細(xì)胞色素C在4_5_二氮芴_9_酮修飾玻碳電極上的直接電化學(xué)研究_圖文

1、細(xì)胞色素C 在4,52二氮芴292酮修飾玻碳電極上的直接電化學(xué)研究尹起范31,2韓文霞2朱玉蘭1徐繼明1魏科霞1史昆波11(淮陰師范學(xué)院化學(xué)系,江蘇省低維材料化學(xué)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,淮安2233002(延邊大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系,延吉133002摘要采用循環(huán)伏安法探討了細(xì)胞色素C (Cyt C 在4,52二氮芴292酮(dafo 修飾玻碳電極表面的電化學(xué)行為。結(jié)果表明,Cyt C 在daf o 修飾電極上呈現(xiàn)一對(duì)峰形較好且準(zhǔn)可逆的氧化還原峰,其式電位(E 0為13mV,峰電流與掃描速度呈線性關(guān)系,該電極過程是表面控制過程,電化學(xué)反應(yīng)效率常數(shù)(k s 為0.89/s 。固定在daf o上的Cyt C 能促

2、進(jìn)H 2O 2的催化還原,響應(yīng)快速而靈敏(<10s ,峰電流與H 2O 2濃度在5.0×10-63.0×10-4mol/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系;檢出限2.5×10-6mol/L;米氏常數(shù)為1107mmol/L,顯示出較好的親和力。關(guān)鍵詞細(xì)胞色素C,4,52二氮芴292酮,修飾電極,直接電化學(xué)2008207204收稿;2008208219接受本文系國(guó)家自然科學(xué)基金(No .20671038、江蘇省教育廳自然科學(xué)基金(No .06KJB150011和江蘇省低維材料化學(xué)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No .JSKC07049資助項(xiàng)目3E 2mail:yinqf19491引

3、言近年來,生物大分子(酶和蛋白質(zhì)與電極表面之間的直接電子傳遞引起了電化學(xué)工作者的廣泛關(guān)注1。細(xì)胞素C (Cyt C 是一種含血紅素的金屬蛋白質(zhì)分子,在生命體內(nèi)擔(dān)負(fù)著電子傳遞的功能,因而研究其在電極上的直接電化學(xué),對(duì)于了解生命體內(nèi)的能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)代謝具有重要的意義2。但由于Cyt C 的電活性中心被包埋在多肽鏈中,阻礙了蛋白質(zhì)電活性中心與電極的直接電子轉(zhuǎn)移3。為了能有效地實(shí)現(xiàn)Cyt C 在電極表面的電子轉(zhuǎn)移,需要在電極表面修飾一層或在溶液中加入Cyt C 直接電子轉(zhuǎn)移的促進(jìn)劑4。近年來,相關(guān)的研究取得了一定的進(jìn)展5,但利用鄰菲啰啉衍生物(dafo 作Cyt C 直接電子轉(zhuǎn)移的促進(jìn)劑尚未見報(bào)道。本

4、研究將daf o 作為玻碳電極的修飾劑,探討了Cyt C 的直接電子轉(zhuǎn)移行為和固定在dafo 上的Cyt C 對(duì)H 2O 2的催化還原性能。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑CH I 660B 電化學(xué)工作站(CH I,US A ,三電極工作系統(tǒng):Cyt C /dafo 修飾的玻碳電極(=3mm 為工作電極,鉑片電極為對(duì)電極,飽和甘汞電極(SCE 為參比電極;UV /V is 916紫外2可見分光光度計(jì)(G BC,Australia ;FTI R 2AVAT AR 360傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)N icolet 公司。Cyt C (美國(guó)Sig ma 公司未經(jīng)進(jìn)一步提純直接使用,daf o 按文獻(xiàn)6合成

5、;0.1mol/L KH 2P O 42Na 2HP O 4(P BS 緩沖液(pH =6.80,其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次亞沸蒸餾水。2.2Cyt C /dafo /GC 修飾電極的制備將玻碳電極(GCE,=3mm 用0.05m 2A l 2O 3粉拋光,洗去表面污物,分別在無水乙醇和二次亞沸蒸餾水中超聲清洗2m in,自然晾干。用微量注射器將5L 0.05mol/L daf o 乙醇溶液滴涂在電極表面,室溫下溶劑揮發(fā)后,再滴加5L 2g/L Cyt C 溶液(pH 6.8P BS 形成Cyt C /daf o /GC 修飾電極。修飾電極用二次亞沸蒸餾水沖洗兩次,除去吸附不牢的C

