正己烷致大鼠脂質(zhì)過氧化及肝細胞DNA損傷的實驗研究(1)

1、    正己烷致大鼠脂質(zhì)過氧化及肝細胞DNA損傷的實驗研究(1)    】 目的 研究正己烷(nhexane)對大鼠的脂質(zhì)過氧化作用和肝細胞DNA損傷的影響。方法 40只雄性SD大鼠隨機分成5組，即陰性對照組、75、150、300mg/kg染毒組和陽性對照組，每組8只。經(jīng)腹腔注射染毒4周后，檢測肝組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)的活力，血清還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量；用彗星試驗技術(shù)(SCGE)檢測大鼠肝細胞DNA的損傷。 結(jié)果 大鼠體重隨染毒時間而增加，陰性對

2、照組增加最快；隨染毒劑量增加，肝組織勻漿中SOD、GSHPx活力、血清GSH含量明顯降低，而血清MDA含量增大，組間比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；肝細胞SCGE檢測彗星尾長、尾DNA(%)、尾矩、Olive尾矩均增大，組間比較有顯著性差異(P<0.01)，尾矩值與染毒劑量作相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)r為0.981，呈正相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論 正己烷可引起或增強機體氧自由基反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷和肝細胞DNA損傷。 【關(guān)鍵詞】 正己烷；脂質(zhì)過氧化；DNA損傷；單細胞凝膠電泳技術(shù)正己烷(nhexane，CAS:110543)屬于直鏈飽和脂肪烴類，化學式為C

3、6H14，分子式為CH3(CH2)4CH3，分子量86.18；無色、高揮發(fā)性、易燃、常溫下為微有異臭的液體；幾乎不溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇12。正己烷主作為溶劑，廣泛應(yīng)用于制鞋、印刷、電子、粘膠配制、除污、干洗、植物油提取等行業(yè)3。有文獻表明45：正己烷對神經(jīng)細胞脂質(zhì)有極化作用，導(dǎo)致膜擴張，通透性增強。動物吸入正己烷后，血中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、葡萄糖6磷酸脫氫酶、酸性脫氫酶、尿苷酸化酶活性增高。這些內(nèi)酶的外逸，間接說明正己烷具有膜損傷作用。沈齊英等6對大鼠靜式急性吸入染毒，測定了MDA、GSH、SOD和GSHPx等體現(xiàn)脂質(zhì)過氧化損傷的特異性

4、指標。結(jié)果表明，正己烷的急性吸入導(dǎo)致機體氧化還原系統(tǒng)的變化，削弱了機體消除自由基的能力，發(fā)生了脂質(zhì)過氧化損傷。正己烷引起機體氧化還原系統(tǒng)的改變，導(dǎo)致自由基水平升高，是否會進一步引起DNA損傷，目前尚未見有報道。故本實驗用不同劑量的正己烷染毒大鼠，對其脂質(zhì)過氧化和DNA損傷進行檢測。旨在觀察正己烷對大鼠的脂質(zhì)過氧化及DNA損傷的影響，為探討正己烷的遺傳毒性和中毒機制提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動物 健康雄性SpragueDawley(SD)大鼠40只，體重180-220g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進行染毒實驗。1.1.2 試劑 正己

5、烷(國產(chǎn)分析純)，環(huán)磷酰胺(上海華聯(lián)制藥有限公司)，Triton X100(Gibco公司，美國)，戊巴比妥鈉、低熔點瓊脂糖(low melting agarose gel, LMA)、正常熔點瓊脂糖(normal melting agarose gel, NMA)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、乙二胺四乙酸二鈉鹽(Na2ethylenediamine, Na2EDTA)、溴化乙錠(ethidium bromide, EB)均為美國Sigma公司產(chǎn)品。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathio

