糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松模型大鼠實(shí)驗(yàn)生化研究分享

1、真誠(chéng)為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請(qǐng)指正。針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)糖皮質(zhì)激素造模骨質(zhì)疏松大鼠BMC、BMD及骨代謝影響的實(shí)驗(yàn)研究景濤1、2 賈葉1 成守仁2 盧小健2 （1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 210046； 2.南京體育學(xué)院醫(yī)院210014）摘要：目的 探討針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)糖皮質(zhì)激素造模骨質(zhì)疏松大鼠BMD、BMC及骨代謝影響的作用原理與機(jī)制。方法 選用3月齡雌性SD大鼠40只，體重170±10g,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、藥物組、針?biāo)幗M，每組10只。各組大鼠連續(xù)造模和治療12周后，掃描測(cè)得大鼠腰椎BMC和BMD，并用放免法檢測(cè)血清E2、FSH、LH、CORT、ACTH、CRH的指標(biāo)水

2、平。結(jié)果 模型組大鼠BMC、BMD明顯低于空白對(duì)照組和治療組 (P<0.01)，說(shuō)明骨質(zhì)疏松模型XXX成功；針?biāo)幗Y(jié)合組腰椎BMC、BMD與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，與藥物組比較有顯著性差異(P<0.05)；模型組和藥物組血清E2、FSH、LH、CORT、ACTH、CRH均低于空白對(duì)照組和針?biāo)幗Y(jié)合組， (P<0.05)。結(jié)論 采用針?biāo)幗Y(jié)合療法優(yōu)于單一的藥物組的療效；對(duì)糖皮質(zhì)性骨質(zhì)疏松癥有良好的預(yù)防性治療作用。關(guān)鍵詞：針?biāo)幗Y(jié)合；糖皮質(zhì)激素；骨質(zhì)疏松；生化檢測(cè)Experimental Study on BMD、BMC and bone metabolism

3、of Glucocorticoid-induced Osteoporosis in rats model Influenced by Acupuncture-Drug combination treatment(Tao Jing1、2 Yelan Liu1 ,1. Nanjing University of Chinese Medical, First Clinical Medical College 210046; 2. Nanjing sport institute Hospital , 210014,Nanjing , China)顯示對(duì)應(yīng)的拉丁字符的拼音 字典 - 查看字典詳

4、細(xì)內(nèi)容Abstract: Purpose To investigate the role principles and mechanism of the combination of acupuncture with drug on prevention of glucocorticoid-induced osteoporosis. Methods Selected 3-month-old female SD rats 40, weight 170 ± 10g,randomly divided into normal group, model group, the drug grou

5、p, needle drug group, each group of experimental rats were 10.After 12 weeks of treatment and modelling, all rats were scanned by DEXA for BMC and BMD on lumbar spine, and using RIA to detect target level of E2、FSH、LH、CORT、ACTH、CRH in the serum of rats. Results Model rats lumbar spine bone mineral d

6、ensity, bone content decreased significantly, significantly lower than the normal group and treatment group, there were significant differences (P <0.01), indicating the successful of model of osteoporosis. Compared with normal group, the BMC and BMD on rat-lumbar spine of the acupuncture-drug co

7、mbination group was no significant difference (P> 0.05). but there were significant differences between acupuncture-drug combination group and drug group (P <0.05). In the Model group and drug group, the target level of E2、FSH、LH、CORT、ACTH、CRH in the serum of rats were significantly lower than

8、 normal group and the group with acupuncture-drug(P <0.05).4 / 4Conclusion Acupuncture combined with drug therapy is better than a single group of drug in efficacy, and would be the proper preventive treatment on Glucocorticoid-induced Osteoporosis. Keyword：acupuncture-drug combination；glucocorti

9、coids-induced ；osteoporosis；biochemical testing 基金項(xiàng)目：江蘇省高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究課題資助（KJA200503）XXX簡(jiǎn)介：景濤（1978-），男，江蘇江都人，博士研究生，主治醫(yī)師、主管中藥師，研究方向：骨關(guān)節(jié)疾病與運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷的防治。 糖皮質(zhì)激素( glucocorticoids，GCS)復(fù)雜的藥理作用決定了其副作用的多樣性和嚴(yán)重性。美國(guó)近期的社區(qū)調(diào)查顯示，總?cè)丝诘?. 2% 0. 5%使用GCS，超過(guò)50%的GCS使用者出現(xiàn)骨量丟失并導(dǎo)致骨折。英國(guó)一項(xiàng)大型回顧性研究顯示約0.9%的成人(計(jì)409000)曾使用GCS，其中約93000人GC

