病理課研究生授課資料分享

1、真誠為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請指正。研究生授課資料張煦第一部分 免疫組織化學(xué)技術(shù)一、免疫組化技術(shù)（Immunohistochemistry techniques）（一）定義：是應(yīng)用抗原與相應(yīng)抗體接觸后可形成抗原抗體復(fù)合物的化學(xué)反應(yīng)，以檢測組織或細胞內(nèi)抗原或抗體的技術(shù)。又稱免疫組織化學(xué)技術(shù)（Immunocytochemistry techniques）1、免疫組化與組織化學(xué)（histochemistry）組織化學(xué)與免疫組化的區(qū)別組織化學(xué)顯示各種不同的化學(xué)成分往往需要用各種不同的方法和條件，既煩瑣又不甚敏感，有很大的局限性。而免疫組化則不然，雖然程序繁雜，但用一種基本方法能夠檢測定位許

2、多組織成分，如：各種蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素，甚至多糖和脂質(zhì)成分等都可以用免疫組化方法進行檢測。免疫組化是組織化學(xué)的一個分支。組織化學(xué)是在細胞和組織中以化學(xué)和物理的實驗方法對某些特殊物質(zhì)、反應(yīng)基因和酶促活性進行識別、定位和定量。即組織化學(xué)技術(shù)是通過分解、置換、氧化、還原等化學(xué)變化，經(jīng)呈色反應(yīng)顯示組織細胞內(nèi)的化學(xué)成分的方法。免疫組化則是利用免疫學(xué)的抗原、抗體具有特異性結(jié)合的原理，檢測組織細胞中的化學(xué)成分或化學(xué)性質(zhì)。2、免疫組化與親合組織化學(xué)（affinity histochemistry）Bayer（1976）將這種利用兩種物質(zhì)之間的高度親合力的進行的組織化學(xué)檢測稱為親合組織化學(xué)。雖有人認為它們是

3、免疫組化的進一步發(fā)展，但親合物質(zhì)之間的反應(yīng)并不是抗原與抗體的反應(yīng)。從抗原與抗體互相親合來看，免疫組化倒應(yīng)包括在親合組織化學(xué)之中。隨著親合組織化學(xué)的發(fā)展，一些親合物質(zhì)又被引入免疫組化，使兩種組織化學(xué)技術(shù)融合為一種方法，明顯提高了組織化學(xué)定位的準確性和敏感性。近20多年來，相繼發(fā)現(xiàn)了多種親合物質(zhì)，如：植物凝集素（Lectins）與糖結(jié)合物（glycol conjugates）、葡萄球菌A蛋白（staphylococal proteinA）與IgG、生物素（biotin）與卵白素（avidin）、激素（脂質(zhì)）與受體等。這些物質(zhì)是一些有雙價或多價結(jié)合能力的物質(zhì)，不但親合物質(zhì)之間有高度親合力，而且可以與

4、標記物如：熒光素、酶、同位素、鐵蛋白等相結(jié)合。3、免疫組化與免疫病理（immunologic pathology）廣義的免疫病理學(xué)則研究所有疾病及病變發(fā)展中的免疫學(xué)機理問題。免疫病理的研究中，免疫組化技術(shù)的確占重要位置，它可以確定組織內(nèi)抗體、補體、抗原，并識別淋巴細胞亞群，但免疫病理的研究方法還包括其他免疫學(xué)方法及一些非免疫學(xué)方法。另一方面，免疫組化可以識別與免疫病理無關(guān)的其他許多抗原，如：病毒、酶、激素等。可見免疫組化與免疫病理既有密切XXX，又有明顯區(qū)別，既有交叉又有獨立的內(nèi)容。4、免疫細胞化學(xué)與原位雜交免疫細胞化學(xué)（In situ hybridization immunocytochem

5、istry）分子雜交與免疫組織化學(xué)的結(jié)合，形成了在細胞、亞細胞和分子水平同時檢測基因及其表達產(chǎn)物的完整體系，把基因探針（基因工程）和單克隆抗體技術(shù)結(jié)合起來，成為當(dāng)代生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)在分子水平研究和診斷的新興技術(shù)。尤其是近年來與PCR技術(shù)結(jié)合的原位PCR技術(shù)，敏感性很高，包括分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論、核酸分子探針制備、原位分子雜交技術(shù)、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、核酸分子雜交電鏡技術(shù)、雜交與免疫細胞化學(xué)雙標記技術(shù)、分子雜交在染色體制片的應(yīng)用和分子雜交基因診斷的應(yīng)用等方面。（三）免疫組化技術(shù)的特點1、高度的特異性、可達到單個AA水平。2、敏感性高。3、方法、步驟統(tǒng)一。4、形態(tài)、機能、代謝的完美結(jié)合（定性、定