6、ne peroxidase, GSHPx)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone, GSH)測試盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。1.1.3 儀器 DYY水平電泳槽 ，DYY 33A電泳儀 ，NIKON熒光顯微鏡型及NIKON AFXA型拍攝裝置 ，恒溫水浴箱，DY89型電動玻璃組織勻漿器，CASP圖像分析軟件。1.2 方法1.2.1 動物分組及染毒 將40只雄性SD大鼠隨機分為5組，即陰性對照組、低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組和陽性對照組(環(huán)磷酰胺)，每組8只，采用腹腔注射染毒5。陰性對照組僅用注

7、射針穿刺腹腔，不注射任何試劑，低、中、高暴露組染毒劑量分別為75、150、300mg/kg，陽性對照組為50mg/kg，每日上午染毒1次，每周5d，連續(xù)4周。染毒過程中，所有大鼠均自由飲水、進食。每3d稱體重1次，調(diào)整染毒劑量，記錄大鼠的一般狀況和體重變化。1.2.2 單細胞凝膠電泳試驗 參照Singh等7方法略加改進。主步驟有：單細胞懸液的制備。染毒結(jié)束后，用質(zhì)量濃度為20g/L(2%)的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，剖開腹部，立即取出一5nm×5nm肝臟組織，裝于盛有4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)的小燒杯中，洗去血液，然后加入RPMI 1

8、640培養(yǎng)液，用眼科剪剪碎，制成單細胞懸液。 膠板的制備。將預(yù)熱50 100L質(zhì)量分數(shù)為0.6%的NMA滴加到無水乙醇浸泡的磨砂載玻片上，迅速蓋上干凈的蓋玻片，室溫下靜置10min使其凝固，為第1層凝膠；取10L大鼠肝細胞懸液加入37 80L質(zhì)量分數(shù)為0.5%的LMA中，混勻后迅速滴加到第1層膠上，立即蓋上干凈的載玻片，室溫下靜置10min使其凝固，為第2層膠；最后在第2層膠上滴加預(yù)熱37的質(zhì)量分數(shù)為0.5%的LMA,蓋上蓋玻片，室溫下使其凝固。細胞裂解。移去蓋玻片，將載玻片浸入新配制的細胞裂解液(2.5mol/L NaCl，100nmol/L Na2EDTA，10nmol/L Tris，10

9、g/L肌氨酸鈉，臨用前加體積分數(shù)為1%的TritonX100，10% DMSO，pH10)中，于4冰箱中裂解1h。堿解旋。從裂解液中取出載玻片，用PBS沖洗2次，洗去過多的鹽，晾干后置于水平電泳槽中，將新配制的電泳緩沖液(1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH，pH=13，4預(yù)冷)倒入電泳槽中，液面約覆過膠面0.25cm左右，避光靜置25min，以便使DNA在堿性條件下解螺旋成單鏈DNA，使DNA斷片在電泳場中易于遷移。電泳。電壓為25V，電流300mA，4環(huán)境下電泳20min。中和與染色。電泳結(jié)束后，取出載玻片，吸水紙吸干電泳緩沖液，用0.4mol/L的TrisHCl(

10、pH7.5)中和15min，然后每片載玻片上滴加30mg/L的EB水溶液50L，蓋上蓋玻片，染色20min，即可觀察。閱片。24h內(nèi)在熒光顯微鏡下觀察，數(shù)碼相機拍攝照片，每張玻片隨機拍攝30個細胞，在電腦上用CASP彗星軟件分析。1.2.3 血清脂質(zhì)過氧化指標的測定 染毒結(jié)束后，用質(zhì)量濃度為20g/L(2%)的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹部開U型口，暴露心臟，從心尖抽取5mL全血，置于試管中，37水浴2h，離心(3000r/min，10min)，分離血清檢測GSH和MDA含量。MDA含量測定按硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)比色法，GSH含量測定按Haffeman微量

11、法。            作者：齊寶寧，易建華，唐國慧，苗江麗，郭劍鋒 【摘】目的 研究正己烷(nhexane)對大鼠的脂質(zhì)過氧化作用和肝細         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。    1.2