10、S劑量> (相當(dāng)于強(qiáng)的松) 7.5mg/d。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)發(fā)展到一個(gè)很高的水平，但對(duì)于因激素治療所帶來(lái)的副作用仍然沒(méi)有很好的防治手段。GCS治療可以引起多種不良反應(yīng)，其中糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥(glucocortiocoids-induced osteoporosis，GIO)可以導(dǎo)致椎體、肋骨、髖部等多個(gè)部位骨折，嚴(yán)重影響了患者生活質(zhì)量并增加社會(huì)負(fù)擔(dān)，是GCS的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，目前尚無(wú)有效的治療手段1、2。筆者在以往的臨床研究中發(fā)現(xiàn)針灸對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥有明顯的治療效果，為探討糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的機(jī)制以及有效的干預(yù)措施，筆者進(jìn)行了針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松模型的研究。1.

11、材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD清潔型雌性大鼠40只，由上海萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)SCXK（滬）2003-0003。 1.2藥物 阿倫膦酸鈉片（石家莊制藥集團(tuán)歐意藥業(yè)XXX。產(chǎn)品批號(hào)：009060301）：有效期：2012.03.26。地塞米松磷酸鈉注射液(江蘇漣水制藥XXX。產(chǎn)品批號(hào)：E090725)：有效期：2012.05.30。1.3試劑盒(1).美國(guó)ADL goat antirat Adrenocorticotropic Hormone Elisa測(cè)定試劑盒（Catalog No：ADL CD-A011 Lot No：RT110371有效期：JUN 2012）。(2).皮質(zhì)醇放射

12、免疫分析藥盒50T×1 批號(hào)：20101101。(3).雌二醇放射免疫分析藥盒50T×1 批號(hào)：20101101。(4).卵巢促激素放射免疫分析藥盒50T×1 批號(hào)：20101029。(5).促黃體生成激素放射免疫分析藥盒50T×1 批號(hào)：20101029。1.4 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及儀器(1)三級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室（醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境為鼠類實(shí)驗(yàn)室，清潔級(jí)，合格證書23-0 1 6，南京中醫(yī)藥大學(xué)提供）。 (2).美國(guó)產(chǎn)lead-tech型超低溫冰箱(3).美國(guó)GE公司產(chǎn)LUNAR DPX-MD+型雙能X線骨密度儀(4).德國(guó)產(chǎn)Labsystems Finnp

13、ipette 50、100l型移液器(5).HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器XXX）(6).芬蘭產(chǎn)Thermo Multiskan Spectrum spectrophotometer型酶標(biāo)儀(7).sn-695B型 智能放免測(cè)量?jī)x（上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠） 2方法 2.1動(dòng)物分組 將40只SD清潔型雌性大鼠觀察1周后，隨機(jī)分為四組：空白對(duì)照組、模型組、藥物組、針?biāo)幗Y(jié)合組，每組各10只。2.2動(dòng)物造模 將40只雌性大鼠隨機(jī)分為四組：空白對(duì)照組、模型組、藥物組、針?biāo)幗Y(jié)合組，每組各10只。各組動(dòng)物均在1824通風(fēng)良好，濕度在60-70%的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。（1）空白對(duì)照組： 同時(shí)

14、每日用注射器灌胃生理鹽水（灌胃劑量為：1ml）。（2）模型組： 每周2次肌肉注射地塞米松，每次注射量為：0.2mg/100g，連續(xù)用藥12周。同時(shí)，每日用注射器灌胃生理鹽水（灌胃劑量為：1ml）。（3）藥物組： 每周2次肌肉注射地塞米松，每次注射量為：0.2mg/100g，連續(xù)用藥12周，同時(shí)采用灌胃法給予阿倫膦酸鈉片劑的水溶懸濁液每日灌胃次，每次10mg/kg，連續(xù)用藥治療12周。（4）針?biāo)幗Y(jié)合組： 除采用藥物組的造模和藥物治療方法外，同時(shí)每天接受電針治療1次。其具體方法為：選用下三里穴位，取穴方案按照華興邦氏的方法實(shí)施，用細(xì)美容針刺入穴位后，接電針儀進(jìn)行電針刺激，連續(xù)脈沖波、頻率3-4Hz