6、位、定量）。（四）免疫組化技術(shù)全過程1、抗原提?。兓ǚ鬯椤⒊恋?、層析、離心、電泳）2、抗體制備：PcAb：用Ag免疫動物產(chǎn)生Ab，由于Ag有多個決定簇，刺激多個B細胞克隆，產(chǎn)生針對多個Ag決定簇的混合物（多價Ab）。McAb：用雜交瘤技術(shù)，在細胞培養(yǎng)條件下，經(jīng)過多次克隆化，使一個雜交細胞及其后代產(chǎn)生一種均質(zhì)的Ab。（分離出單個細胞，使其通過分裂增殖而獲得一個遺傳特性）3、抗體純化：除去抗血清中的其他白蛋白，、球蛋白以及纖維蛋白。（目的：Ab標記時，免受其他蛋白的干擾）4、標記抗體：Marrack于1934年提出了在Ab分子上結(jié)合適當(dāng)?shù)臉擞浳铮靡宰R別其相應(yīng)抗原的設(shè)想。5、細胞和組織切片標

7、本的制備。6、免疫組化反應(yīng)和顯色。7、觀察和分析結(jié)果。Marker種類：熒光色素、酶、金、鐵蛋白、放射性同位素、血漿蛋白、多聚微球蛋白、RBC、 病毒、噬菌體。（五）ABC法和PAP法免疫酶標記步驟1、石蠟切片，二甲苯脫蠟三次。2、經(jīng)100%、95%、80%酒精、蒸餾水水化。3、阻斷內(nèi)源性HRP：0.3%H202甲醇液，室溫20分鐘，PBS沖洗3x5。4、蛋白液消化：0.05%胰蛋白酶，室溫30，PBS沖洗3x5。5、保護：正常馬、牛血清（13%），室溫20，勿洗。6、滴加抗，置濕盒內(nèi)，4冰箱過夜。7、PBS液洗3x5。8、滴加抗，濕盒內(nèi)室溫30，PBS 洗3x5。9、滴加PAP或ABC試劑，

8、室溫30，PBS洗3x5。10、顯色：DAB液5 15，鏡下控制，PBS沖洗。11、復(fù)染：蘇木素12分鐘，鹽酸酒精分化30秒，蘭化10。12、80%、95%、100%酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。（六）關(guān)于標記的幾點說明1、阻斷：2、消化：3、保護：4、抗體：5、顯色原理：HRP+H2O2 HRP·H2O2 HRP·H2O2+DH2 HRP+D+2H2O6、鏡下控制:（七）顯色觀察1、陽性細胞數(shù)2、陽性反應(yīng)強度 3、表達型4、陽性分級5、必須設(shè)對照6、假陽性反應(yīng)：1.固定不當(dāng)或固定時間過長2.抗體效價過低3.其他試劑久置4.切片過薄或過厚5.組織儲存過久6.組織中抗體

9、被粘稠基質(zhì)、分泌物或多層細胞膜阻隔7、假陰性反應(yīng)：1.固定不當(dāng)或固定時間過長2.抗體效價過低3.其他試劑久置4.切片過薄或過厚5.組織儲存過久6.組織中抗體被粘稠基質(zhì)、分泌物或多層細胞膜阻隔（八）免疫組化應(yīng)用的范圍1、腫瘤組織起源上進行診斷2、發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶3、腫瘤生長活躍程度的判斷4、激素受體檢測以指導(dǎo)臨床治療5、激素類細胞的定位、定性，以進一步確定內(nèi)分泌細胞的類型和功能狀態(tài)6、指導(dǎo)腫瘤分期7、指導(dǎo)腫瘤預(yù)后的判斷（癌基因、抗原性）8、免疫性疾病的輔助診斷常用間葉性標記物1.所有間充質(zhì)細胞 波形蛋白（Vimentin,VIM）2.內(nèi)皮細胞 第八因子相關(guān)抗原（Factor related ant