12、.4 組織勻漿抗氧化酶活力測定 立即取新鮮肝臟組織塊(0.2-1g)，除去血液，濾紙拭干，稱重，加入9倍重量的冷生理鹽水，用組織勻漿機制成10%勻漿液，檢測SOD和GSHPx活力。SOD活力測定按鄰苯三酚自氧化法，GSHPx活力測定按二硫代二硝基苯甲酸(dithiobisnitrobenzoic acid, DTNB)直接法。1.3 統(tǒng)計學處理 測定值以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用SPSS11.5軟件對數(shù)據(jù)進行分析，多組均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組之間的多重比較分別采用Dunnettt檢驗和SNKq檢驗。2 結(jié)   &

13、#160;果2.1 大鼠體重的變化 實驗期間，各組體重均隨時間而增加，對照組體重增加最快，低劑量組與對照組比較無明顯差異。在0、3、6、12、21、28d時分別作方差分析，從第6天開始，組間有顯著性差異(P<0.05)；各實驗組與陰性對照組作Dunnettt檢驗，中、高劑量組與對照組之間有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；各實驗組之間再作SNKq檢驗，低劑量組和高劑量組有顯著性差異(P<0.05，表1)。表1 各劑量組大鼠在不同時間的體重變化（略）2.2 正己烷對大鼠血清MDA和GSH含量的影響 血清中MDA含量隨染毒劑量增加而增大，GSH含量則隨染毒劑量增加而

14、減少，作方差分析，組間有顯著性差異(P<0.05)；各實驗組與陰性對照組作Dunnettt檢驗，中、高劑量組與對照組之間有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；實驗組之間再做SNKq檢驗，低劑量組和高劑量組有顯著性差異(P<0.05，表2)。表2 各組大鼠血清中MDA、GSH含量的變化（略）2.3 正己烷對大鼠肝組織勻漿SOD和GSHPx活力的影響 肝組織勻漿中GSHPx 、SOD活力隨染毒劑量增加而減小，作方差分析，組間有顯著性差異(P<0.05)；各實驗組與陰性對照組做Dunnettt檢驗，高劑量組與對照組之間有顯著性差異(P<0.01)；實驗組之間

15、再作SNKq檢驗，低劑量組和高劑量組有顯著性差異(P<0.05，表3)。表3 各劑量組大鼠肝組織勻漿SOD、GSHPx的活力（略）2.4 正己烷對大鼠肝細胞DNA損傷的影響 隨著染毒劑量的增加，尾長、尾DNA(%)、尾矩、Olive尾矩值均增大。各實驗組與對照組做Dunnettt檢驗。結(jié)果顯示，陽性對照組與陰性對照組比較，尾長、尾DNA(%)、尾矩、Olive尾矩均有顯著性差異(P<0.01)；中、高劑量組與陰性對照組比較，尾長、尾DNA(%)、尾矩、Olive尾矩有顯著性差異(P<0.01)；低劑量組與陰性對照組比較，無顯著性差異。實驗組之間再做SNKq檢驗，低劑量組和高劑

16、量組有顯著性差異(P<0.05，表4)。2.5 大鼠肝細胞SCGE結(jié)果的相關(guān)分析 以染毒劑量為橫坐標，尾矩值為縱坐標做散點圖，觀察隨正己烷染毒劑量的增加對大鼠肝細胞DNA損傷的劑量效應(yīng)關(guān)系。做相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)r為0.981，呈正相關(guān)(P<0.05)。表4 各組大鼠肝細胞單細胞凝膠電泳的結(jié)果（略）3 討 論機體代謝及損傷過程中可產(chǎn)生超氧自由基，若不及時消除，就會對自身造成氧化脅迫，引起脂質(zhì)過氧化，對細胞膜甚至整個細胞造成損傷。但在正常的生理條件下機體同時存在抗氧化系統(tǒng)，能清除自由基，阻斷脂質(zhì)過氧化，保護細胞的正常生理功能，這是需氧生物抵御過氧化損傷的主機制8。SOD和GSHPx是體

