增強(qiáng)免疫力功能評價(jià)方法及修訂說明

1、附件1:增強(qiáng)免疫力功能評價(jià)方法（征求意見稿）保健食品評價(jià)試驗(yàn)項(xiàng)目、試驗(yàn)原則及結(jié)果判定Items, Prin ciples and Result Assessme nt1試驗(yàn)項(xiàng)目動物實(shí)驗(yàn)1.1.1 體重臟器/體重比值測定：胸腺/體重比值，脾臟/體重比值細(xì)胞免疫功能測定：小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)體液免疫功能測定：抗體生成細(xì)胞檢測，血清溶血素測定單核一巨噬細(xì)胞功能測定：小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光 微球?qū)嶒?yàn)細(xì)胞活性測定2試驗(yàn)原則所列的指標(biāo)均為必做項(xiàng)目分為正常動物實(shí)驗(yàn)方案和免疫功能低下模型動物實(shí)驗(yàn)兩種方案，可任選其一進(jìn)行實(shí)驗(yàn).采用免疫功能低下動物模型實(shí)驗(yàn)方案時(shí)需做外周血白

2、細(xì)胞總數(shù)測定3結(jié)果判定采用正常動物實(shí)驗(yàn)，受試樣品具有增強(qiáng)免疫力作用。在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能及NK細(xì)胞活性四個(gè)方面測定中，任兩個(gè)方面試驗(yàn)結(jié)果為陽性，可以判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力 作用。其中細(xì)胞免疫功能測定項(xiàng)目中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性， 判定細(xì)胞免疫功能 試驗(yàn)結(jié)果陽性。體液免疫功能測定項(xiàng)目中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性， 判定體液免 疫功能試驗(yàn)結(jié)果陽性。單核一巨噬細(xì)胞功能測定項(xiàng)目中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性，判定單核一巨噬細(xì)胞功能試驗(yàn)結(jié)果陽性。NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)的一個(gè)以上劑量結(jié)果陽性，判定NK細(xì)胞活性結(jié)果陽性。正常動物實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行四個(gè)方面的測定。采用免疫功能低下動物實(shí)驗(yàn)，受試樣

3、品對免疫功能低下者具有增強(qiáng)免疫力作用。在免疫功能低下模型成立條件下，血液白細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞免疫功能、體液免 疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能及 NK細(xì)胞活性五個(gè)方面測定中，任兩個(gè)方面試驗(yàn) 結(jié)果為陽性，判定該受試樣品對免疫功能低下者具有增強(qiáng)免疫力作用。其中細(xì)胞免疫功能測定項(xiàng)目中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性，或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性，可判定細(xì)胞免疫功能試驗(yàn)結(jié)果陽性。 體液免疫功能測定項(xiàng)目 中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽性，或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性，可判定體液 免疫功能試驗(yàn)結(jié)果陽性。單核一巨噬細(xì)胞功能測定項(xiàng)目中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陽 性，或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性，可判定單核一巨噬細(xì)胞功能試驗(yàn)結(jié)果 陽

4、性。NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)的一個(gè)以上劑量結(jié)果陽性，可以判定 NK細(xì)胞活性結(jié) 果陽性。血液白細(xì)胞總數(shù)測定的二個(gè)以上劑量結(jié)果陽性， 可以判定血液白細(xì)胞總 數(shù)結(jié)果陽性。免疫功能低下模型動物實(shí)驗(yàn)至少需進(jìn)行三個(gè)方面的測定。同時(shí)在各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，任何一項(xiàng)測試都不出現(xiàn)加重免疫抑制劑作用的結(jié)果。增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)方法Method for the Assessment of Enhancing Immune Function1. 原理：免疫系統(tǒng)主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴組織和全身各處的淋巴細(xì) 胞、抗原呈遞細(xì)胞等，還包括血液中的白細(xì)胞。淋巴細(xì)胞經(jīng)血液和淋巴使各 處的淋巴器官和淋巴組織連成一個(gè)功能整體。胸腺屬中央淋

