應(yīng)用套式PCR方法檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型_圖文

1、應(yīng)用套式PCR方法檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型趙浩軍1,范偉興23,姜平1,李曉成2,黃保續(xù)2(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京210095;2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所,山東青島266032摘要:根據(jù)Genbank中發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2全基因序列,設(shè)計(jì)2對(duì)PCV2特異性引物,建立套式PCR檢測(cè)方法。外測(cè)引物p1、p2擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為647bp(922738,內(nèi)測(cè)引物p3、p4擴(kuò)增長(zhǎng)度為219bp(3192537。其中用外部引物可擴(kuò)增DNA含量到10-5mg/mL,而套式PCR 則比普通PCR靈敏性還要提高103倍。用該方法對(duì)山東、安徽和河北10省的899份臨床發(fā)病豬的肺臟和淋巴結(jié)樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果

2、有329份樣品檢測(cè)出陽(yáng)性,平均陽(yáng)性檢測(cè)率達(dá)3616%。由此可見(jiàn),PCV2感染在全國(guó)范圍內(nèi)的發(fā)病豬群中普遍存在。關(guān)鍵詞:豬圓環(huán)病毒2型;套式PCR;檢測(cè)中圖分類(lèi)號(hào):S858128文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):052925130(20061220040203豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PC V是由Tischer于1974年發(fā)現(xiàn)的一種病毒,為無(wú)囊膜的單股負(fù)鏈DNA病毒,病毒粒子直徑約1720n m,二十面體對(duì)稱(chēng),是迄今已知最小的動(dòng)物病毒之一1。PC V屬圓環(huán)病毒科(C ircoviridae圓環(huán)病毒屬(C ircovirus成員。根據(jù)PCV抗原性及基因組不同,分為2種基因型或血清型,

3、即PC V1和PCV2。PCV1基因組全長(zhǎng)1759bp,是由Tiseher等于1974年首次從豬傳代細(xì)胞系PK215中作為一種污染物分離出來(lái)的病毒,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該病毒無(wú)致病性,廣泛存在于正常豬體內(nèi)各組織器官2-4。PCV2基因組全長(zhǎng)1767bp或1768bp,與近年來(lái)發(fā)生的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post w eaning multisyste m ic wasting syndr ome,P MW S收稿日期:2006202227基金項(xiàng)目:國(guó)家動(dòng)物流行病學(xué)中心專(zhuān)項(xiàng)基金及浙江省科技攻關(guān)項(xiàng)目資助。作者簡(jiǎn)介:趙浩軍(19792,男,碩士研究生。3通訊作者。密切相關(guān)5-7,該病毒主要侵害512周齡

4、斷奶仔豬,主要臨床癥狀為漸進(jìn)性消瘦、呼吸困難急促、貧血、腹瀉、黃疸、間質(zhì)性肺炎、淋巴腺炎及腎炎。豬圓環(huán)病毒病已成為全球性流行,該病的發(fā)生和蔓延已經(jīng)給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)有資料表明PCV常與豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRS V、豬細(xì)小病毒(PP V、豬偽狂犬病毒(PRV等混合感染豬8。因此,建立PCV2的檢測(cè)方法,進(jìn)行PC V2的監(jiān)測(cè)調(diào)查,有助于我們掌握國(guó)內(nèi)PCV2疫情,為進(jìn)一步制定PCV2感染的防控政策和措施提供理論依據(jù)。1材料與方法111細(xì)胞、毒株與病料PK215細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存,PCV2毒株9(AY556473、PCV1、PRRS V、PRV和PP V為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保

5、存;病料分別來(lái)自山東、福建、浙江、甘肅、湖南、遼寧、黑龍江、湖北、河南和河北等10省899份臨床發(fā)病豬的肺臟和淋巴結(jié)。的效果理想,其回收量和純度足以進(jìn)行各種分子生物學(xué)及其他方面的研究。參考文獻(xiàn):1L illehoj H S.Role of ly mphocytes and cyt okines in coccidi osisJ.I nt J Parasit ol,1998,28:107121081.2St otish R L,W ang C C.Preparati on and purificati on of mer oz oites ofEi m eria tenellaJ.J Paras