17、內(nèi)兩種十分重的抗氧化酶，是機體抗氧化防御系統(tǒng)的重成員。GSH是細胞中最重的非酶性小分子抗氧化劑之一。 MDA是自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸而引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量水平可反映機體內(nèi)細胞脂質(zhì)過氧化的程度。本次實驗通過正己烷對大鼠亞急性染毒，觀察正己烷對大鼠脂質(zhì)過氧化的作用。通過檢測大鼠的肝臟組織勻漿中SOD、GSHPx酶的活性和血清中GSH和MDA含量來反映脂質(zhì)過氧化程度。結(jié)果表明，各正己烷染毒組與對照組相比較，抗氧化酶SOD和GSHPx活性降低，GSH含量減少，MDA含量增加，組間比較有顯著性差異(P<0.05)，且隨著染毒劑量的增加，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。這與

18、文獻6報道一致，進一步證實了正己烷的脂質(zhì)過氧化作用。檢測DNA損傷的方法有很多，如中性或堿性蔗糖密度梯度離心法、DNA堿解旋法、中性或堿性濾膜洗脫法等9。但這些方法不能對單個細胞進行分析，需放射性標記，而且設(shè)備和技術(shù)條件求較高。本次實驗中采用Singh等建立和改進的單細胞凝膠電泳技術(shù)(single cell gel electrophoresis, SCGE)又稱彗星試驗(comet assay)檢測單個細胞DNA損傷。該方法具有靈敏、簡便、快速及樣品用量少、不需放射性等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于放射生物學、DNA損傷與修復(fù)，DNA交聯(lián)、內(nèi)源性自由基攻擊所致的DNA氧化性損傷、遺傳毒理學、腫瘤治療評價及

19、細胞凋亡等領(lǐng)域的研究10。本次實驗應(yīng)用單細胞凝膠電泳技術(shù)檢測了肝臟細胞DNA損傷情況，并用彗星圖像分析軟件CASP對圖像進行分析。結(jié)果顯示，正己烷能使大鼠肝細胞DNA產(chǎn)生鏈斷裂損傷，并且隨著染毒劑量的增加，彗星尾長及尾部面積越來越大，DNA損傷程度越嚴重，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。脂質(zhì)過氧化過程是一個產(chǎn)生自由基和自由基參與的鏈式反應(yīng)。其中產(chǎn)生的多種自由基和非自由基產(chǎn)物可引起細胞功能障礙，特別是具有中等反應(yīng)活性的脂自由基L·，LO·和LOO·，易穿透并擴散進入細胞核，與堿基起加合反應(yīng)，直接攻擊DNA或RNA；自由基對DNA的損傷可以是活性氧直接作用于核酸，引起堿基的修飾和

20、DNA鏈的斷裂11，也可以是間接通過脂質(zhì)過氧化作用和糖氧化作用產(chǎn)生新的羰基對DNA的修飾12。本實驗結(jié)果表明，正己烷對大鼠肝細胞DNA的損傷可能與其對肝細胞膜損傷引起脂質(zhì)過氧化作用，削弱機體消除自由基的能力有關(guān)。具體損傷機制及其相關(guān)關(guān)系還需進一步的研究?！緟⒖嘉墨I】1IPCS. Environmental Health Criteria 122 nHexane M. Geneva: WHO, 1991:1213.2金泰廙. 職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學 M. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2004:212213.3馬爭，黃建勛，唐小江，等. 正己烷生物標志物研究進展 J. 中國職業(yè)醫(yī)學，2004, 31(1):

21、5859.4Chu I, Villeneuve DC, Secours VE, et al. Shortterm dermal toxicity and mutagenicity of coad coprocessing products in the rat J. J Toxicol Envivon Health, 1991, 33(3):317326.            作者：齊寶寧，易建華，唐國慧，苗江麗，郭劍鋒 【摘】目的 研究正己烷(nhexane)對大鼠的脂質(zhì)過氧化作用和肝細         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。5Masotto C, Bisiani C, Camisasca C,