5、巴器官，主要功能 是確保T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟。外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性細(xì) 胞；脾臟對抗原發(fā)生免疫應(yīng)答作用，脾竇的巨噬細(xì)胞具有清除功能，脾白髓含有 記憶B細(xì)胞，產(chǎn)生對T依賴抗原的體液免疫應(yīng)答。淋巴細(xì)胞是特異性免疫應(yīng)答的 主要細(xì)胞群，按其表面標(biāo)志物，分為 T細(xì)胞、B細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞（NK三大 類，T細(xì)胞又分為CD4 （Th）細(xì)胞和CD8T淋巴細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞后 能合成和釋放抗原特異抗體，所有抗體都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋 白分子都具有抗體功能。免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生特異性免疫和非特異性免疫功能，檢測 上述免疫系統(tǒng)的各種代表性指標(biāo)的改變可對增強(qiáng)免疫力作用的功能做出相應(yīng)

6、判定。2. 實(shí)驗(yàn)動物選擇推薦用近交系小鼠，如 C57BL/6J、BALB/C等，68周齡，1822g （ BALB/C 種可16-18g），單一性別，雌雄均可，每組 1015只。3. 劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和1個(gè)陰性對照組。以人體推薦量的10倍為其中一個(gè)劑 量，另設(shè)二個(gè)劑量組。必要時(shí)設(shè)陽性對照組。選做免疫低下模型法時(shí)，應(yīng)設(shè)模型 對照組。受試樣品給予時(shí)間四周或 30天。4 免疫功能低下動物模型可選用環(huán)磷酰胺、氫化可的松或其他合適的免疫抑制劑進(jìn)行藥物造模。造模原理：環(huán)磷酰胺主要通過DNA烷基化破壞DNA的合成而非特異性地殺傷淋巴細(xì) 胞，并可抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化；環(huán)磷酰胺對B細(xì)胞的抑

7、制比T細(xì)胞強(qiáng)，一般對體液 免疫有很強(qiáng)的抑制作用，對NK細(xì)胞的抑制作用較弱。氫化可的松主要通過與相應(yīng)受體結(jié)合成復(fù)合物后進(jìn)入細(xì)胞核，阻礙NF-k B進(jìn)入細(xì)胞核，抑制細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)的合成和釋放， 達(dá)到免疫抑制目的。氫化 可的松還可損傷漿細(xì)胞，抑制巨噬細(xì)胞對抗原的吞噬、處理、和呈遞作用，所以 氫化可的松對細(xì)胞免疫、體液免疫和巨噬細(xì)胞的吞噬、NK作用都有一定的抑制作用。免疫抑制劑劑量選擇環(huán)磷酰胺可選擇40mgT kg，腹腔注射，連續(xù)兩天，末次注射給藥后第 5天 測定各項(xiàng)指標(biāo)；氫化可的松可選擇 40mg/kg，肌內(nèi)注射，隔天一次，共 5次， 末次注射給藥后次日測定各項(xiàng)指標(biāo)。各指標(biāo)對兩種模型敏感性不同，

8、環(huán)磷酰胺模型比較適合抗體生成細(xì)胞檢測、血清溶血素測定、白細(xì)胞總數(shù)測定；氫化可的松模型比較適合遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、 碳廓清實(shí)驗(yàn)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)、NK細(xì)胞活性測定，建議根據(jù)不同的免疫功能指標(biāo)選擇合適的模型。受試物給予連續(xù)給予受試物4周或30天，在第3周后開始給予免疫抑制劑，進(jìn)行模型 與預(yù)防性給藥相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)。5.實(shí)驗(yàn)方法血液白細(xì)胞數(shù)測定小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)檢測方法 （儀器法）全血用EDTA K2抗凝后經(jīng)血細(xì)胞分析儀檢測，可測定白細(xì)胞數(shù)量，并可對白細(xì)胞進(jìn)行分分類計(jì)數(shù)。儀器和材料乙二胺四乙酸二鉀(EDTA K2 2H2O,),離心管，全血細(xì)胞分析儀上樣管， 眼科鑷子，振蕩器，加樣

