硫酸鎳論文扶正解毒湯對硫酸鎳誘導16HBE細胞微核形成的抑制作用-寫手聯(lián)盟

1、硫酸鎳論文|扶正解毒湯對硫酸鎳誘導16HBE細胞微核形成的抑制作用-寫手聯(lián)盟    來源:摘 要：目的研究中藥扶正解毒湯（FJD）對硫酸鎳（NiSO4）誘導人支氣管上皮細胞（16HBE）微核形成的抑制作用。方法分別以 NiSO4 暴露、FJD 含藥血清與NiSO4 共同處理體外培養(yǎng)的16HBE 細胞，觀察其微核率的變化，并采用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）檢測不同處理組細胞內(nèi)鎳（Ni）、鎂（Mg）、鋅（Zn）離子濃度及自由基含量的變化。結(jié)果與陰性對照組相比，NiSO4（400μmol/L）暴露組細胞微核率、細胞內(nèi)Ni2+濃度及自由基含量均

2、明顯增高（P<0.01），而細胞內(nèi)Mg2+、Zn2+濃度則明顯降低（P<0.01）。低、中、高劑量FJD 血清與NiSO4 共同處理后，細胞微核率分別為4.4、2.7、1.4，顯著低于NiSO4 暴露組（P<0.050.01），且FJD 血清的作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系（r=?0.734,P<0.05）；同時，與NiSO4暴露組相比，細胞內(nèi)Ni2+濃度及自由基含量下降，Mg2+、Zn2+濃度升高（P<0.050.01），接近陰性對照組。結(jié)論 FJD 對鎳誘導16HBE 細胞微核形成有明顯的抑制作用，其機制可能與調(diào)節(jié)染鎳細胞內(nèi)某些金屬元素含量變化及清除自由基有關(guān)。寫手聯(lián)盟

3、專業(yè)代寫代發(fā)表職稱論文、專業(yè)論文，推薦刊物均為同時具有CN和ISSN雙刊號正規(guī)期刊，以優(yōu)惠的價格，優(yōu)良的服務(wù)，為您打造最優(yōu)質(zhì)的原創(chuàng)論文代寫和職稱論文發(fā)表服務(wù)! 可提供論文加急發(fā)表。：扶正解毒湯，含藥血清，硫酸鎳，微核，離子，自由基鎳化合物為一類多系統(tǒng)、多器官、多細胞毒物及人類確證致癌物。體外實驗研究證實，硫酸鎳（NiSO4）等水溶性鎳化合物可通過自由基作用等機制誘導哺乳類及嚙齒類細胞染色體畸變，姐妹染色單體交換，基因突變，DNA 斷裂，細胞惡性轉(zhuǎn)化及癌變1，2。近10 余年來，本課題組已開展了以復方中藥扶正解毒湯（FJD）拮抗鎳毒性的系列研究，結(jié)果表明，F(xiàn)JD 對NiSO4 暴露大鼠及慢性鎳暴

4、露人群的多器官損傷具有顯著的拮抗作用3，4。本研究在建立NiSO4 暴露誘導培養(yǎng)人支氣管上皮細胞（16HBE）微核形成模型的基礎(chǔ)上，首次從體外途徑研究FJD 對NiSO4 遺傳毒性的抑制作用及其可能的機制，旨在為中醫(yī)藥防治重金屬毒臨床研究提供新的理論依據(jù)。1. 材料與方法1.1 材料1.1.1 細胞及動物16HBE（美國ATCC），純種青紫蘭兔16 只，雄性，體重（2.1&plusmn;0.3）kg，由中國蘭州生物制品研究所提供（合格證號：14004），常規(guī)飼養(yǎng)。1.2 中藥 FJD 由紅芪、茯苓、丹參、枸杞、當歸、莪術(shù)、連翹按4:4:3:3:2:2:2 組方，生藥由甘肅省藥材公司提供

5、，經(jīng)鑒定全部符合中華人民共和國藥典規(guī)定。上藥混合，加三蒸水煎煮，制備成含生藥4g/ml 藥液，4保存?zhèn)溆谩?.1.2 主要試劑及設(shè)備分析純 NiSO4、絲裂霉素（MMC）、熒光染料acridine orange(AO)（Sigma 公司），MEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、（GIBCO 公司），小牛血清（杭州四季青生物工程材料公司），鎳離子探針Newport Green DCF(N-7991)、鎂離子探Mag-fluo-4AM(M-14206)、鋅離子探針Zinc GreenIndication(Z-6901)、自由基探針乙酰乙酸鹽-2，7-二氯氫化熒光素（D-399）（美國Molecular Pro

