增生性瘢痕中TGF-β和膠原酶、TIMP-1mRNA表達(dá)的定量研究

1、    增生性瘢痕中TGF-和膠原酶、TIMP-1 mRNA 表達(dá)的定量研究        【摘要】目的觀察TGF-和膠原酶、TIMP-1 mRNA在增生性瘢痕中的表達(dá)，探討TGF- 對MMP-1和TIMP-1表達(dá)的影響以及它們在HTS形成中的作用。方法采用原位雜交和像分析技術(shù)，進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果增生性瘢痕組織中TGF-和TIMP-1表達(dá)較正常皮膚明顯增高，平 均積分光密度分別增加了8倍和7倍，也較膠原酶的表達(dá)明顯增高，相差非常顯著，TGF- 表達(dá)與

2、TIMP-1表達(dá)呈高度正相關(guān)。結(jié)論TGF-可能促進(jìn)TIMP-1表達(dá)，抑制膠原酶活性，阻止膠原降解， 是HTS形成的重要原因。【關(guān)鍵詞】瘢痕轉(zhuǎn)化生長因子膠原酶金屬蛋白酶組織抑制 因子 Quantitative study on the expression of mRNA for TGF- and collagenase (MMP-1),tissue metalloproteinase inhibitor-1(TIMP-1) in hypertro phic scarWU Jixiang?CHEN DeyingWU Zongyao（Department of Phys ical Medi cin

3、e and rehabilitation,Southwest Hospital, The Third Military Medical Unviersity,Chongqing 400038,PR China）【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of mRNA f or TGF-,MMP-1 and TIMP-1 and their effects on the formation of hypertrophic scar (HTS). MethodsIn situ hybridization and image analysis

4、w ere used in this study. ResultsThe expressions of mRNA for TGF- and TIMP-1 in HTS was greatly increased compared with those of normal skin. The average integral o ptical density of mRNA for TGF- and TIMP-1 increased by 8 and 7 folds (P <0.001) related to normal skin and the expression of them s

5、howed highly positive correlation.ConclusionsThe findings suggest that TGF- prom o tes the expression of TIMP-1 and may be a possible factor for hypertrophic scar formation.【Key words】Scar; Transforming growth factor- beta; Collagenase; Tissue metalloproteinase inhibitor-1增生性瘢痕(hypertrophic scar,HTS

6、)是創(chuàng)傷愈合過程中膠原合成與降解平衡失調(diào)，膠 原過度沉積的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)理至今仍不清楚1。目前HTS中膠原合成的研究報(bào) 道很多，而膠原降解的研究極少2。膠原酶(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)是膠原降解的關(guān)鍵酶，在啟動(dòng)體內(nèi)膠原降解中具有重要作用，其表達(dá)和活性受許多因素 的調(diào)控，如生長因子和金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase -1,TIMP-1)3。TGF-是重要的生長因子，已有研究表明在HTS組織中TGF- 基因表達(dá)和蛋白均明顯增高，與HTS的形成密切相關(guān)4。為此我們應(yīng)用原位雜交和 像分析等方法觀

7、察了TGF-和MMP-1、TIMP-1在HTS組織中的表達(dá)，以探討TGF-對MM P-1和TIMP-1表達(dá)的影響及它們在HTS形成中的作用。1材料與方法1.1標(biāo)本HTS標(biāo)本24例，其中男性16例，女性8例，年齡1044歲。標(biāo)本均為燒傷后半年 至2年的增生性瘢痕(瘢痕呈粉紅或紫紅色，高出皮面，質(zhì)較硬，在病理切片上表皮呈明顯的 多形性，真皮中含大量呈渦輪狀或結(jié)節(jié)狀的膠原纖維)，取自整形手術(shù)。正常皮膚(normal s kin,NS)6例取自外科手術(shù)。取材后立即置入液氮保存。1.2主要材料MMP-1和TIMP-1質(zhì)粒由日本Kanazawa大學(xué)S.Sato惠贈(zèng)，MMP-1探針長度 分別為1.5KB和0