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7、quesJ.AnnRech Vet,1974,(5:1092113.5W agebach G E.Purificati on of Ei m eria tenella s por oz oites with glassbead columnJ.J Parasit ol,1969,55:8332838.6Schmatz D M.Purificati on of E i m eria tenella s por oz oites by DE252ani on exchange chr omat ographyJ.J Pr ot ozool,1984,31(1:1812183.7田廣孚,田增義.柔嫩

8、艾美耳球蟲(chóng)子孢子的提純J.中國(guó)獸醫(yī)雜志.1989,15(4:27228.8蔣建林,蔣金書(shū).柔嫩艾美耳球蟲(chóng)各階段蟲(chóng)體分離純化方法的改進(jìn)J.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,1(5:992106.9安健,汪明,韓春來(lái),等.柔嫩艾美耳球蟲(chóng)裂殖子的分離純化J.中國(guó)獸醫(yī)科技,2003,33(12:54257.10Ouarzane M,LabbeM,Pery P.Purificati on of Ei m eria tenella firstgenerati on schizontsJ.J Parasit ol,1998,84(5,102721031. 11Xie M Q,GillbertA L,FullerA

9、 L,et al.A ne w method for purifica2ti on of Ei m eria tenella mer oz oitesJ.Parasit ol ogy,1990,76:5662 569.12Fernando M A,A lattarM A,Boules G H.Preparati on of second gen2erati on mer oz oites of E i m eria necatrix fr om host tissueJ.J Parasi2t ol ogy,1984,70:1542155.4Ani m al Husbandry&Vete

10、rinary Medicine2006Vol138No112112主要試劑DNAZol Reagent 試劑盒購(gòu)自I nvitr ogen 公司,D 2氨基葡萄糖購(gòu)自Sig ma 公司,Taq DNA 聚合酶(5U /L 、Mg 2+(25mmol/L 、d NTP (25mmol/L 、PCR 回收純化試劑盒、DL 22000Marker 均購(gòu)自TakaRa 公司。113引物設(shè)計(jì)根據(jù)Gen Bank 中發(fā)表的PCV2(AY556473全基因序列,設(shè)計(jì)以下2套引物。其中一擴(kuò)引物p1、p2擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為647bp (922738,二擴(kuò)引物p3、p4擴(kuò)增長(zhǎng)度為219bp (3192537。引物由上

11、海生物技術(shù)有限公司合成,用高壓滅菌超蒸水溶解配成100pmol/L,-20保存,用時(shí)稀釋成20pmol/L 。一擴(kuò)引物 p1:52GGTT ACACGG AT ATTGT AGT CC 23p2:52CGTT ACCGCAG AAG AAG AC AC 23二擴(kuò)引物p3:52TGGGT CAT AGGTT AGGGC ATTG 23p4:52GCGGTGG AC ATG ATG AG ATTT A 23114病毒的增殖按常規(guī)方法培養(yǎng)無(wú)PCV1污染的PK 215細(xì)胞,用毒株(AY556473接種細(xì)胞,37孵育12h,加入含有2%小牛血清的DME M 維持液,置375%CO 2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2

12、4h 后用300mmol/L D 2氨基葡萄糖處理30m in,P BS 洗滌后繼續(xù)培養(yǎng)48h 。用細(xì)胞消化液消化收獲病毒 ,-20保存。115細(xì)胞總基因組的提取采集病豬的肺臟和淋巴結(jié)。取50mg 剪碎后加入4倍體積的10×P BS 研磨勻漿。勻漿液轉(zhuǎn)移至115mL 離心管中,反復(fù)凍融3次后,按DNAZol Reagent 試劑盒說(shuō)明提取核酸,最后核酸用200L 的8mol/L Na OH 溶解,-20保存?zhèn)溆谩?16套式PCR第1次PCR 擴(kuò)增:25L 體積反應(yīng)體系(10×Buffer 215L,Mg 2+115L,d NTP 2L,引物p1、p2各015L,rTaq 酶

