氣相色譜_質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物組織中的β_2_興奮劑含量

1、第34卷第3期2005年5月衛(wèi)生研究JOURNA L OF HYGIE NE RESE ARCH V ol. 34N o. 3May 2005365文章編號(hào):100028020(2005 0320365202實(shí)驗(yàn)研究氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物組織中的22興奮劑含量吳平谷虞曉珍浙江省疾病預(yù)防控制中心理化所, 杭州310009摘要:應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜(G C 2MS 聯(lián)用技術(shù)建立動(dòng)物組織中22興奮劑的測(cè)定方法。動(dòng)物組織加1%的高氯酸溶液勻漿, 用乙酸乙酯:異丙醇(64 萃取, 經(jīng)固相萃取柱凈化, BSTFA +1%TMCS 衍生后進(jìn)行G C 2MS 測(cè)定。樣品中最低檢出濃度分別為特布他林015g k

2、g 、克倫特羅110g kg 、沙丁胺醇012g kg 。關(guān)鍵詞:動(dòng)物組織22興奮劑氣相色譜-質(zhì)譜法中圖分類(lèi)號(hào):TS20715R155155文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A基金項(xiàng)目:浙江省衛(wèi)生廳2002年優(yōu)秀青年人才專(zhuān)項(xiàng)基金資助檢測(cè)22興方法E LIS A 、HP LC 、HP LC 2MS 、LC 2MS 、G C 2MS 幾種方法14,E LIS A 用于樣品中22興奮劑篩選, 不能確定何種22興奮劑, 且試劑盒對(duì)不同22興奮劑響應(yīng)值相差很大;HP LC 2MS 儀器價(jià)格貴; G C 2MS 靈敏度、分辨率高, 常用于興奮劑殘留的測(cè)定。本研究采用G C 2MS 方法對(duì)常見(jiàn)且有代表性的沙丁胺醇(Salbuta

3、m ol 、克倫特羅(Clenbuterol 、特布他林(T erbutaline 22興奮劑進(jìn)行檢測(cè), 對(duì)動(dòng)物組織中三種22劑進(jìn)行同時(shí)提取、凈化, 然后用G C 2MS 進(jìn)行研究, 從而建立動(dòng)物組織中2臺(tái), 現(xiàn)報(bào)告如下。1111儀器與試劑11111儀器6890G C 25973MS 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(惠普 ;RE 252AA K 2D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮 ; K Q2200超聲清洗器(昆山 ;T 25basic 高速組織搗碎機(jī)。11112試劑硫酸沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、硫酸特布他林(S igma 公司 , 甲醇、乙酸乙酯、異丙醇、高氯酸、氫氧化鈉、甲苯、無(wú)水硫酸鈉等均為分析純;BSTF

4、A +1%TMCS:迪馬公司;C LE 2S LX 、C LE 2硅膠、C LE 2胺基、C LE 2酸性氧化鋁等凈化柱:500mg 5ml 杭州市富?？萍挤?wù)有限公司。標(biāo)準(zhǔn)試劑110mg ml 貯備液:分別稱(chēng)量1211mg 硫酸沙丁胺醇,1113mg 鹽酸克倫特羅,1212mg 硫酸特布他林, 用1%氨化乙醇溶解并定容至10ml , 置于4冰箱備用。三種22興奮劑混合應(yīng)用液(015g ml 按實(shí)驗(yàn)濃度要求取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, 進(jìn)行混合, 用乙醇稀釋, 稀釋液在4冰箱中可放置1個(gè)月。112操作步驟11211色譜條件色譜柱:HP25MS 5%苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱(30m ×0

5、125mm ×0125m ; 進(jìn)樣口溫度:300; 柱溫程序:初溫150, 保持3min , 然后以10min 升至240, 保持1min , 再以20min 升至280, 保持3min ; 載氣:高純氦氣(991999% , 流速110ml min , 不分流進(jìn)樣11212質(zhì)譜條件EI 源, 源溫230; 電子能量70eV ; 接口溫度280, 電子倍增器電壓1388V , 質(zhì)譜掃描范圍50550amu ;溶劑延遲:8min。113樣品處理稱(chēng)取510g 經(jīng)過(guò)絞碎樣品, 加130ml , 在高速15min , 在5000r , , 50%氫氧化鈉, 加, 離心, 有機(jī)相移入磨, 合并