15、、強(qiáng)度4-5mA，以動(dòng)物局部輕度抖動(dòng)為度，每次10分鐘，每日1次，連續(xù)治療12周。每2周為1個(gè)電針療程，暫停電針治療1次。各組大鼠造模和治療12周后，摘除眼球取血，分離血清，置于-20冰箱保存集中待測(cè)。2.3檢測(cè)指標(biāo)2.3.1骨密度檢測(cè)： 大鼠處死前1天，用DEXA骨密度儀及所附小動(dòng)物梯級(jí)標(biāo)準(zhǔn)模型和分析軟件在其腰椎體進(jìn)行掃描，得出大鼠腰椎的骨密度（BMD）和骨含量（BMC）。( 注：大鼠BMD、BMC掃描部位L3 )2.3.2生化指標(biāo)測(cè)定促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）測(cè)定 首先，測(cè)定前將試劑盒放置室溫40分鐘，所有試劑在使用前都輕輕搖勻； 準(zhǔn)備濃縮洗滌液與新鮮

16、的醫(yī)用雙蒸水（1：20倍稀釋），混勻后室溫放置待用。取出酶標(biāo)板，依照次序?qū)?yīng)分別加入100l的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中（不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品移液時(shí)，采用不同的吸頭）；分別標(biāo)記樣本編號(hào)，加入100l 血清于空白微孔中（不同的樣本采用不同的吸頭）；在標(biāo)準(zhǔn)品孔中和樣品孔中加入50l的酶標(biāo)記溶液，用移液器反復(fù)吸打，進(jìn)行混勻（不同的微孔取液采用不同的吸頭）；輕微搖動(dòng)酶標(biāo)板，使得液體充分混勻，用保險(xiǎn)膜密封酶標(biāo)板，然后置于37的水浴鍋中準(zhǔn)確水浴60分鐘。然后將酶標(biāo)板取出，將其中的液體甩去，每個(gè)孔中全部加滿洗滌應(yīng)用液后，立即甩去液體；每個(gè)孔中再次全部加滿洗滌應(yīng)用液后，室溫靜置2分鐘，其間每隔20-30秒輕微振搖酶標(biāo)板。

17、2分鐘后將孔中的洗滌應(yīng)用液甩去，在吸水紙上將酶標(biāo)板拍干。再重復(fù)第個(gè)步驟6次；在吸水紙上將酶標(biāo)板底部上殘留的水漬擦干；在每個(gè)孔中加入底物A 50l（不同的微孔取液采用不同的吸頭）；在每個(gè)孔中加入底物B 50l（不同的微孔取液采用不同的吸頭），用移液器反復(fù)吸打，進(jìn)行混勻；輕微振搖酶標(biāo)板，然后在37水浴鍋中避光反應(yīng)15分鐘（酶標(biāo)板置于鋁制飯盒中進(jìn)行反應(yīng)）；每個(gè)微孔中加入50l的終止液，（不同的微孔取液采用不同的吸頭），用移液器反復(fù)吸打，進(jìn)行混勻；在Thermo Multiskan Spectrum spectrophotometer酶標(biāo)儀上，450nm處測(cè)定OD。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備： 以B/T計(jì)算NSB

18、、S0結(jié)合百分率，以B/B0計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)及待測(cè)樣品結(jié)合百分率，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并查出樣品值?；蛴勺詣?dòng)計(jì)數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣本濃度。NSB（NSB管的cpm數(shù)÷T管的cpm數(shù)）×100Bo（Bo管的cpm數(shù)NSB管的cpm數(shù)）÷T管的cpm數(shù)×100BBo（標(biāo)準(zhǔn)或樣品管的cpm數(shù)NSB管的cpm數(shù)）÷（Bo管的cpm數(shù)NSB管的cpm數(shù)）×100以Logit=ln（B/B0）/（1-（B/B0）為橫坐標(biāo)，ln濃度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。皮質(zhì)醇（CORT）雌二醇（E2）、卵巢促激素（FSH）、促黃體生成

