淺析EGb761對慢性腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)膠質細胞的影響

1、淺析EGb761對慢性腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)膠質細胞的影響【摘要】? 目的 探討EGb761(銀杏葉提取物)對慢性腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)膠質細胞的影響。方法 將雄性SD大鼠隨機分為假手術組、單純缺血組、EGb761干預組。制備慢性腦缺血大鼠模型，藥物干預12周后，免疫組化方法分別檢測各組大鼠腦組織中星形膠質細胞和少突膠質細胞的表達。結果 EGb761干預組大鼠的海馬、胼胝體、皮質CNPase陽性細胞表達明顯高于單純缺血組，而海馬、胼胝體、皮質GFAP陽性細胞表達明顯低于單純缺血組(P0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。結論 慢性腦缺血時，EGb761對少突膠質細胞缺血性反應有保護作用，同時減少反應性星形

2、膠質細胞增生。 【關鍵詞】? EGb761;慢性腦缺血;少突膠質細胞;反應性星形膠質細胞增生;大鼠【Abstract】 Objective To investigate the effects of EGb761(Ginkgo biloba extract) on neuroglial cell in chronic cerebral ischemia rats.Methods Male Sprague Dawley rats were randomly divided into shamoperated group, hypoperfusion group and EGb761 group.

3、 The models of chronic cerebral ischemia were established. Then the rats of EGb761 group were treated by intragastric administration with EGb761 for 12 weeks, the expressions of astrocytes and oligodendrocytes in the hippocampus, corpus callosum and cortex were examined by immunohistochemistry and t

4、he positive cells were counted.Results Compared with the hypoperfusion group, the number of oligodendrocytes increased and the number of astrocytes decreased significantly in the EGb761 group(P0. 05).Conclusion EGb761 plays a protective role in oligodendrocytes ischemic reaction and decreases reacti

5、onary astrogliosis in chronic cerebral ischemia.【Key words】 EGb761; Chronic cerebral ischemia; Oligodendrocytes; Reactionary astrogliosis; Rat慢性腦缺血(chronic cerebral ischemia，CCI)與臨床諸多腦血管疾病密切相關。慢性腦缺血時，少突膠質細胞存在易損性，而星形膠質細胞反應性增生、氧化應激和興奮性毒性等是造成上述情況的重要原因。目前，有關標準銀杏葉提取物EGb761(Ginkgo biloba extract 761)在腦缺血時

6、對神經(jīng)元保護作用的研究較多，而針對其對神經(jīng)膠質細胞抗腦缺血作用的研究相對較少。本試驗通過對慢性腦缺血大鼠模型給予國際標準含量的銀杏葉提取物EGb761進行干預，觀察其對少突膠質細胞及星形膠質細胞的影響，為慢性腦缺血的預防和治療開辟新思路，提供實驗證據(jù)。1 材料與方法1 材料1.1 動物與分組：雄性SD大鼠30只，體質量(22030) g，由鄭州大學實驗動物中心提供。隨機分成3組：A組為假手術組，B組為單純缺血組，C組為EGb761干預組，每組10只。1.2 藥物與試劑：EGb761(達納康，按國際標準銀杏葉提取物要求選取，內含24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內酯，40 mg/粒)，由法國博福益普

7、生制藥工業(yè)公司生產(chǎn);GFAP抗體(膠質原纖維酸性蛋白抗體)、CNPase抗體(23環(huán)核苷酸3磷酸二酯酶抗體)，均購自北京博奧森生物技術有限公司。2 方法2.1 CCI模型鼠的制備：參考Wakita等1方法制備動物模型。10%水合氯醛(0.3 mg/100g)腹腔內注射麻醉后，頸部備皮、消毒，頸正中切開皮膚，切口1.52.0 cm，鈍性分離筋膜、胸骨舌骨肌，分離出雙側頸總動脈，每側用雙線分別在近心端和遠心端結扎，然后在兩結扎處之間剪斷頸總動脈制備出單純缺血組和干預組模型，假手術組僅分離雙側頸總動脈而不結扎，縫合切口，對皮并消毒，放回原環(huán)境中飼養(yǎng)。2.2 給藥方法：將達納康研成粉末狀，用蒸餾水溶解

8、并混勻，術后24 h按照0.5 ml/100 g予灌胃，單純缺血組給予等量蒸餾水灌胃，各組灌胃均為1次/d，持續(xù)12周。2.3 標本的收集與處理：大鼠經(jīng)麻醉后，常規(guī)生理鹽水及4%多聚甲醛灌注、固定，斷頭取腦，制作腦部冠狀石蠟切片(厚度4 m)，分別采用HE染色和免疫組化染色，檢測腦組織病理變化和皮層、胼胝體及海馬GEAP、CNPase陽性細胞數(shù)的情況。2.4 統(tǒng)計學處 理：實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)標準差(s)表示，SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析，檢驗水準=0.05。2 結果2.1 組織病理學表現(xiàn)(HE染色) 假手術組未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化;單純缺血組可見神經(jīng)元大量變性、壞死，

9、胞體呈三角形，胞漿致密，周圍出現(xiàn)空暈，白質內出現(xiàn)散在的神經(jīng)纖維及髓鞘潰變，表明腦組織有明顯的缺血及腦白質受損表現(xiàn);EGb761組神經(jīng)元變性壞死及腦白質受損均較單純缺血組減輕。2.2 大鼠腦膠質細胞CNPase及GFAP的變化情況2.2.1 CNPase變化情況：各組均取皮層、胼胝體、海馬處進行觀察并統(tǒng)計CNPase陽性細胞個數(shù)。單純缺血組CNPase陽性細胞數(shù)明顯少于假手術組和EGb761組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結果見表1。表1 大鼠皮層、胼胝體、海馬CNPase陽性細胞表達情況注：單純缺血組與假手術組比較，*P0.01;單純缺血組與干預組比較，P0.012.2.2 GFAP變