6、有機(jī)相, 通過(guò)無(wú)水硫酸, 。先用3ml 乙腈與3ml 正己烷溶, 混勻后分出正己烷相, 乙腈相蒸干后用3%乙醇乙酸乙酯溶解定容至2ml 。取Cle 2S LX 柱先用5ml 3%乙醇乙酸乙酯淋洗, 然后加1ml 樣品提取液, 加5ml 5%甲醇乙酸乙酯淋洗收集得組分1, 然后用10ml 50%甲醇乙酸乙酯淋洗液收集得組分2, 洗脫液分別用氮?dú)獯蹈伞＜?00l BSTFA +1%T MCS , 在60下衍生30min , 氮?dú)獯蹈? 加200l 甲苯溶解離心, 取110l 進(jìn)行G C MS 分析。2結(jié)果與討論211三種22興奮劑衍生物色質(zhì)譜特征特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)硅烷化衍生后的總離

7、子流圖見(jiàn)附圖, 衍生物的質(zhì)譜特征見(jiàn)表1。圖1三種22興奮劑標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的總離子流色譜圖表1三種22興奮劑標(biāo)準(zhǔn)品的色質(zhì)譜特征興奮劑分子量羥基數(shù)保留時(shí)間(min 衍生物分子離子峰特征離子(SIM 離子特布他林22531013044186、356(1 克倫特羅27611017034886、262(1 、243沙丁胺醇23921110745586、369(1注:(1 定量離子由附圖可知, 三種22興奮劑標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)硅烷化后的衍生物 可以采用G C MS 法測(cè)定, 可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求, 且靈敏度高。按表1選擇相應(yīng)的離子進(jìn)行離子選擇監(jiān)測(cè)方式, 可以大大降低檢出限, 進(jìn)一步提高靈敏度。分別選擇離子碎片262、36

8、9、356為克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林的定量離子,86(m z 為叔丁基類(lèi)22興奮劑特征離子碎片, 而且響應(yīng)較大, 將86作為三種22興奮劑的輔助定量離子。按照上述色質(zhì)條件, 在501000ng ml 濃度范圍內(nèi)對(duì)三種22興奮劑測(cè)定結(jié)果, 濃度與響應(yīng)值關(guān)系見(jiàn)表2。表2三種22興奮劑測(cè)定濃度與響應(yīng)值線(xiàn)性特征興奮劑名稱(chēng)50ng ml 100ng ml 250ng ml 500ng ml 1000ng ml 回歸曲線(xiàn)r 值特布他林8822158353779994113165787Y =168186X +30414101996克倫特羅6658138473140078761135381Y =13810

9、3X +75815401995沙丁胺醇80661780644224109148207889Y =213125X -361001998212pH 對(duì)三種22興奮劑萃取效率的影響22興奮劑根據(jù)苯環(huán)取代基結(jié)構(gòu)分為苯胺型如克倫特羅、苯酚型如沙丁胺醇和間苯二酚型如特布他林, 它們分子結(jié)構(gòu)中都有氨基和羥基, 具有酸堿兩性, 因此采用液液萃取時(shí),pH 值對(duì)樣品中不同22興奮劑的提取效率影響較大。由表3可知, 當(dāng)pH10時(shí), 特布他林和克倫特羅溶劑提取最高, 而沙丁胺醇在pH11時(shí)最高, 在實(shí)際樣品檢測(cè)中采用pH10進(jìn)行樣品提取。213不同溶劑對(duì)三種22興奮劑萃取效率的效果特布他林、沙丁胺醇、克倫特羅結(jié)構(gòu)中含