13、012L,模板3L,用滅菌超純水補(bǔ)足25L ,PCR 擴(kuò)增條件:95變性5m in;按9445s,531m in,721m in,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72延伸10m in 。最后置4保存。第2次PCR 以第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,擴(kuò)增條件相同。117特異性試驗(yàn)以PCV2毒株(AY556473、PC V1、PRRS V 、PRV 和PP V 感染細(xì)胞,提取的細(xì)胞總基因組為模板,進(jìn)行套式PCR 擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收純化,然后送上海生工測(cè)序,測(cè)序結(jié)果上Genbank 進(jìn)行序列同源性比較。118敏感性試驗(yàn)提取細(xì)胞毒(AY556473的總基因組,經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得DNA 含量為100m

14、g/mL,然后按10倍梯度倍比稀釋到10-9mg/mL 。以此為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。119樣品檢測(cè)從10個(gè)省份采集的899份樣品中提取DNA,用套式PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)。2結(jié)果與討論211特異性試驗(yàn)結(jié)果2次PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察,發(fā)現(xiàn)只有PC V2病毒(AY556473在220bp 附近有一條與預(yù)計(jì)大小相符的條帶,而PC V1、PRRS V 、PRV 、PP V 和陰性對(duì)照都沒(méi)有條帶(圖1。PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收直接送上海生工測(cè)序,測(cè)序結(jié)果登陸Genbank 進(jìn)行序列比較,結(jié)果表明所得到的片段與Genbank 收錄的PC V2相應(yīng)片段的同源性在96%以上。M.marker

15、(DL 2200016.分別為PCV2、PCV1、PRRS V 、PRV 、PP V 和H 2O 的PCR產(chǎn)物圖1套式PCR 特異性試驗(yàn)212敏感性試驗(yàn)結(jié)果第1輪PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察,發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性病毒DNA 稀釋度從10-110-5擴(kuò)增產(chǎn)物在647bp 附近有一條與預(yù)計(jì)大小相符的條帶;第2輪PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察,發(fā)現(xiàn)病毒DNA 稀釋度從10-310-8mg/mL 時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物在220bp 附近有一條與預(yù)計(jì)大小相符的條帶(圖3、圖4。M.marker (DL 2200016.分別為10-110-6倍稀釋的陽(yáng)性病毒DNA 的PCR 產(chǎn)物圖2第1輪PCR 敏感性試驗(yàn)M.ma

16、rker (DL 2200017.分別為10-310-9倍稀釋的陽(yáng)性病毒DNA 的PCR 產(chǎn)物圖3第2輪PCR 敏感性試驗(yàn)14畜牧與獸醫(yī)2006年第38卷第12期獸醫(yī)基礎(chǔ)蕨麻多糖對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞NAD PH氧化酶活性的影響張霞1,2,胡庭俊2,鄭榮梁3,4,程富勝2,陳炅然2,孟聚誠(chéng)2,高芳2,劉英13 (11甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅蘭州730070;21中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅蘭州730050;31蘭州大學(xué)生命科學(xué)院,甘肅蘭州730000;41上海高校一氧化氮及炎癥醫(yī)學(xué)E2研究院,甘肅蘭州730000摘要:為探討蕨麻多糖對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞NADPH氧化酶

17、活性的影響,作者應(yīng)用超氧陰離子熒光探針HE標(biāo)記脾臟淋巴細(xì)胞后,借助激光掃描共聚焦顯微鏡,對(duì)脾淋巴細(xì)胞內(nèi)HE熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果經(jīng)H2O2誘導(dǎo)處理的脾細(xì)胞中NADPH氧化酶活性顯著降低,蕨麻多糖能使脾淋巴細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。表明蕨麻多糖(P AP能夠拮抗由H2O2引起的酶活性降低,促進(jìn)細(xì)胞NADPH氧化酶的活性的恢復(fù),從而影響免疫細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能。關(guān)鍵詞:蕨麻多糖;脾臟淋巴細(xì)胞;NADPH氧化酶;呼吸爆發(fā);HE熒光探針中圖分類(lèi)號(hào):S86511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):052925130(20061220042203蕨麻(potentilla anserine L為薔薇科委陵菜屬植物,其根