6、yt C 。所得的修飾電極于4冰箱中保存。2.3Cyt C 及Cyt C /dafo 的紫外2可見和紅外光譜表征UV 2V is 測(cè)試:將Cyt C 和Cyt C /daf o 溶液分別置入1c m 比色皿中,分別以pH 6.8P BS 和P BS 2乙醇(31溶液為參比,波長(zhǎng)范圍200450n m 。I R 測(cè)試:將dafo 溶液滴涂在玻璃板上,涼干,在Cyt C 溶液中第37卷2009年1月分析化學(xué)(FE NX I HUAXUE 研究簡(jiǎn)報(bào)Chinese Journal of Analytical Che m istry 第1期9598浸泡24h,再用水沖洗掉附著在daf o 表面的Cyt

7、C,室溫下晾干后所得的復(fù)合膜與K B r 壓片進(jìn)行測(cè)定。3結(jié)果與討論3.1紫外2可見光譜和FT 2I R 光譜圖1A 為Cyt C 及Cyt C /dafo 的紫外2可見光譜。Cyt C (a 和Cyt C /daf o (b 的吸收峰分別在408.0和407.6n m ,僅偏移0.4n m 。該偏移可能緣于Cyt C 與daf o 的相互作用。這種作用并未Cyt C 結(jié)構(gòu)和Cyt C 與daf o 的微環(huán)境,說明dafo 具有良好的生物兼容性,可用于蛋白質(zhì)在電極上的固定材料。Cyt C 與daf o 的I R 光譜見圖1B 。圖1B (a 是純Cyt C 的I R 譜,吸收峰為1656和15

8、62c m -1;(c 是純daf o 的I R 譜,吸收峰為1717c m -1(C O ,1590c m -1(C N ;(b 是Cyt C /daf o I R 譜,從圖1B (b 可見,除了daf o 本身的紅外吸收(譜線3,還出現(xiàn)了Cyt C 的吸收峰,為1653和1562c m -1,Cyt C在圖1B 中(a,b 兩者對(duì)應(yīng)的吸收峰幾乎一致,說明固定在daf o 表面的Cyt C 二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有改變7。圖1細(xì)胞色素C 的UV 譜圖(A 和I R 圖(B Fig .1UV s pectra of Cyt C (A and I R s pectra of Cyt C (B a .Cytc

9、hr ome C (Cyt C ;b .Cyt C /52dizazfluorene 292one (daf o ;c .4,52diazafluorene 292one (daf o 。3.2Cyt C 在dafo 修飾玻碳電極上的直接電化學(xué)行為采用循環(huán)伏安法研究了Cyt C (pH 6.80.1mol/L P BS 溶液,掃速為60mV /s 在兩種電極上的電化學(xué)行為(圖2。從圖2可見,在+0.3-0.3V 范圍內(nèi),裸電極(a 和daf o 修飾電極(b 均沒有響應(yīng),當(dāng)在dafo 修飾電極上滴涂5L 2g/L Cyt C 溶液時(shí),出現(xiàn)了一對(duì)穩(wěn)定的氧化還原峰(c ,電位分別為圖2裸玻碳電極(

10、a 、daf o 修飾玻碳電極(b 和Cyt C /dafo /G C (c 的C V 圖Fig .2C V of bare G C (a ,daf o /GCE (b and Cyt C /daf o /GCE (c electr ode -0.028V 和0.054V (vs .S CE ,電位差為82mV,式電位E 0=(E pa +E pc /2=13mV,與文獻(xiàn)8報(bào)道相近,說明dafo能夠促進(jìn)Cyt C 的直接電子轉(zhuǎn)移。陰極峰與陽極峰電流之比i pa /i pc 1,表明該電極反應(yīng)為準(zhǔn)可逆單電子轉(zhuǎn)移過程。這是由于在pH 6.8的P BS 溶液中,daf o 分子中氮原子的富電性與Cy