9、槍，冷凍離心機(jī)，全血細(xì)胞分析儀。實(shí)驗(yàn)步驟試劑配制血液抗凝：EDTAK2能與血液中的鈣離子結(jié)合成為螯合物，從而阻止血液凝固，的EDTA K可阻止1ml血液凝固?？鼓齽┡渲疲悍Q量8mgEDTA K2加純凈水至100ml制成抗凝劑，50 1抗凝 劑可抗凝1ml小鼠全血。5.1.2.2 采血以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干凈無菌的眼科鑷子摘取小鼠一側(cè)或 雙側(cè)眼球，讓血液自由滴入裝有抗凝劑的離心管(或商品化的抗凝管)中，采血 過程中不斷混勻血液與抗凝劑防止血液凝固，每只動物采集抗凝全血約1ml。檢測分析上機(jī)前血液顛倒混勻，注意檢查是否存在凝塊。在24h內(nèi)以全血細(xì)胞分析儀 檢測白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)。

10、上機(jī)操作參照儀器說明書。數(shù)據(jù)分析一般采用方差分析，按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，p，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性意義；F值，PW，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊性要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若 變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試樣品組的白細(xì)胞總數(shù)顯著高于陰性對照組，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。Co nA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)可任選下列方法之一5.2.1 MTT 法521.1 原理當(dāng)T淋巴細(xì)胞受ConA刺激后發(fā)生母細(xì)胞增殖反應(yīng)，活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞

11、通過線粒體水解酶將MTT（ 種淡黃色的唑氮鹽）分解為蘭紫色結(jié)晶而顯色，其 光密度值能反映細(xì)胞的增殖情況。5.2.1.2 儀器和材料RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-巰基乙醇（2-ME）、青霉素、鏈霉素、 刀豆蛋白A （Co nA、鹽酸、異丙醇、MTT Ha nk's液、PBS緩沖液（）紗布、200目篩網(wǎng)、24孔培養(yǎng)板，96孔培養(yǎng)板（平底），手術(shù)器械、大號注 射器內(nèi)芯、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)、超凈工作臺、高壓滅菌器、 無菌濾器。5.2.1.3 實(shí)驗(yàn)步驟521.3.1 試劑配制完全培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)液過濾除菌，用前加入10%小牛血清，1 %谷 氨酰胺（200m

12、mol/L）,青霉素（100U/mL），鏈霉素（100ug/L、及 5X 10一5mol/L 的2-巰基乙醇，用無菌的1mol/L的HCI或1mol/L的NaOH調(diào)pH至，即完全培 養(yǎng)液。Co nA液 用雙蒸水配制成100ug/mL的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱（-20 C） 保存。無菌Hank's液 用前以的無菌NaHCO調(diào)。MTT液 將5mgMT溶于1mL的PBS中，現(xiàn)配現(xiàn)用。酸性異丙醇溶液96mL異丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl,臨用前配制。5.2.1.3.2 脾細(xì)胞懸液制備無菌取脾，置于盛有適量（3-5ml、無菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置 一塊紗布，用大

13、號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng) 過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10min （1000r/min ）。然后將細(xì)胞懸浮于 2mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)脾細(xì)胞，或用臺酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95鳩上）,調(diào)整細(xì)胞濃度為3X 106個(gè)/mL。52133 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL 孔加75卩I ConA液（相 當(dāng)于卩g/mL）,另一孔作為對照，置5%CO, 37C CO孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束 前4h,每孔輕輕吸去上清液，加入不含小牛血清的RPMI164C培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT（5mg/mL 50卩l(xiāng) /