18、又名戳瑪、卓老灑曾、人參果、延壽果和仙人果等,為補(bǔ)益類(lèi)藏藥,為藏醫(yī)常用藥之一。據(jù)文獻(xiàn)記載,蕨麻中含有鞣質(zhì)、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂肪酸及委陵菜甙等化學(xué)成分,其藥理作用在于提高機(jī)體免疫力、抗衰老、耐缺氧和止瀉抑菌。本文通過(guò)測(cè)定加入蕨麻多糖(Potentilla anserine polysaccharide,P AP后收稿日期:2006201216基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30371056作者簡(jiǎn)介:張霞(19722,女,副教授,博士。3通訊作者。體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽(N icotinom ide adenine dinucleotide phos phate,NADPH

19、氧化酶活性的變化,探討蕨麻多糖對(duì)免疫細(xì)胞呼吸爆發(fā)等生物活性的影響。1材料與方法111材料實(shí)驗(yàn)藥物:蕨麻多糖由中國(guó)農(nóng)科院蘭州畜牧與獸藥研究所新獸藥工程研究室提取、分離和純化。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明系小鼠,體重1822g,雄性,健康;由甘肅省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。213臨床樣品檢測(cè)從山東、福建和河北等10個(gè)省份采集的899份臨床發(fā)病豬淋巴結(jié)和肺臟樣品中,檢出陽(yáng)性樣品329份,平均陽(yáng)性檢出率為3616%。各省陽(yáng)性檢出率分別為:山東6012%、福建3417%、浙江18%、甘肅3413%、湖南2116%、遼寧2012%、黑龍江3313%、湖北2711%、河南5017%和河北4617%。其中山東省高達(dá)6012

20、%,最低的遼寧省也有2012%的陽(yáng)性檢出率,西北地區(qū)的代表省份甘肅省也有3413%陽(yáng)性檢出率。這表明PC V2感染在全國(guó)發(fā)病豬群中普遍存在。本研究建立的套式PCR的特異性好。同時(shí),10-8mg/mL 濃度的DNA經(jīng)套式PCR擴(kuò)增,還可得到陽(yáng)性結(jié)果,說(shuō)明該法的敏感性高。該方法的建立,為我們接下來(lái)在健康豬群中進(jìn)行PCV2感染情況、豬用疫苗PCV2的污染情況、實(shí)驗(yàn)室和疫苗生產(chǎn)廠家細(xì)胞PC V2污染情況的調(diào)查奠定了實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn):1Lukert P D,de Boer G F,Dale J L,et al.The circoviridaeA.Mur phy F A,Fauquet C M,B i

21、shop D H L,eds.V irus taxonomy.6th Report of the I nternati onal Comm ittee Taxonomy of V irusesC.V ienna and New York:Sp ringer2Verlag,1995,1662168.2Tischer I,Rasch R,Tochter mann G.Characterizati on of papovavirusand p icornavirus2like particles in per manent p ig kidney cell linesJ.Zentralbl Bakt

22、eri ol,1974,226:1532167.3Tischer I,M ields W,Wolff D,et al.Studies on ep ide m i ol ogy andpathogenicity of porcine circovirusJ.A rch V ir ol,1991,(324:2712276.4A llan GM,Mc Neilly F,Cassidy J P,et al.Porcine circovirus2exper2i m ental infecti ons of col ostrum s dep rived p iglets and exa m inati on ofp ig f oetal materialJ.VetM icr obi ol,1995,44:49264.5A llan GM,Mc Neilly F,Kennedy S,et a