11、t C 帶正電荷的一端發(fā)生了靜電結(jié)合,縮短了Cyt C 血紅素與電極之間的距離,從而加快了電子的傳遞速度。3.3掃描速度對(duì)峰電流的影響在掃速為20100mV /s 范圍內(nèi),電位隨著掃速不同而變化(見圖3A ;峰電流隨著掃速的增加而增大,且與掃速成正比(見圖3B ,表明電極反應(yīng)是典型的表面控制過程。3.4電極反應(yīng)速率常數(shù)由3.2節(jié)得本體系的nE P =82mV,根據(jù)Lavir on 理論9(準(zhǔn)可逆過程,n E P <200mV ,對(duì)于=0.5,n E p 與m -1的關(guān)系見表1,得m -1=2.89。根據(jù)Lavir on 公式:k S =m nFv /RT ,計(jì)算得電極反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)速率常數(shù)k

12、S =0.89s -1,大于有序的中孔氧化鈮膜(0.28s -110和NaY 沸石(0.78±0.04s -111。3.5Cyt C /dafo /GC 電極對(duì)H 2O 2的電催化氧化通過循環(huán)伏安法研究了daf o /GC 和Cyt C /dafo /GC 修飾電極對(duì)H 2O 2的催化行為(圖4。從圖4a 可見,在含有0.4mmol/L H 2O 2的P BS 溶液中(pH 6.8,daf o /GC 修飾電極對(duì)H 2O 2無催化作用。圖4b 69分析化學(xué)第37卷圖3(A Cyt C /daf o /GCE 在不同掃描速度下的CV 圖;(B 電流與掃速變化曲線Fig .3Typ ic

13、al C V of Cyt C /dafo /GC electr ode at different scan rates (A and the peak currentdependence on the scan rate v (B 表1=0.5,n E P (mV 與m -1的關(guān)系Table 1Relati onshi p of nE P (mV with m -1when =0.5m -10.50.751 1.52 2.53 3.545nE P (mV 18.827.034.848.861.272.282.491.8100.6116.2m -167891011121314nE P (mV

14、130142.4153.8164173.4182190197.6204.6圖4daf o /GCE 在含0.4mmol/L H 2O 2P BS 中的CV 圖(a 、Cyt C /dafo /GCE 在無H 2O 2時(shí)的C V 圖(b 、Cyt C /daf o /GCE 在0.4mmol/L H 2O 2P BS 中的C V 圖(c Fig .4C V of dafo /GCE in the p resence of 0.4mmol/L H 2O 2(a ,C V of Cyt C /dafo /GCE in the absent of H 2O 2(b and C V of Cyt C /

15、dafo /GCE in the p resence of 014mmol/L H 2O 2(c scan rate:0.1V /s .和圖4c 顯示了Cyt C /daf o /GC 修飾電極在加入H 2O 2前后的循環(huán)伏安圖。從圖4可見,當(dāng)加入0.4mmol/L H 2O 2后,-0.20V 處的還原峰電流明顯增大,而氧化峰電流減小,顯示出明顯的電催化作用。因此,選擇-0.20V (vs .SCE 作為檢測(cè)電勢(shì),研究Cyt C 對(duì)H 2O 2的催化作用。在不斷攪拌的10.0mL pH 6.8的P BS 溶液中連續(xù)加入2.0L圖5連續(xù)加入2.0L 0.1mol/L H 2O 2的i 2t 曲

16、線圖,插圖為催化電流與H 2O 2濃度的關(guān)系曲線圖Fig .5A typ ical current 2ti m e res ponse curve of succes 2sive of H 2O 2t o P BS at a given potential of -0.20V 0.1mol/L H 2O 2溶液,用計(jì)時(shí)安培法得到電流2時(shí)間響應(yīng)曲線(圖5。由圖5可見,該電極對(duì)H 2O 2的響應(yīng)快速而靈敏(<10s ,電極的安培響應(yīng)與H 2O 2濃度在5.0×10-63.0×10-4mol/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系;檢出限為2.5×10-6mol/L,可用于H 2O