6、be Inc.），Lx-50 型熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），TCS sp2型激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica），MCO-15AC 型CO2 恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO），F(xiàn)D-1 型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康技術(shù)公司）。1.2 方法1.2.1 FJD 含藥血清凍干粉的制備 FJD 高、中、低劑量血清組分別以FJD11、5.5 和2.75g?kg-1?d-1 灌胃（給藥中劑量臨床常用量&times;動物等效面積系數(shù)&times;培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋度，高、低劑量分別為中劑量乘以及除以2），空白血清對照組（簡稱空白血清）予以生理鹽水。各組每日分2 次等體積灌胃（灌胃前禁食

7、，自由取水），共3d，于末次灌胃后2h 心臟采血，室溫下靜置4h，2400r/min 離心10min，分離血清，0.22&mu;m 微孔濾膜過濾，56水浴滅活后，在70條件下，以超低溫冷凍干燥機制成不同劑量的含藥血清凍干粉，20貯存?zhèn)溆谩?.2.2 細胞培養(yǎng)及受試物的配制 16HBE 細胞用含10小牛血清和青霉素、鏈霉素的MEM培養(yǎng)基，在37，5CO2 飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。細胞按1.0&times;104/cm2 密度接種。隔日換液，每34d 按1:4 比例傳代1 次。NiSO4 以不含小牛血清的MEM 培養(yǎng)液配成系列濃度，高壓消毒。實驗終濃度分別為50、100、200、40

8、0、800&mu;mol/L。低、中、高劑量FJD 血清及空白血清凍干粉以不含小牛血清的MEM 培養(yǎng)液溶解稀釋，實驗終濃度均為10（體積分數(shù)）。分別以絲裂霉素（MMC）和不含小牛血清的MEM 培養(yǎng)液作為陽性對照和陰性對照。1.2.3 細胞毒性實驗接種 500 個16HBE 細胞于25ml 培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h，按實驗分組加入受試物，每個劑量設(shè)5 個平行樣。在37，5CO2 條件下培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)液，以無菌PBS 洗滌細胞兩次，加入新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7d。用甲醇固定細胞10min，10Giemsa染色，計數(shù)形成的克隆數(shù)，并計算絕對克隆形成率（CFE）和相對克隆形成率（RFE）5。

9、CFE（）（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）&times;100RFE（）（處理組CFE/陰性對照組CFE）&times;100選擇 RFE 為1090范圍內(nèi)的一個濃度作為NiSO4 誘導微核形成的實驗濃度。1.2.4 體外微核試驗取對數(shù)生長期的16HBE 細胞接種于25cm2 培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶接種的細胞數(shù)為2.5&times;105，培養(yǎng)24h 后，換以不含小牛血清的MEM 培養(yǎng)液，按實驗分組加入受試物，繼續(xù)培養(yǎng)24h，胰蛋白酶消化細胞，800r/min 離心5min 后用0.075mol/LKCL 處理細胞，再次離心后加入固定液（冰醋酸與甲醇按3?1 配制），600r/min 離

10、心8min，再次重復固定2次，滴片，風干。熒光顯微鏡鏡檢之前，AO 染色。每組樣本制片2 張，將帶有1 個典型微核、帶有1 個大微核（直徑大于主核直徑的1/4）及帶有多個微核（無論大?。┑募毎鳛槲⒑思毎嫈?shù)。每片至少計數(shù)500 個單核細胞。計算每個樣本1000 個細胞中微核細胞率（，簡稱微核率）。1.2.5 16HBE 細胞內(nèi)Ni2+、Mg2+、Zn2+濃度及自由基含量的LSCM 檢測受試物處理方法同微核試驗。細胞經(jīng)受試物處理并繼續(xù)培養(yǎng)24h 后，以PBS 洗滌2 次，胰蛋白酶消化，離心，棄上清，然后以新鮮完全培養(yǎng)液制備細胞懸液，分裝。取預先溶解的N-7991、M-14206、Z-6901、