10、化情況：各組均取皮層、胼胝體、海馬處進行觀察并統(tǒng)計GFAP陽性細胞數(shù)。單純缺血組GFAP陽性細胞數(shù)明顯多于假手術組和EGb761組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結果見表2。表2 大鼠皮層、胼胝體、海馬GFAP陽性細胞表達情況注： 干預組與單純缺血組比較，P0.01;單純缺血組與假手術組比較，*P0.013 討論少突膠質細胞(oligodendrocyte，OLG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細胞，在發(fā)生缺血缺氧性損傷后對神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的發(fā)揮產(chǎn)生嚴重的影響。而星形膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內在數(shù)目占絕對優(yōu)勢的一類膠質細胞, 被認為在神經(jīng)元的整個發(fā)育過程中起重要作用，它參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內神經(jīng)元功

11、能的調節(jié)，在維持神經(jīng)元的生存微環(huán)境中起著重要的作用。缺血性腦損傷后星形膠質細胞增生并產(chǎn)生許多生物活性物質， 對缺血損傷神經(jīng)元具有保護作用;而過度增生可作為機械屏障影響髓鞘和軸索的再生，從而影響周圍神經(jīng)組織的結構修復和功能恢復。國際標準EGb761，含24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內酯等多種活性物質，現(xiàn)已證實，EGb中銀杏黃酮為自由基清除劑， 銀杏內酯為特異性PAF 受體阻滯藥，對缺血時的神經(jīng)元有保護作用。本實驗采用CNPase、GFAP分別標記少突膠質細胞和星形膠質細胞，應用EGb761對慢性腦缺血大鼠灌胃治療，觀察大鼠腦內少突膠質細胞及星形膠質細胞數(shù)量的變化。OLG對缺血性損傷高度敏感性的機

12、制包括氧化應激、興奮性氨基酸和凋亡通路激活等。(1)OLG中鐵含量高，而谷胱甘肽含量卻較低，清除自由基能力弱而且顯著依賴于氧化磷酸化，因此容易受到氧化應激損傷。另外，膠質細胞比神經(jīng)元更易發(fā)生鐵和鋁的蓄積，加重氧化應激。許多體內外實驗已證實EGb761能夠清除自由基。EGb761通過抑制細胞氧自由基的釋放削弱超氧自由基對少突膠質細胞的攻擊，同時增強細胞抗缺氧能力。(2)OLG表達功能性谷氨酸的非NMDA受體，包括紅藻氨酸受體和AMPA受體，故其對興奮性氨基酸易感。且OLG缺氧缺血時產(chǎn)生興奮性損傷，胞內Na+的濃度急劇增高，局部谷氨酸濃度顯著增加使AMPA、Kainate 受體過度活化，從而介導C

13、a2+內流增加，導致細胞內Ca2+超載。EGb761可抑制非競爭性NMDA受體，又能作用于谷氨酸受體活化水平，抑制受體活化后引起的一系列級聯(lián)活化和離子通道的開放，從而對抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性和Ca2+超載對細胞的損傷。(3)OLG含有豐富的神經(jīng)鞘磷脂和酞基鞘氨醇，這兩種化合物在體外試驗中均可誘導細胞凋亡。在利用黃嘌呤誘發(fā)PC12細胞凋亡模型，Zhou等發(fā)現(xiàn)銀杏內酯能削弱由黃嘌呤誘導的p53、cMyc、Bax和Caspase3蛋白酶等多種重要凋亡因子的表達，直接證實銀杏內酯可拮抗細胞凋亡，并可在凋亡早期阻斷其進程。結合本實驗結果，EGb761干預組腦組織中的少突膠質細胞數(shù)量較單純缺血組明顯增加

14、(P0.01)，提示EGb761的確能夠減輕OLG在慢性腦缺血時的損傷。星形膠質細胞在缺血性腦損傷后增生并產(chǎn)生的生物活性物質反過來又可引起星形膠質細胞損傷和功能障礙。它們包括谷氨酸、鉀、乳酸、花生四烯酸、NO 和Ca2+流量變化等。所有這些因子都能影響星形膠質細胞， 而星形膠質細胞功能發(fā)生障礙則可影響神經(jīng)元存活。反應性星形膠質細胞增生在一定程度上反映了腦缺血缺氧的程度。EGb761能夠針對反應性星形膠質細胞增生的多種損傷機制進行干預。實驗結果顯示反應性星形膠質細胞增生的情況較單純缺血組明顯改善(P0.01)，提示EGb761能抑制腦缺血時星形膠質細胞的過度表達。腦損傷的病理生理改變存在諸多環(huán)節(jié)

15、，如氧自由基、Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性作用和生物膜損傷等，只要針對其中某一環(huán)節(jié)施加干預都將打斷級聯(lián)反應而保護神經(jīng)細胞。EGb761作用的多重性與慢性腦缺血中的病理生理反應多樣性相對應，從而對慢性缺血的腦起保護作用。由于慢性腦缺血所致腦損傷除了氧自由基損傷、脂質過氧化和興奮性毒性外，還涉及其他因素，盡管EGb761確實有神經(jīng)保護作用，但其保護OLG缺血性損傷及抑制星形膠質細胞過度增生的確切機制仍需深入研究。【參考文獻】? 1 Wakita H, Tominoto H, Kimurua J. Glia activation and white matter change in the rat

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