率在85.0%90. 1%,變異系

14、數(shù)為3.72%8.42%,對(duì)醋的添加回收率在82.4%84.8%,變異系數(shù)為3.26%3.77%。圖2為醬油和醋中黃曲霉毒素B1添加濃度為1g/kg的色譜圖。圖2醬油和醋中黃曲霉毒素B1譜圖參考文獻(xiàn)1中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)G B/T5009.2321996.食品中黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2的測(cè)定方法.1111132中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)G B/T5009.2221996.食品中黃曲霉毒素B1的測(cè)定方法,1021073M ary W.T rucksess,M ichael E.S tack,S tanley Nesheim,Samuel W.Page etal.Immunoa2ffinit

15、y C olumn C oupled with S olution Fluorometry or Liquid Chromatography P ostcolumn Derivatization for Determination of A flatoxins in C orn.Peanuts.and Peanut Butter:C ollaborative S tudy.J.ASS OC.OFF.ANA L.CHE M.1991.74(1:81884AOAC O fficial M ethod991.31.A flatoxins in C orn,Raw Peanuts,andPeanut

16、Butter.AOAC official M ethods of Analysis.Supplement M arch 1995.2021關(guān)于舉辦“第九屆國(guó)際電分析化學(xué)研討會(huì)”的通知“第九屆國(guó)際電分析化學(xué)研討會(huì)”經(jīng)中國(guó)科學(xué)院批準(zhǔn),并受中國(guó)化學(xué)會(huì)委托,由中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)化所電分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室舉辦。研討會(huì)將于2003年10月10日至12日在長(zhǎng)春應(yīng)化所舉辦。研討會(huì)將特邀40多名國(guó)際著名電分析化學(xué)家參加,會(huì)議主要語(yǔ)言為英語(yǔ)。欲參加研討會(huì)的同志(如提出報(bào)告,請(qǐng)交英文摘要一份,格式要求見(jiàn)網(wǎng)頁(yè)http:w w 0431-*,電子郵件:blzhang聯(lián)系,隨后寄上第二輪通知(注冊(cè)費(fèi)480元。國(guó)際顧問(wèn)委員會(huì)M.Aizawa(日,F.C.Ans on(美,A.J.Bard(美,G.Bidan (法,A.M.Bond(澳,G.Christian(美,S.C onsnier(法,A. Deronzier(法,S.D ong(中,主席M.Fujihira(日,H.G irault(瑞士,Lo G orton(瑞典,R.G uilard(法,W.R.Hein