17、 2的測(cè)定。溶液中可能的干擾物質(zhì)或其它電活性基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響均很小,背景電流也被降到很低水平,可以認(rèn)為催化峰是由于Cyt C 與H 2O 2之間相互作用的結(jié)果。機(jī)理如下:H 2O 2+Cyt C (Fe 2+=H 2O +Cyt C (Fe 3+(1Cyt C (Fe3+e =Cyt C (Fe 2+(2根據(jù)L ine weaver 2Burk 方程式:1/I SS =1/I max +K app m /I max C 12,求得M ichaelis 2Menten 常數(shù)為K app m=1107mmol/L,說明Cyt C /daf o /GC 電極上的Cyt C 對(duì)H 2O 2有較好的親和

18、力(圖5內(nèi)插圖。3.6干擾實(shí)驗(yàn)在0.4mmol/L H 2O 2存在下,對(duì)一些常見的可能產(chǎn)生干擾的物質(zhì)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明0.2mol/L 的抗壞血酸、多巴胺,1.0mmol/L 的Cl -、NO -3、CO 2-3、A l 3+、Na +等對(duì)H 2O 2的測(cè)定無影響。3.7修飾電極的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性使用同一支修飾電極在同一溶液中,平行測(cè)定7次,峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%。將電極置于79第1期尹起范等:細(xì)胞色素C 在4,52二氮芴292酮修飾玻碳電極上的直接電化學(xué)研究89分析化學(xué)第37卷空氣中,晾干保存,定期測(cè)試。結(jié)果表明,Cyt C/daf o/GCE電極均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性,保存

19、(冰箱中430d后,CV響應(yīng)仍可達(dá)到95%。References1Gooding J J,W ibowo R,L iu J Q,YangW,Losic D,O rbons S,Mearns F J,Shap ter J G,H ibbert D B.J.Am.Che m.Soc.,2003,125:900690072Oellerich S,W ackerbarth H,H ildebrandt P.J.Phys.Che m.,B,2002,106:656665803Heller A.A cc.Che m.Res.,1990,23:1281344W ang Sheng2Fu(王升富,Du Dan

20、(杜丹,Cai Huo2Cao(蔡火操,Zhang B i2Cheng(張必成.Chinese J.A nal.Che m.(分析化學(xué),2001,29(11:128812915Zhou Bo(周波,Sun Run2Guang(孫潤(rùn)光,W ang L i2Hua(王麗華,Song Shi2Hua(宋世華,Fan Chun2Hai(樊春海.Progress in Che m istry(化學(xué)進(jìn)展,2006,18(7/8:100910136Henders on L J,Fr onczek F R,Cherry W R.J.Am.Che m.Soc.,1984,106:587658797Sun D,C

21、ai C X,L i X W,Lu T.J.Electroanal.Che m.,2004,566:4154218Chen H J,W ang Y L,Dong S J,W ang E K.Electroanalysis.,2005,17:180118059Lavir on E.J.E lectroanal.Che m.,1979,101:192810Xu X,Tian B Z,Kong J,Zhang L S,L iu B H,Zhao D Y.A dv.M ater.,2003,15:1932193611Dai Z,L iu S,Ju H.Electrochi m.A cta,2004,4

22、9:2139214412Ka m in R A,W ils on G S.A nal.Che m.,1980,52:11981205D i rect Electroche m i ca l Behav i or of Cytochrom e CI mm ob ili zed on4,52D i a zafluorene292one M od i f i edGl a ssy Carbon ElectrodeYI N Q i2Fan31,2,HAN W en2Xia2,ZHU Yu2Lan1,XU J i2M ing1,W E I Ke2Xia1,SH I Kun2Bo11(J iangsu K

23、ey L aboratory for Che m istry of L o w2D i m ensional M aterials,D epart m ent of Che m istry Huaiyin Teachers College,Huaian2233002(D epart m ent of Che m istry,Science College,Yanbian U niversity,Yanji133002AbstractThe direct electr oche m ical behavi or of cyt ochr o me C(Cyt Ci m mobilized on4,

24、52diazafluorene292 one(daf omodified glassy carbon electr ode was investigated by cyclic volta mmetry(CV.The results show that a pair of well2defined quasi2reversible redox peaks of Cyt C was obtained at Cyt C/daf o/GCE based enzy me electr ode by the direct electr on transfer bet w een the p r otein and the electr ode.The peak current was linearly dependent on the scan rate,which indicated that the direct electr oche m ical ch