19、激素（LH）放射免疫測(cè)定 操作步驟（直接取大鼠血清100ul進(jìn)行測(cè)定），操作步驟（直接取血清50l進(jìn)行測(cè)定）充分混勻，室溫放置15min后， 43500rpm離心15min，吸棄上清液，在計(jì)數(shù)器上測(cè)定各管沉淀的放射性計(jì)數(shù)cpm。2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)均使用SPSS11.5版統(tǒng)計(jì)軟件處理，檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)（± S）表示，多組間差異的顯著性采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)），用student-newman-kruls法進(jìn)行組間的兩兩比較。3結(jié)果 31骨密度（BMD）檢測(cè) 表1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腰椎體的BMD對(duì)比（± S；n=10）Tab.1 Comparison of BMD

20、on lumber（L3）of vertebra of experimental rats in groups（± S; n=10）g/cm2 組別 第3腰椎體（g/cm2） 針?biāo)幗M 0.369±0.0165* 藥物組 0.317±0.0130* 模型組 0.237±0.0154 空白組 0.395± 0.0121# 說(shuō)明：12周治療后，第3腰椎體BMD與模型組比較：*P<0.O5， *P< 0.O1，#P< 0.O1。32骨含量（BMC）檢測(cè)表2 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腰椎體的BMC對(duì)比（± S）；n=10）Tab.2 Co

21、mparison of BMC on lumber（L3）of vertebra of experimental rats in groups（± S; n=10）g 組別 第3腰椎體（g） 針?biāo)幗M 1.1653±0.01124*藥物組 0.8125±0.01023*模型組 0.6204±0.00965 空白組 1.2435±0.00874 說(shuō)明：12周治療后，第3腰椎體BMC與模型組比較： *P<0.O5， *P< 0.O1，#P< 0.O1。33生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表3 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下丘腦-垂體-腎上腺軸生化數(shù)據(jù)對(duì)比（

22、7; S；n=10）Tab.3 Comparison of Hypothalamus-pituitary-adrenal axis and biochemical data of experimental rats in groups(± S; n=10) 組別 ACTH(U/L) CRH(U/L) COR(U/L) 針?biāo)幗M 221.0506±11.6745* 335.6025±28.4848* 33.7382±2.2340*藥物組 135.3699±12.3160* 222.3524±22.9331* 20.4013±3.

23、5334*模型組 129.4078±11.1736 219.9035±21.0757 21.9413±1.6793空白組 255.9196±10.1114 381.1612±20.9531 38.0228±2.0068 說(shuō)明：12周治療后的ACTH指標(biāo)，與模型組比較*P>0. O5；*P< 0. O1，#P<0.01。CRH指標(biāo)，與模型組比較*P>0. O5；*P< 0. O1，#P<0.01。COR指標(biāo)，與模型組比較*P>0. O5；*P< 0. O1，#P<0.01。表4 各組

24、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下丘腦-垂體-性腺軸生化數(shù)據(jù)對(duì)比（± S；n=10）Tab.4 Comparison of Hypothalamus-pituitary-gonadal axis and biochemical data of experimental rats in groups(± S; n=10） 組別 E2(mmol/l) FSH(mmol/l) LS(mmol/l) 針?biāo)幗M 19.5802±1.1875* 1.1543±0.1402* 9.8151±0.5447*藥物組 14.2168±1.7802* 0.6402±0.0

25、680* 6.0449±0.3130*模型組 13.9652±2.1476 0.6832±0.0480 5.6773±0.2996空白組 23.3444±1.8817 1.5042±0.1272 11.3307±0.3220 說(shuō)明：12周治療后的E2指標(biāo)，與模型組比較*P>0. O5；*P< 0. O1，#P<0.01。FSH指標(biāo)，與模型組比較*P>0. O5；*P< 0. O1，#P<0.01。LS指標(biāo)，與模型組比較*P>0. O5；*P< 0. O1，#P<0.01。