14、孑L,繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL酸性異丙 醇，超聲震蕩（2秒）或人工吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔分裝3孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570nm波長測 定光密度值。也可將溶解液直接移入 2mL比色杯中，分光光度計(jì)上在波長 570nm 測定OD值。5.2.1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊， 計(jì)算F值，F(xiàn)值< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P < ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求

15、后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用加Co nA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能 力，受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。5.2.1.5 注意事項(xiàng)ConA的濃度很重要，濃度過低不能刺激足夠的細(xì)胞增殖，濃度過高會抑制 細(xì)胞增殖，不同批號的ConA在實(shí)驗(yàn)前要預(yù)試，以找到最佳濃度。5.2.2 XTT 法5.2.2.1 原理由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水，且溶解甲臜的有機(jī)溶劑有毒 性，可選擇XTT法替代MTT法。其原理是：XTT是二甲氧唑黃，在電子耦合試劑 存在的情況下

16、，活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶可將黃色的 XTT還原成水溶性的橘黃色的甲臜，生成的甲臜能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，不形成顆粒，可直接用酶聯(lián)免疫 檢測儀檢測定吸光值。522.2實(shí)驗(yàn)步驟脾細(xì)胞懸液制備同MTT法；淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)：調(diào)整細(xì)胞濃度為 5X 107,取細(xì)胞懸液100 1分別加入 96孔培養(yǎng)板中，一孔加510卩I Co nA液，另一孔作為對照，設(shè) 2個(gè)平行孔， 置37C 5%CO飽和濕度孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h,向各孔中加入2050 1 的XTT工作液（按試劑盒說明現(xiàn)用現(xiàn)配），孵育4小時(shí)。用酶標(biāo)儀在450nm波長 處檢測每孔的光密度。5.2.2.3 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按

17、方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊， 計(jì)算F值，F(xiàn)值< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P < ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用加Co nA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能 力，受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。5.2.2.4 注意事項(xiàng)細(xì)胞濃度及培養(yǎng)時(shí)間在實(shí)驗(yàn)前要預(yù)試，以找到最佳效果。溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記酶聯(lián)免疫吸附測

18、定法 （BrdU-ELISA法）5.2.3.1 原理T 淋巴細(xì)胞在有絲分裂原ConA等的刺激下產(chǎn)生增殖反應(yīng)，BrdU可競爭摻入 到增殖細(xì)胞中新合成的DNA鏈內(nèi)，將BrdU標(biāo)記的細(xì)胞作為抗原結(jié)合到固相載體 表面，加入酶連接的抗-BrdU抗體，使BrdU抗原與酶標(biāo)抗體充分結(jié)合，抗原抗 體復(fù)合物與底物作用后產(chǎn)生有色物質(zhì)，其光密度可反映細(xì)胞增殖的程度。5.2.3.2 儀器和材料低溫離心機(jī)，全自動酶標(biāo)儀、超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、96孔培養(yǎng)板（平底）、倒置顯微鏡、移液器、手術(shù)器械、200目篩網(wǎng)、細(xì)胞活性分析儀；RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白 A （ConA、Hank&

19、#39;s液、PBS 緩沖液（）、BrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒（ELISA）、純凈水、終止液。523.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.2.3. 試劑配制完全培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)液過濾除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨 酰胺（200mmol/L）,青霉素（100U/mL）,鏈霉素（100卩 g/L、及 5X 10一5mol/L 的2-巰基乙醇，用無菌的1mol/L的HCI或1mol/L的NaOH調(diào)pH至，即完全培 養(yǎng)液。ConA液 用雙蒸水配制成100ug/mL的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱（-20 C） 保存。無菌Hank's液 用前以的無菌NaHCO調(diào)。BrdU標(biāo)記液 將標(biāo)記劑（試劑盒）按1:

20、 100的比例加到培養(yǎng)液中混勻，現(xiàn) 配現(xiàn)用?？贵w貯存液（母液）在Anti-BrdU-POD （試劑盒）中加雙蒸水充分混合， 存于-20 C備用?？贵w工作液 每100卩1抗體母液加10ml抗體稀釋液（試劑盒），現(xiàn)配現(xiàn)用。洗液 每10ml清洗緩沖液（試劑盒）加100ml雙蒸水。5.2.3. 脾細(xì)胞懸液制備無菌取脾，置于盛有適量無菌 Hank's液平皿中，并在脾上面放置一塊紗布， 用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10min （1000r/min ）。然后將細(xì)胞懸浮于2mL的完全 培養(yǎng)液中，用全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)脾細(xì)胞

21、， 或用臺酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù) （應(yīng) 在95鳩上），調(diào)整細(xì)胞濃度為2X107個(gè)/mL。5.2.3. 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，101/孔，每份細(xì)胞加2孑L，第1孔再加入 90卩11640培養(yǎng)液，第2孔加入85 11640培養(yǎng)液和卩1 ConA同時(shí)設(shè)3個(gè)空白 孔，每孔僅加100卩1 1640培養(yǎng)液，置5%CO 37C培養(yǎng)箱孵育72h，培養(yǎng)結(jié)束 前4 h加入BrdU標(biāo)記液，101/孑L，培養(yǎng)結(jié)束后離心（1000r/min,10min ）, 棄上清，吹干細(xì)胞，放4C冰箱保存待測。5.2.3. 酶聯(lián)免疫吸附測定每孔加2001固定液，常溫放置30min后，吸棄固定液。加入1001 BrdU

22、抗體工作液，37 T孵育60min；吸棄未結(jié)合的抗體，力卩250 1洗液洗3次，輕 拍移去洗液。加底物溶液（含 TMB 1001 /孑L,常溫孵育15min。用酶標(biāo)儀測 量吸光值，不加終止液時(shí)，測定發(fā)射波長為370nm（記為想。），參考波長492nm（記為A492）;加終止液時(shí)，測定發(fā)射波長為 450nm （記為應(yīng)。），參考波長690nm （記為 A690）o5.2.3.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定計(jì)算每孔標(biāo)記指數(shù)（LI ）， LI= （ A370- A空白370）- （Al92- A 空白 492 ）或 LI= （A 50- A空白450） - （A69（r A空白690）o用加Co nA孔的LI

23、值減去不加Co nA孔的LI值所得 的差值代表淋巴細(xì)胞的增殖程度。采用方差分析對標(biāo)記指數(shù)差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，按方差分析的程序先進(jìn)行方 差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<，則各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P < ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方 差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換， 待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù) 據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試樣品組的LI值差值顯著高于對照組的LI值差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 陽性。5.2.3.5 注意事項(xiàng)選擇有絲分裂原時(shí)ConA的濃度很重要，ConA的濃度過高會

24、產(chǎn)生抑制作用， 不同批號的ConA在實(shí)驗(yàn)前要預(yù)試，以找到最佳刺激分裂濃度。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是細(xì)胞免疫的體內(nèi)檢測法，當(dāng)致敏 T細(xì)胞再次與抗原接觸， 引起T細(xì)胞活化，釋放出多種細(xì)胞因子，致局部組織發(fā)生以單核細(xì)胞為主的炎癥 反應(yīng)，一般在2448h達(dá)高峰?？扇芜x下列方法之一試驗(yàn)。二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH（耳腫脹法）531.1 原理二硝基氟苯（DNFB稀釋液可與腹壁皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，由此刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞。47d后再將其涂抹于耳部進(jìn)行抗原攻擊， 使局 部腫脹，一般在抗原攻擊后2448h達(dá)高峰，其腫脹程度可以反映遲發(fā)型變態(tài)反 應(yīng)程度。5.3.1.2 材料DNFB、丙