10、羥基極性較大, 本文選擇不同的溶劑對(duì)三種22驗(yàn)研究, 結(jié)果見(jiàn)表4。表3pH 對(duì)于三種2興奮劑名稱(chēng)pH12pH13特布他林6310167188313(1 191915160克倫特羅791213751510210(1891782148613沙丁胺醇861157128518831389145(1 58125516由表3可知, 以上各種溶劑對(duì)克倫特羅的提取均較好, 但對(duì)極性較大的特布他林、沙丁胺醇, 只有叔丁基甲醚異丙醇(51 、乙酸乙酯異丙醇(64 這兩種溶劑提取效率較好。本方法選擇乙酸乙酯異丙醇(64 進(jìn)行22興奮劑多殘留分析, 由于乙酸乙酯異丙醇(64 混合溶劑極性大, 提取物雜質(zhì)含量也相對(duì)較高

11、, 本研究采用固相凈化柱進(jìn)一步凈化。表4不同溶劑對(duì)三種22興奮劑萃取效率的效果溶劑名稱(chēng)乙醚乙酸乙酯乙腈叔丁基甲醚叔丁基甲醚異丙醇(51 乙酸乙酯異丙醇(64特布他林004511511594179511克倫特羅9712951096129811102179817沙丁胺醇3517441767178914214固相萃取凈化柱的選擇用于22興奮劑凈化的固相萃取柱有正相(如硅藻土、C8、硅膠、氧化鋁、S LX 等 凈化柱、反相(如C18 凈化柱、強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱和弱陽(yáng)離子交換柱等。作者在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)反相凈化柱或離子交換凈化柱對(duì)克倫特羅效果普遍較好, 但特布他林、沙丁胺醇回收率低, 且雜質(zhì)干擾大,

12、因此本研究采用正相凈化柱。從除雜及過(guò)柱回收率等方面比較C LE 2S LX 、C LE 2硅膠、C LE 2酸性氧化鋁、C LE 2胺基4種SPE 凈化柱, 選擇C LE 2S LX 型SPE 凈化柱作為22興奮劑多殘留分析凈化柱, 具體步驟見(jiàn)樣品處理部分。由于苯胺型22興奮劑如克倫特羅和苯酚型22興奮劑沙丁胺醇、特布他林極性相差較大, 前者容易洗脫且在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程, 有雜質(zhì)對(duì)沙丁胺醇進(jìn)行干擾, 該雜質(zhì)與克倫特羅在組分1, 對(duì)組分2中沙丁胺醇沒(méi)有干擾, 樣品溶劑提取物經(jīng)過(guò)C LE 2S LX , 可以較好的達(dá)到凈化目的, 且過(guò)柱回收率均在85。215, 10g kg 、30kg 22興奮劑

13、, 其回收率特布1786%、9010%, 沙丁胺醇72%、1; 準(zhǔn)偏差特布他林819%、819%, 克倫特羅9%、311%, 沙丁胺醇619%、510%。方法的回收率及精密度均可以滿(mǎn)足樣品測(cè)定要求, 且特布他林、沙丁胺醇的回收率均較好, 最低檢出濃度按照樣品測(cè)定噪音2倍計(jì),3種22興奮劑最低檢出濃度分別為特布他林015g kg 、克倫特羅110g kg 、沙丁胺醇012g kg 。216實(shí)際樣品測(cè)定采用本方法, 對(duì)送檢的54份組織進(jìn)行3種22興奮劑殘留檢測(cè), 克倫特羅檢出5份, 沙丁胺醇1份。3結(jié)論克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林在pH10下, 用乙酸乙酯異丙醇(64 提取, 然后用C LE 2S

14、 LX 固相萃取柱凈化, 分組分1、組分2洗脫, 克倫特羅在組分1、沙丁胺醇、特布他林在組分2。然后用BSTFA +1%TMCS 衍生后進(jìn)行G C 2MS 測(cè)定。樣品中最低檢出濃度分別為特布他林015g kg 、克倫特羅110g kg 、沙丁胺醇012g kg 。4參考文獻(xiàn)1S tevens on D. Review immuno 2affinity s olid extraction. J Chromet B ,2000,745:392482G uy PA , M arie 2Claude. Quantitative analysis of clenbuterol in meat products using liquid chromatography 2electrospray ionization tandem mass spectrometry. J Chromat B , 1999,736:20922