11、D-399 四種探針稀釋液（5&mu;mol/L）各1ml，加至各組細胞懸液中，終濃度均為1.25&mu;mol/L。37水浴箱中孵育40min，加PBS 洗滌，1000r/min 離心10min，重復3 次，重懸細胞于PBS 中，滴片，蓋片。設(shè)定LSCM 檢測條件（見表1），在40&times;高倍鏡下，每組選取5 個最佳清晰的熒光圖像以點面2&times;6 方式掃描。掃描圖像存入計算機硬盤內(nèi)，分析試重新讀出。數(shù)據(jù)分析采用LSCM 圖像處理系統(tǒng)，以熒光像素數(shù)代表離子濃度及自由基含量。1.3 統(tǒng)計學方法以 SPSS10.0 統(tǒng)計軟件分別對數(shù)據(jù)進行poisson

12、 分布分析、F 檢驗及相關(guān)分析。2. 結(jié)果2.1 受試物對16HBE 細胞的毒性（見表2） 由表 2 可見，NiSO4 組CFE 和RFE 隨其濃度增加而降低，呈劑量反應(yīng)關(guān)系。高劑量FJD 血清及空白血清本身對16HBE 細胞無毒性效應(yīng)，高劑量FJD 血清的加入也對NiSO4（400&mu;mol/L）的細胞毒性無明顯影響。參照文獻6，選擇400&mu;mol/L 作為誘導16HBE 細胞微核形成的實驗濃度。2.2 FJD 對NiSO4 誘導16HBE 細胞微核形成的抑制作用（見表3） 由表 3 可見，NiSO4（400&mu;mol/L）暴露的16HBE 細胞其微核率

13、顯著高于陰性對照組（P<0.01），低、中、高劑量FJD 血清與NiSO4 共處理組細胞微核率分別為4.4、2.7、1.4，均低于NiSO4組（P<0.050.01）；FJD 血清的作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系（r=?0.734,P<0.05）。2.3 FJD 對鎳暴露16HBE 細胞內(nèi)離子濃度及自由基含量變化的影響（見表4） 與陰性對照組相比，NiSO4（400&mu;mol/L）暴露組細胞內(nèi)Ni2+濃度及自由基含量明顯增加，Mg2+、Zn2+濃度降低（P<0.01），而經(jīng)FJD 血清與NiSO4 共同處理后，Ni2濃度及自由基含量降低，Mg2+、Zn2+濃度升高（P&

14、lt;0.050.01），尤以高劑量FJD 血清作用明顯，接近陰性對照水平。3. 討論微核試驗是用于染色體損傷和干擾細胞有絲分裂的化學毒物的快速檢測方法，可檢測化學毒物或物理因素誘導產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學終點。業(yè)已證實，NiSO4 可誘導培養(yǎng)V79 細胞及SHE 細胞微核形成7。本研究采用體外微核試驗方法，證實NiSO4（400&mu;mol/L）亦可誘導人支氣管上皮細胞微核形成，同時發(fā)現(xiàn)，染鎳16HBE細胞內(nèi)Ni2+濃度及自由基含量異常增高，而Mg2+、Zn2+濃度降低，此與文獻報道較為一致8，9。提示，細胞內(nèi)Ni 的過量攝入，部分二價金屬元素的失衡狀態(tài)以

15、及氧化應(yīng)激的存在，可能為NiSO4 遺傳毒性的基礎(chǔ)。FJD 中紅芪、當歸、丹參、枸杞益氣養(yǎng)血，莪術(shù)、茯苓、連翹化瘀利濕解毒，體現(xiàn)了中醫(yī)學“扶正祛邪”的治則思想。本研究首次以FJD 含藥血清凍干粉進行鎳遺傳毒性干預的體外研究。結(jié)果表明，F(xiàn)JD 血清對NiSO4 誘導16HBE 細胞微核形成具有顯著的抑制作用。其可能機制為：（1）金屬元素間的相互作用。二價金屬元素間存在相互拮抗性。FJD 中富含Mg、Zn 等元素，而Ni 含量甚微10。加入FJD 后，一方面糾正了染鎳細胞內(nèi)Mg、Zn 的失衡狀態(tài)，使細胞內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定，另一方面，補充的Mg、Zn 可競爭性抑制或減弱細胞內(nèi)Ni 的攝入，Ni2+與DNA 以及DNA 復制酶、DNA 修復酶的特異性結(jié)合，從而保護染色體免受損傷，維持了基因組的穩(wěn)定性1。（2）清除自由基、抗氧化作用。現(xiàn)代藥理學研究已證實，F(xiàn)JD 七種中藥中均含有抗氧化、清除自由基、抗誘變及一定的抗癌成份，而本身無明顯毒副作用11。動物實驗已證實，F(xiàn)JD 具有顯著的抗