25、酮、麻油、硫化鋇、打孔器。531.3 實(shí)驗(yàn)步驟試劑配制DNFBS液DNFB溶液應(yīng)新鮮配制，稱取DNFB50mg置清潔干燥小瓶中，將 預(yù)先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1: 1），倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠 布密封?；靹蚝螅?501注射器通過瓶蓋取用。5.3.1.3.2 致敏每鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約 3cmX 3cm用DNFB溶 液50 1均勻涂抹致敏。5.3.1.3.3 DTH的產(chǎn)生與測定5天后，用DNFB溶液10卩1均勻涂抹于小鼠右 耳（兩面）進(jìn)行攻擊。攻擊后 24h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔 器取下直徑8mm的耳片，稱重。5.3.1.4 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定一般采

26、用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊， 計(jì)算F值，F(xiàn)值< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P < ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用左右耳重量之差表示DTH的程度。受試樣品組的重量差值顯著高于與對照組的重量差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。531.5 注意事項(xiàng)：操作時(shí)應(yīng)避免DNFBW皮膚接觸。綿羊紅細(xì)胞（SRBC誘導(dǎo)小鼠DTH（足跖增厚法）532.1 原理SRBC可刺激T淋巴

27、細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞，4天后，當(dāng)再以SRBC攻擊時(shí)， 攻擊部位出現(xiàn)腫脹，其腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。5.3.2.2 儀器與材料游標(biāo)卡尺（精密度0.02mm、SRBC微量注射器（50卩I ）、足趾容積測量儀。5.323 實(shí)驗(yàn)步驟5.3.2.3.1 致敏 小鼠用2% （v/v）SRBC腹腔或靜脈免疫，每只鼠注射（約1X108個(gè) SRB）5.3.2.3.2 DTH 的產(chǎn)生與測定 免疫后4天，測量左后足跖部厚度或腫脹度， 然后在測量部位皮下注射20% （v/v）SRBC，每只鼠20卩l(xiāng) （約1X 108個(gè)SRBC， 注射后于24h測量左后足跖部厚度或腫脹度，同一部位測量三次，取平均值。測量方

28、法：用游標(biāo)卡尺測量肉眼讀數(shù)?；蛴米阒喝莘e測量儀進(jìn)行測量足跖部 腫脹度，操作方法按儀器操作指引進(jìn)行。5.3.2.4 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P < ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以攻擊前后足跖厚度或腫脹度的差值來表示DTH的程度。受試樣品組的差值顯著高于對照組的差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

29、陽性。532.5 注意事項(xiàng)前后兩次測量足跖厚度時(shí)，最好由專人來進(jìn)行?？ǔ呔o貼足跖部，但不要加 壓，否則會影響測量結(jié)果。攻擊時(shí)所用的SRB（要新鮮（保存期不超過1周）。抗體生成細(xì)胞檢測（改良法）5.4.1 原理溶血空斑試驗(yàn)是檢測產(chǎn)生IgM、IgG等抗體分泌細(xì)胞數(shù)體外試驗(yàn)法。用綿羊 紅細(xì)胞（SRBC免疫的小鼠脾細(xì)胞懸液與一定量的 SRBC昆合，在補(bǔ)體參與下， 使抗體分泌細(xì)胞周圍的SRBC溶解，形成肉眼可見的空斑。儀器和材料溶血空斑自動圖象分析儀、二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水浴、離心機(jī)、手術(shù)器械、200目篩網(wǎng)、SRBC補(bǔ)體（豚鼠血清）、Hank's液、RPMI1640培養(yǎng)液、SA緩沖液（GHMQ0

30、.46g, MgC2 0.1g, 0.2g, NaCI 8.38g, NaHCO0.252g and GHiNNaO0.3g,加蒸餾水至1000mL、滅菌生理鹽水、瓊脂糖。實(shí)驗(yàn)步驟：5.4.3.1 SRBC 綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中， 朝一 個(gè)方向搖動，以脫纖維，生理鹽水 2500rpm/min，15min，洗滌3次，制備壓積 SRBC放入4 C冰箱保存?zhèn)溆谩?.4.3.2 完全培養(yǎng)基的制備：新生小牛血清經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（v/v，5: 1）吸收， 4C, 30-60min后，加入不完全培養(yǎng)基 RPMI 1640中，制備成含20%、牛血清的 完全培養(yǎng)基。5.4.3.3 補(bǔ)體制