10、igen,F- Rag,F8） 荊豆凝集素（Ulex europaeus lectin,REA-1）3.組織細胞 溶菌酶（Lysozyme,muramidase,LYS） 1- 抗胰蛋白酶（1-antitrupsin,AAT） 1- 抗糜蛋白酶（1 antichumotruosin,AACT間葉組織間質(zhì)標記物.纖維連結(jié)蛋白（Fibronectin,FN）2.基板蛋白（Laminin）3.骨連結(jié)蛋白（Osteonectin,ON）4.、和型膠原（Collagen、 ）間葉組織間質(zhì)標記物1.結(jié)蛋白（Desmin,DMS）2.肌動蛋白（Actin）3.肌球蛋白（Myosin）4.肌紅蛋白（Myogl

11、obin,MG）5. 肌酐激酶BB和MM（Creatinine kinase BB&MM）6.Z-蛋白（Z-protein）淋巴造血組織標記物1.白細胞共同抗原（Leucocyte common antigen,LCA,CD45）；2.免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）輕鏈（、）重鏈（、）；3.全B細胞單克隆抗體：CD19（B4）、CD20（B1）、CD22（Leu14）、L26；4.全T細胞單克隆抗體：CD2（OKT11,Leu5）、CD3（OLT3,Leu4）、CD5（OKT1,Leu1）、CD7（Leu9）、UCHL1;5.T細胞亞群單克隆抗體：CD4（OKT4,L

12、eu3）、CD8（OKT8,Leu2）;6.單核-巨噬細胞抗體：MAC387,LYS;7.其他：TdT、CD10（CALLA）、CD15（Leu M1）、CD30（Ki-1，Ber H2）、HLA-DR、Leu7常用的上皮性標記物1.角蛋白（Keratin,KER;Cytokeratin,CK ）2.上皮（細胞）膜抗原（Epithelial membrane antigen,EMA）3.癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen,CEA）4.包殼蛋白（Involucrin）5.橋粒蛋白（Desmosomal proteins）中樞和周圍神經(jīng)標記物1.膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial

13、 fibrillary acdic protein,GFAP）；2.神經(jīng)微絲蛋白（Neurofilament proteins,NFP）；3.S100蛋白（S100 protein, S100）；4.髓磷脂堿性蛋白（Myelin basic protein,MBP）；5.Leu7；6.神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neuron specific enolase,NSE）。神經(jīng)內(nèi)分泌細胞系統(tǒng)一般性標記物1.神經(jīng)原特異性烯醇化酶（NSE）2.嗜鉻顆粒蛋白（Chromogranin A,CHG-A）3.嗜鉻顆粒膜蛋白（Chromomembrin B,CHM-B）4.突觸囊泡蛋白（Synaptophysin,

14、SY ）5.Leu7激素標記物1.垂體激素：促腎上腺皮質(zhì)素（ACTH）、生長素（GH）、泌乳素（LTH）、促甲狀腺素（TSH）、促卵泡成熟素（FSH）、黃體生成素（LH）2.胰島細胞、胃腸道和呼吸道激素：胰島素（Insulin）、胰高血糖素（Glucagon）、胰多肽（Pancreatic polypeptide,PP）、生長抑素（Somatostatin）、胃泌素（Gastrin）、血管活性腸多肽（Vasoactive intestinal peptide,VIP）、5-羥色胺（Serotonin）、蛙皮素（Bombesin）、降鈣素（Calcitonin）和ACTH等3.其他：甲狀腺素（T

15、3、T4）、腎上腺素和去甲腎上腺素、絨毛膜促性腺激素（hCG）。器官特異性抗原的標記物1.前列腺特異性抗原（Prostate specific antigen,PSA）2.前列腺酸性磷酸酶（Prostate acid phosphatase,PAP）3.甲狀腺球蛋白（Thyroglobulin,TGB）4.乳酪蛋白（Casein）5.乳白蛋白（Lactalbumin）6.胰淀粉酶（Pancreatic amylase）瘤胚性抗原標記物1.癌胚抗原（CEA）2.甲胎蛋白（1-etoprotein,AFP）第二部分 診斷病理學(xué)及其應(yīng)用 診斷病理學(xué)的形成、發(fā)展及其研究方法一、病理學(xué)發(fā)展簡史1、祖國病

16、理學(xué)發(fā)展情況： 祖國醫(yī)學(xué)形成和發(fā)展的依據(jù)是陰陽五行 學(xué)說。誕生了黃帝內(nèi)經(jīng)、諸病源候論、傷寒論等經(jīng)典大作，同時少數(shù)醫(yī)學(xué)家對尸體進行剖驗，以查明死因，澄清事實，所著書如：宋慈的洗冤錄、王清任的醫(yī)林改錯等。2、國外病理學(xué)發(fā)展： 古希臘在兩千多年前就進行尸體剖驗。18世紀出現(xiàn)了器官病理學(xué)(organ pathology)。19世紀出現(xiàn)了細胞病理學(xué)(cellular pathology)。20世紀以電子顯微鏡技術(shù)為支撐的超微結(jié)構(gòu)病理已經(jīng)建立。隨著邊緣學(xué)科的大量涌現(xiàn)和科技的飛速進步，在傳統(tǒng)病理學(xué)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了 許多新分支，如：免疫病理學(xué)（immunopathology）、分子病理學(xué)（molecular p