8、.6KB。TGF-質(zhì)粒由美國Chicago大學(xué)Howard Hugher Medical Institut e的 GI.Bell惠贈(zèng)，探針長度為1.8KB。地高辛配基標(biāo)記檢測試劑盒購自寶靈曼公司，EcoRI、Ba mHI、蛋白酶K、丙烯酰胺購自華美生物公司，I型膠原購自Sigma公司，其余試劑均為國產(chǎn)分 析純。1.3方法1.3.1制備探針按常規(guī)將3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109并擴(kuò)增，堿裂解法大量抽提質(zhì)粒 ，透析袋電泳洗脫法制備質(zhì)粒探針，按藥盒說明書用地高辛隨機(jī)引物法標(biāo)記探針，標(biāo)記探針 置-20備用。1.3.2原位雜交方法所有標(biāo)本均做冰凍切片，片厚20um，用4%多聚甲醛固定30min，PBS漂

9、洗10min ×2，蛋白酶K ( 100 g/ml)37消化30min，PBS和2×SSC各漂洗10min，入雜交液45雜交24h。雜交后依 次 用4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC和PBS各漂洗10min，再進(jìn)行地高辛堿性磷酸 酶顯色反應(yīng)。陽性雜交信號(hào)為藍(lán)紫色。陰性對照(雜交液中不含探針)無色。1.3.3像半定量分析和統(tǒng)計(jì)處理采用CMIAS真彩色像分析系統(tǒng)(空軍總醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所產(chǎn)品)，檢測HTS和NS原位雜 交切片，在20倍放大下隨機(jī)選取4個(gè)測定區(qū)域，按一定閾值分割陽性細(xì)胞，測定HTS和NS組織 中TGF-和

10、MMP-1、TIMP-1mRNA表達(dá)的平均積分光密度和面密度值，所得資料用t檢 驗(yàn)和相關(guān)分析做統(tǒng)計(jì)處理。2結(jié)果2.1MMP-1、TIMP-1和TGF- mRNA的原位雜交在HTS組織中TGF- mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，強(qiáng)陽性顆粒成群分布于膠原結(jié)節(jié)中，由呈渦輪狀 或結(jié)節(jié)狀的膠原纖維排列而成，陽性細(xì)胞主要為成纖維細(xì)胞(1)，TIMP-1表達(dá)明顯增加， 陽性顆粒主要見于膠原結(jié)節(jié)，陽性細(xì)胞多數(shù)為成纖維細(xì)胞(2)。MMP-1 mRNA在HTS中也有 表達(dá)，散在分布于真皮中(3)。NS中TGF-和TIMP-1 mRNA表達(dá)弱而少，偶見有少數(shù)表 達(dá)呈弱陽性的成纖維細(xì)胞散在分布于真皮(4，5)，而MMP-1 m

11、RNA表達(dá)陽性細(xì)胞主要為汗 腺上皮細(xì)胞(6)。陰性對照切片中未見陽性顆粒。1(上)HTS組織TGF-原 位雜交陽性顆粒分布于膠原結(jié)節(jié)(下)HTS組織TGF-雜交陽性的成纖維細(xì)胞2(上)HTS組織TIMP-1雜交陽性顆 粒主要見于膠原結(jié)節(jié)(下)TIMP-1陽性的成纖維細(xì)胞Fig 1(Up)Strong expression of mRNA for TGF- confined to the collagen nodules in HTS tissues (Down)HTS fibroblasts s howed strong TGF- expressionFig 2(Up)Strong expre

12、ssion of mRNA for TIMP-1 was observed in collagen nodules in HTS tissues (Down)The fibroblasts s howed TIMP-1 expression in HTS3HTS中MMP-1陽性顆粒散在分布于真布中Fig.3The positive particles of MMP-1 were seen in dermis of HTS4NS中MMP-1陽性顆粒散在分布于真布中Fig.3The positive particles of MMP-1 scattered in  dermis of N

13、S5NS中TIMP-1弱陽性顆粒少，散在分布于真皮中Fig.5Few of light positive particles of TIMP-1 were observed in NS6NS中MMP-1雜交陽性顆粒見于汗腺上皮細(xì)胞Fig.6The positive particles of MMP-1 were observed in epithelial cells of sweat gland2.2MMP-1、TIMP-1和TGF-表達(dá)的半定量分析HTS組織中MMP-1面密度和平均積分光密度(average integral optical density,AIOD)較NS 略有增加(P&