26、4討論隨著對(duì)骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)研究的深入，動(dòng)物模型成為研究OP發(fā)病機(jī)制、臨床防治的有效手段。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生原因十分復(fù)雜，目前認(rèn)為與遺傳、營(yíng)養(yǎng)、生活習(xí)慣、激素、運(yùn)動(dòng)、機(jī)械負(fù)荷和多種細(xì)胞因子有關(guān)。這就對(duì)骨質(zhì)疏松癥的動(dòng)物模型提出了嚴(yán)格的要求3、4。合適的動(dòng)物模型有3個(gè)必需考慮的要點(diǎn)：(1)方便性(Convenience)：動(dòng)物購(gòu)買容易，價(jià)格便宜，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。(2)相關(guān)性(Relevance)：與人體條件有相似關(guān)聯(lián)及組織行為相似之處，研究獲得的信息能與人體的規(guī)律有同一性。(3)適宜性(Appropriateness)：但要求某種動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥模型在各個(gè)方面

27、完全與人類骨質(zhì)疏松癥的臨床表現(xiàn)一致是很困難的，因此建立一種其組織行為的改變?cè)谌祟惞琴|(zhì)疏松癥中所檢測(cè)到的結(jié)果相匹配的動(dòng)物模型是最基本的研究方法5、6、7。臨床上單純應(yīng)用西藥治療GIO，效果并不理想。這是因?yàn)镚IO是一個(gè)全身性的、系統(tǒng)性的涉及多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)、且相互之間影響的復(fù)雜病變，而非單純線性因果關(guān)系8。在采用針對(duì)一些病變環(huán)節(jié)應(yīng)用西藥治療的基礎(chǔ)上，加上中醫(yī)的整體調(diào)節(jié)性治療，就可以克服單純應(yīng)用西藥治療的不足?；诖耍覀冮_(kāi)展了在給實(shí)驗(yàn)性大鼠阿倫膦酸鈉灌胃治療的基礎(chǔ)上，配合中醫(yī)針灸治療糖皮質(zhì)性骨質(zhì)疏松癥的研究。由于客觀條件和時(shí)間所限，本實(shí)驗(yàn)是造模和治療同時(shí)進(jìn)行的，旨在觀察針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)于GO性O(shè)P的預(yù)防

28、性治療作用。但從造模12周后各組第3腰椎體BMD、BMC來(lái)看，針?biāo)幗Y(jié)合組腰椎的BMD/BMC平均值接近正常對(duì)照組(P>0.05)， 優(yōu)于藥物組；與針?biāo)幗Y(jié)合組比較，模型組的BMD、BMC水平最低（P<0.05）。上述針?biāo)幗Y(jié)合組與模型組和藥物組之間的BMD、BMC顯著的差異可以說(shuō)明，針灸可能通過(guò)對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，而促進(jìn)局部環(huán)境中許多細(xì)胞因子等一系列極為復(fù)雜地改變，并通過(guò)對(duì)機(jī)體全身性、多環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，而增加性腺上雌激素的受體敏感性或雌激素的受體數(shù)量；從而最終影響骨組織的微環(huán)境而提高成骨細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境微量元素的平衡，促進(jìn)礦物質(zhì)在骨中的沉積，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，糾正骨代謝

29、的負(fù)平衡狀態(tài)，防止了骨質(zhì)的進(jìn)一步丟失，進(jìn)而發(fā)揮抗OP的作用。 在本研究中，針刺后E2、FSH、LH的水平提高，可能就是通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦垂體性腺軸功能的作用來(lái)提高卵巢中未完全閉鎖的卵泡以及垂體雌激素受體的基因表達(dá)及雌激素活性，進(jìn)而促進(jìn)了睪酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化，從而使血清中E2水平得到提高的。同時(shí)針刺后CORT、ACTH、CRH的水平提高，亦可能是通過(guò)下丘腦垂體腎上腺皮質(zhì)腺軸的功能來(lái)發(fā)揮作用的。正因如此筆者認(rèn)為上述6種激素在各組所存在的差異也可能與針?biāo)幗Y(jié)合治療組運(yùn)用針刺進(jìn)行預(yù)防性治療，進(jìn)而在調(diào)節(jié)下丘腦垂體腎上腺皮質(zhì)腺軸的同時(shí)又參與調(diào)節(jié)下丘腦垂體性腺軸的功能有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在一定程度上支持了這一說(shuō)法。參考文獻(xiàn)：1 National Osteoporosis Foundation Physicians guide to prevention and treatment of osteoporosis copyright NOF,Washington DC.2008. 2 Midori N,Nobuyuki U,Sachiko M ,et al. Osteoprote-gerin regulate bone formation through a coupling mechanis