17、athology）、遺傳病理學(xué)（genetic pathology）、定量病理學(xué)（quantitative pathology）、遠程病理（ telepathology）和信息病理（pathological informatics）。診斷病理學(xué)分類：軟組織病理、淋巴網(wǎng)狀組織和骨髓病理、皮膚病理、口腔組織病理、消化系統(tǒng)病理、呼吸系統(tǒng)病理、心血管病理、泌尿系統(tǒng)病理、生殖系統(tǒng)病理、內(nèi)分泌系統(tǒng)病理、神經(jīng)系統(tǒng)病理、眼耳鼻咽喉病理、骨關(guān)節(jié)病理、細胞學(xué)病理等。鏡下觀察特殊染色二、病理學(xué)研究方法：肉眼觀察取材切片石蠟包埋 常規(guī)染色（H E）涂片或刷片 其它方法： 電鏡觀察 免疫組織化學(xué) 免疫熒光技術(shù) 相差顯微

18、技術(shù) 流式細胞術(shù) 圖像分析技術(shù) DNA重組技術(shù) 核酸分子雜交 原位雜交 激光共聚焦顯微技術(shù) DNA測定等 PCR 診斷病理學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域 診斷病理學(xué)與臨床醫(yī)學(xué) 病理診斷的重要性 造成病理診斷局限性的 主客觀因素 病理診斷常規(guī)方法 臨床病理送檢規(guī)范 病理醫(yī)生病理報告書寫規(guī)范 臨床病理討論會 診斷病理學(xué)與醫(yī)學(xué)科研 診斷病理學(xué)與新藥開發(fā)病理診斷的重要性® 診斷病理學(xué)同影像醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)并稱為臨床醫(yī)學(xué)的三大支柱學(xué)科。® 診斷病理學(xué)依靠病理學(xué)的理論和技術(shù)以及病理醫(yī)師長期積累的知識和經(jīng)驗，對病變組織和細胞進行大體和鏡下的直接觀察。病理檢查被稱為疾病診斷的“金標準”。® 正確認識

19、病理診斷的不足。（如必要時重新取材）造成病理診斷局限性的主客觀因素® 源自臨床方面的病理診斷方面局限性v 部分臨床醫(yī)生對病理診斷存在認識誤區(qū)v 部分臨床醫(yī)生對病理取材、固定和送檢的規(guī)范 要求存在知識空白或不夠重視病理診斷常規(guī)方法® 細胞學(xué)檢查v 體腔和自然管道內(nèi)的細胞v 通過離心漿膜腔積液、腦脊液或刷取、刮取、加壓沖洗自然管道內(nèi)的細胞® 活體組織檢查v 術(shù)后大體標本v 為確定疾病取得小活檢® 尸體剖驗 (圖）臨床醫(yī)生病理送檢規(guī)范® 活檢病理標本及痰液取材規(guī)范v 在可疑的病灶取材v 在病灶與正常組織的交接處垂直取材，不要在病灶表面水平取材v 內(nèi)鏡

20、取材組織塊要大一些v 手術(shù)切除的標本和淋巴結(jié)應(yīng)全部送檢v 腫瘤累及器官或組織的根治性手術(shù)，要盡量摘除引流區(qū)域的淋巴結(jié)全部送檢v 盡量避免鉗夾對組織造成的擠壓v 采集痰液要讓患者在清晨起床后，先行漱清食物殘渣和口腔唾液，棄去喉頭的頭兩口痰，把呼吸道深部的痰液咳出后送檢® 病理申請單填寫規(guī)范® 標本的固定及送檢規(guī)范v 常規(guī)送檢的標本一般用10中性福爾馬林固定v 送檢的標本應(yīng)盡快固定v 所有送檢標本的容器或細胞涂片，均應(yīng)標明患者的姓名，同病理申請單一起送達病理醫(yī)生病理報告書寫規(guī)范® 肉眼所見改變® 鏡下改變® 病理診斷v 明確診斷v 傾向性診斷v 描

