試論mTOR和eIF4E蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

1、試論mTOR和eIF4E蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義 【摘要】目的 研究真核翻譯啟動因子eIF4E(eukaryotic initiation factor 4E)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin , mTOR)在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和其對應(yīng)的臨床病理之間相互關(guān)系，尋找在大腸癌的發(fā)生、進(jìn)展過程中eIF4E及mTOR的作用；研究兩者之間的有無關(guān)系。方法 外科手術(shù)中獲取大腸癌組織及癌旁組織各60例（要求手術(shù)患者在手術(shù)前未進(jìn)行全身化療、放療及其他治療），采用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)及酶聯(lián)免疫法檢測大腸癌組織及癌旁組織中mTOR和eIF4E

2、基因的RNA水平和蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果 1、分別用RT-PCR法和酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果顯示：大腸癌組織中mTOR和eIF4E基因的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。mTOR和eIF4E基因RNA表達(dá)與性別、年齡、臨床TNM分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，在不同腫瘤分化程度以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.相關(guān)性分析顯示mTOR和eIF4E在大腸癌中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P0.05)。結(jié)論 mTOR和eIF4E基因的過度表達(dá)在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，mTOR和eIF4E基因的表達(dá)與大腸癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有相關(guān)性;聯(lián)合檢測兩者在大

3、腸癌中的表達(dá)可能有助于惡性程度的評估與預(yù)后判斷?！娟P(guān)鍵詞】 大腸癌 mTOR eIF4E 職稱論文大腸癌是發(fā)生于大腸部位的常見的消化道惡性腫瘤，居于消化道道腫瘤的第3位。mTOR 信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的生存信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,該通路的激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、逃避凋亡、耐藥及血管生成密切相關(guān)1。 哺乳動物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin , mTOR)和真核細(xì)胞翻譯起始因子(eukaryotic initiation factor 4E)是mTOR 信號通路中的兩個(gè)重要的分子2，3。本實(shí)驗(yàn)擬觀察試圖通過收集大腸癌及癌旁組織中對mTOR 信號通路的mTOR、eI

4、F4E兩個(gè)基因的檢測，更進(jìn)一步完善對大腸癌組織的早期診斷和預(yù)后判斷提供一個(gè)新的思路。1對象與方法1.1 研究對象收集2010年l0月至2012年6月來自烏海市第三人民醫(yī)院的結(jié)腸癌根治術(shù)后癌及癌旁標(biāo)本各60例其中男28例、女32例，年齡2280歲，按全國結(jié)直腸癌協(xié)作組1986年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類，其中高分化l6例，中分化26例，低分化18例，TNM分期、期分別為13、23和24例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。1.2 實(shí)驗(yàn)方法按一步Trizol法 提取樣本組織的RNA：按說明書配制20ul的RT反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請?jiān)诒线M(jìn)行）。 1 Total RNA用量為1ug。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37 15 mi

5、n ， 85 5 sec 按說明書配制50ul的PCR反應(yīng)液，94 30sec ，56 * 15sec ，25Cycle72 30sec 。設(shè)循環(huán)25個(gè),實(shí)驗(yàn)采用GAPDH片段作為內(nèi)參照。mTOR、eIF4E、GAPDH引物采用Oligo軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由invitrogen公司合成（具體序列見表一）。取PCR產(chǎn)物5ul，加5xLoading Buffer 2ul，2%瓊脂糖凝膠電泳 110V，100mA，25min，凝膠成像儀成像并保存結(jié)果。表1 PCR引物詳細(xì)序列：1.3 按酶聯(lián)免疫法（ELISA）試劑盒說明書檢測mTOR,eIF4E基因蛋白表達(dá) 計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值，計(jì)算出

6、標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算。最終濃度為實(shí)際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，兩組以上比較采用方差分析，相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析法分析。以SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果RT-PCR、Elisa法檢測大腸癌及癌旁組織mTOR、eIF4E基因RNA水平的表達(dá)和蛋白表達(dá)結(jié)果一致。結(jié)果顯示：大腸癌mTOR、eIF4E基因表達(dá)量結(jié)果一致，癌組織明顯高于癌旁組織，差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）（見圖1，2，表2，4）。相對應(yīng)

7、內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)無差異（見圖3）。大腸癌組織中mTOR、eIF4E基因表達(dá)與年齡、性別、TNM分期無關(guān)(P0.05)，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05)（詳見表3,5）。mTOR基因和eIF4E基因相關(guān)性分析：60例大腸癌標(biāo)本RT-PCR法檢測mTOR基因和eIF4E基因灰度值相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)處理后結(jié)果為：r=0.892，P0.05，二者呈明顯正相關(guān)性。同樣用Elisa法檢測mTOR基因和eIF4E基因OD值相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)處理后結(jié)果為：r=0.563，P0.05，二者呈明顯正相關(guān)性圖-1，2，3mTOR基因 、eIF4E基因 、GAPGH內(nèi)參 RT-PCR電泳圖表格 2 RT-P