14、gt;0.05)。TIMP-1和TGF-面密度和AIOD較NS明顯增高(P<0.01)。HT S中TGF-和TIMP面密度和AIOD明顯高于MMP-1，TIMP-1表達(dá)和TGF-表達(dá)，并呈顯著的 正相關(guān)(r=0.967,P<0.01)。結(jié)果見表1。表1HTS和NS組織MMP-1、TGF-與TIMP-1 表達(dá)的像分析結(jié)果Tab 1The results of quantitative analysi s of expressionof MMP-1、TGF- and TIMP-1 in HTS and NS tissues測定指標(biāo)面密度AIODHTSNSHTSNSMMP-11.50&#

15、177;0.571.25±0.50151±3687±15TIMP9.40±0.92*1.30±0.951098±78*155±23TGF-9.75±0.35*1.67±0.091313±110*151±36與NS比較：P<0.01；與MMP-1比較：*P<0.01。 3討論原位雜交方法可以對基因活化表達(dá)的mRNA進(jìn)行原位定性、定位和定量分析。我們用特異性 TGF-和MMP-1、TIMP-1探針進(jìn)行了HTS組織的原位雜交。結(jié)果表明三者在HTS組織中均有 表達(dá)，陽性顆粒主要分布

16、于膠原結(jié)節(jié)區(qū)，提示結(jié)節(jié)區(qū)是膠原代謝紊亂的主要區(qū)域，這與許多 組化及形態(tài)學(xué)的研究結(jié)果一致1。我們首次原位觀察了HTS中MMP-1、TIMP-1的 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TIMP-1表達(dá)顯著增高，AIOD是NS的7倍(P<0.01)，也明顯高于MMP-1的表 達(dá) ，提示TIMP-1的異常表達(dá)可能與HTS形成密切相關(guān)。許多研究認(rèn)為TIMP按1：1與MMP-1形成 復(fù)合體，抑制酶的活性，在調(diào)控膠原降解中具有重要的作用3。Bullun5 報(bào)道慢性不愈合傷口組織液中TIMP-1含量明顯降低，而在由射線誘導(dǎo)的皮膚纖維化病中T IMP-1表達(dá)顯著增加，表明TIMP是影響膠原降解的重要因素6。TGF-是具有多種生物學(xué)

17、功能的蛋白多肽物質(zhì)，在創(chuàng)傷愈合的所有階段均發(fā)揮了重要的作 用7。Robert等8發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)面基質(zhì)中含有豐富的TGF-，它促進(jìn)成纖 維細(xì)胞合成和分泌膠原等ECM分子，加速創(chuàng)面的愈合，但它的過度作用則可能誘導(dǎo)瘢痕的形 成。我們的研究結(jié)果顯示TGF-在HTS組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，AIOD是NS的12倍(P<0.01 )，也 顯著高于HTS中MMP-1的表達(dá)(8倍，P<0.01)，提示TGF-的異常表達(dá)在HTS的形成中 具 有重要的作用。TGF-在HTS形成中的作用已有了一些研究，但多限于其對膠原表達(dá)和合成 的調(diào)控。有學(xué)者報(bào)道TGF-上調(diào)、型膠原基因的表達(dá)，促進(jìn)膠原合成，是HTS膠原合成 異常

18、增加，膠原大量沉積的重要原因4。目前對TGF-影響HTS膠原降解的研究 較少2。Overall9在培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞 中加入TGF-后發(fā)現(xiàn)膠原酶表達(dá)明顯降低，而TIMP-1表達(dá)和活性增高。我們同時(shí)觀察了 TGF-、MMP-1和TIMP-1在HTS中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TGF-和TIMP-1表達(dá)較MMP-1表達(dá)明顯 增高，相差非常顯著；TGF-和TIMP-1表達(dá)呈高度正相關(guān)。結(jié)果提示TGF-促進(jìn)TIMP-1 表達(dá)，抑制MMP-1活性，阻止膠原降解，可能是HTS形成的重要原因。作者單位：武繼祥（重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院康復(fù)理療科400038）吳宗耀（重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院康復(fù)理療科400038）陳

19、德英（第三軍醫(yī) 大學(xué)組織胚胎教研室）參考文獻(xiàn)1，Murray JC. Keloids and hypertrophic scar. Clin Dermatol,1994,12:27-3 7.2，Younai S,Nichter LS,Wellisz T, et al.Modulation of collagen synthesis by transforming growth factor- in keloid and hypertrophic scar fibroblasts. Ann Plast Surg,1994,33:148-154.3，Woessner JF. Matrix meta

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