21、述性診斷臨床病理討論會® 臨床病理討論會（ clinical pathological conference,cpc)是臨床和 病理共同對臨床死亡病例的尸檢結(jié)果與生前診斷及治療過程進行對比分析，以汲取經(jīng)驗的專題學(xué)術(shù)會議。診斷病理學(xué)與醫(yī)學(xué)科研® 目前醫(yī)學(xué)科研中，能作為客觀證據(jù)的有三類：檢驗學(xué)證據(jù)、影像學(xué)證據(jù)、病理形態(tài)學(xué)證據(jù)® 在體實驗（動物試驗）® 離體試驗（組織、細胞培養(yǎng)）診斷病理學(xué)與新藥開發(fā)® 按照國家藥品注冊管理辦法的規(guī)定，新藥研究過程分為兩個階段：臨床前研究階段、臨床研究階段。® 臨床前研究階段包括藥學(xué)研究和藥理毒理研究 ，這主

22、要是通過動物實驗來完成的。第三部分 組織芯片技術(shù)及其應(yīng)用組織微陣列（tissue microarray,TMAs）又稱組織芯片（tissue chip），是將數(shù)十個、數(shù)百個乃至上千個細小組織片整齊地排列在某一載體上而成的縮微組織切片。適于同時分析大量不同腫瘤或同一腫瘤不同臨床病理分期的存檔石蠟標本。一、組織微陣列/芯片的原理及其構(gòu)建基本XXX過程：（1）收集病例及相關(guān)蠟塊，切片做H.E染色，復(fù)合診斷，選擇有關(guān)區(qū)域在玻片上作標記；（2）在受體蠟塊上打孔；（3）借助玻片上的標記找準受體蠟塊上的相應(yīng)部位，打孔采集組織芯；（4）將組織芯轉(zhuǎn)移到受體蠟塊上的相應(yīng)部位，打孔采集組織芯。（5）對組織芯片蠟塊切

23、片：需要一套切片輔助系統(tǒng)（膠膜、光膠玻片、紫外線燈等）。用特制儀器從許多不同腫瘤或同一腫瘤不同臨床病理分期病變組織蠟塊（供體蠟塊）中穿取微小組織樣品并精確地排列于同一石蠟塊（受體蠟塊）中，即構(gòu)建成了組織微陣列。常規(guī)連續(xù)切片即可用于DNA、RNA的原位雜交和蛋白質(zhì)免疫組化分析。目前用于科研的組織芯片多數(shù)是腫瘤組織芯片：（1）多腫瘤組織芯片（multitumor，TMA）由多種類型腫瘤組成，用于腫瘤基因篩選。（2）腫瘤進展組織芯片（progression，MTA）由不同發(fā)展階段的腫瘤組織組成，用于研究腫瘤不同發(fā)展階段的基因變化情況。（3）預(yù)后組織芯片（prgnostic，MTA）由治療前后的腫瘤組

24、織組成，用于尋找與治療和預(yù)后有關(guān)的指標。二、組織微陣列技術(shù)在腫瘤病理研究中的應(yīng)用及可行性評價1、構(gòu)建人體多腫瘤組織微陣列，對比研究多種腫瘤不同基因的表達。2、構(gòu)建同一腫瘤不同病理分期組織微陣列，研究其發(fā)生和演進過程。3、與cDNA微陣列結(jié)合，快速鑒別和進一步研究更多新的腫瘤相關(guān)基因。4、臨床腫瘤病理定性診斷。 可利用存檔石蠟塊構(gòu)建人體多類型腫瘤組織微陣列，并對它進行DNA、RNA及蛋白質(zhì)表達等不同層次的研究，以快速掃描多種不同惡性腫瘤的分子改編并進行對比分析。尤其適用于稀有類型腫瘤、微小原發(fā)腫瘤和微小轉(zhuǎn)移癌灶的分子研究，如：Schraml P等在研究中首次揭示了一例胚胎睪丸癌erb-B2擴增。 借助組織微陣列/芯片技術(shù)可將具有明確癌前病變的腫瘤及其癌前系列病變組織排列在同一陣列蠟塊上，連續(xù)切片，采用多種原位檢測方法平行觀察分析它們的分子生物學(xué)差異，為腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供科學(xué)依據(jù)。借助這一技術(shù)對同一組織起源腫瘤的不同組織學(xué)類型、不同分化程度以及不同人種之間進行多樣本分子生物學(xué)分析，是對以往僅限于流行病學(xué)資料分析的有益補充。 cDNA微陣