8、CR法大腸癌及癌旁組織mTOR和eIF4E基因總RNA表達(dá):(n=60，)注：*P0.01 VS 癌旁組表3 eIF4E和mTOR基因RNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系注：P1為mTOR基因，P2為eIF4E基因表格 4 Elisa法檢測大腸癌及癌旁組織mTOR、eIF4E基因蛋白水平的表達(dá)結(jié)果（n=60，）。.注：*P0.01 VS 癌旁組表5 eIF4E和mTOR基因蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 注：P1為mTOR基因，P2為eIF4E基因 3 討論結(jié)直腸癌是目前最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率表現(xiàn)為明顯上升趨勢。目前結(jié)直腸癌的主要根據(jù)Dukes分期或TNM 分期兩種分期方法來

9、進(jìn)行預(yù)后的估計(jì)，治療方案的選擇也是主要根據(jù)此分期系統(tǒng)進(jìn)行的。多基因和多因素的共同作用可能是導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生、以及進(jìn)展的因素。其中各種致癌的因素和環(huán)境的因素通過協(xié)同、序貫的方法導(dǎo)致細(xì)胞局部可復(fù)性的DNA傷害；進(jìn)一步促發(fā)原癌基因的激活、抑癌基因的滅活，以及凋亡基因、凋亡抑制基因功能的改變，引起腫瘤細(xì)胞的惡性生長。目前許多學(xué)者認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮相當(dāng)重要作用兩個(gè)因素是細(xì)胞的化生和腫瘤周邊微血管生成。本研究通過RT一PCR和酶聯(lián)免疫法等方法，分別從RNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)檢測大腸癌及正常組織中mTOR基因的表達(dá)，結(jié)果顯示：mTOR基因RNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)無論是在大腸癌組織還是正常組

10、組織中表現(xiàn)為高度一致性，大腸癌癌組織中mTOR基因呈現(xiàn)出過度表達(dá)，但是在于正常大腸組織中mTOR表達(dá)微弱，與上述有關(guān)參考文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。mTOR基因的RNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)在兩組中均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。mTOR基因的表達(dá)量與年齡、性別、TNM分期無關(guān)(P0.05)，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05)。由此思考本研究可以在大腸癌的診斷及相關(guān)預(yù)后判斷上提供一定的參考價(jià)值。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶聯(lián)免疫法兩種方法分別檢測RNA水平和蛋白表達(dá)水mTOR和eIF4E基因在大腸癌組織及正常組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示：mTOR和eIF4E基因在大腸癌組織中同時(shí)過度表達(dá)，呈明顯正相關(guān)，與此同

11、時(shí)，mTOR和eIF4E基因在大腸癌旁組織中同時(shí)低表達(dá)或者表達(dá)缺失，同樣呈明顯正相關(guān)。說明mTOR的過度激活導(dǎo)致了eIF4E的表達(dá)上調(diào)，從而可能成為大腸癌的形成的關(guān)鍵原因之一。有上述結(jié)果可以大膽猜想，同時(shí)抑制mTOR和eIF4E基因的表達(dá)及其相關(guān)生物性活性極有可能成為預(yù)防和或治療大腸癌的有效途徑之一，本實(shí)驗(yàn)為創(chuàng)新大腸癌的治療提供一個(gè)新的思路以及一點(diǎn)相應(yīng)的生物學(xué)依據(jù)。mTOR信號通路主要通過兩種信號通路調(diào)控細(xì)胞的生長和增殖：PI3K/Akt依賴型途徑和PI3K/Akt非依賴型途徑。被激活后的mTOR可以調(diào)節(jié)其兩條處于下游的通路：核糖體S6蛋白激酶)和真核細(xì)胞始動因子4E 結(jié)合蛋白1(4EBP1)

12、。目前4EBPl 和S6K1 是最深入研究的mTOR 的底物，它們是蛋白翻譯的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。其中4EBP1 是mTOR 的第一個(gè)下游底物，是一種翻譯抑制因子，它通過與翻譯啟動因子4E(eIF4E,eukaryotic translation initiation factor4E)的結(jié)合而抑制翻譯啟動抑制蛋白翻譯。正常情況下，eIF4E和其抑制物4E-BPs的結(jié)合形成復(fù)合物，從而不能觸發(fā)帽依賴性翻譯;而激活后的mTOR使其下游引物4EBPs磷酸化后,導(dǎo)致eIF4E和4EBPs的分離,從而解除對翻譯的抑制作用 ?？赡苁悄[瘤形成的原因之一。 4 結(jié)論mTOR和eIF4E的異常表達(dá)在大腸癌的發(fā)生、發(fā)

13、展中起重要作用，mTOR和eIF4E的表達(dá)與大腸癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān);聯(lián)合檢測兩者在大腸癌中的表達(dá)有助于惡性程度的評估與預(yù)后判斷。參考文獻(xiàn)1 LazaLffskaratzas A，S Kathleen，Sonenberg N：Malignant transformation by an eukaryotic initiation factor subunit that binds to mRNA 5capNature 1990，345：5447Marotrigianl J，Gingras AC，Sonenberg N，Burley SK：Cocrystal structure of

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