31、備 股動脈取血，靜置 30-60min，2500rpm/min，15min分離 血清，將5-10只豚鼠血清混合后，與壓積 SRBC以 5: 1 （v/v、比例混合，4C 冰箱放置30-60min，間或震蕩，2500rpm/min，15min分離血清，分裝，-80 °C冰 箱保存。用時(shí)以完全培養(yǎng)基1: 10 （v/v、比例稀釋。5.4.3.4 免疫動物壓積SRBC以生理鹽水制成2% （v/v、的細(xì)胞懸液（約1X 108個(gè)SRBC,每只鼠腹腔注射。543.5 脾細(xì)胞懸液制備將SRBC免疫4-5天后的小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾臟，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單

32、個(gè) 細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，1000rpm/min，10min,去上清，Hank'液洗2遍， 以完全培養(yǎng)基RPMI 1640制備成5X 1061X 107個(gè)細(xì)胞/mL的脾細(xì)胞懸液?？瞻叩臏y定5.4.3.6.1 底層培養(yǎng)基制備0.5g瓊脂糖加入100mL滅菌生理鹽水中，加熱溶解，待溫度于50E左右時(shí)，以1mL/孔的量加至六孔培養(yǎng)板中，瓊脂凝固后備用。54362 頂層培養(yǎng)基制備0.5g瓊脂糖加入100mLHank' s液中（），加熱溶 解，以試管的量加至46-50 C恒溫的試管中。5.4.3.6.3 鋪板：50 ul20%SRBQ生理鹽水配制，v/v ）、200卩1脾細(xì)胞懸液

33、先后加入含有頂層的試管中，迅速混勻，倒入六孔板中并鋪平頂層混合液， 每個(gè) 樣本做兩個(gè)平行孔。5.4.3.6.4 空斑測定：已制備好培養(yǎng)板放入 37C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h,然 后每孔加入500 1以完全培養(yǎng)基稀釋的補(bǔ)體（v/v，1: 10），繼續(xù)孵育2h，自 動圖象分析儀讀取溶血空斑圖象分析軟件計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。 取平行孔空斑數(shù)的平 均值為樣本的溶血空斑數(shù)值，以空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示。5.4.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P < ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對照組間均數(shù)

34、的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用空斑數(shù)/106脾細(xì)胞或空斑數(shù)/全脾細(xì)胞來表示，受試樣品組的空斑數(shù)顯著高于對照組的空斑數(shù)，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。血清溶血素的測定可任選下列方法之一。5.5.1 血凝法5.5.1.1 原理用SRBC免疫動物后，產(chǎn)生抗SRB(抗體(溶血素)，利用其凝集SRBC勺程度 來檢測溶血素的水平。5.5.1.2 儀器和材料SRBC、生理鹽水、微量血凝實(shí)驗(yàn)板、離心機(jī)5.5.1.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.5.1.3.1 SRBC綿羊頸靜脈

35、取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個(gè)方向搖動，以脫纖維，放入 4C冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。5.5.1.3.2 免疫動物及血清分離 取羊血，用生理鹽水洗滌 3次，每次離心 (2000r/min)10min。將壓積SRB(用生理鹽水配成2%(v/v )的細(xì)胞懸液，每只 鼠腹腔注射進(jìn)行免疫。45d后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固 血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心10min,收集血清。5.5.1.3.3 凝集反應(yīng) 用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置 于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi)，每孔100卩l(xiāng)，再加入100卩l(xiāng) % (v/v)的SRBCt液，混 勻，

36、裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于 37C溫箱孵育3h,觀察血球凝集程度。5.5.1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P < ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。血清凝集程度一般分為5級(0-W)記錄，按下式計(jì)算抗體積數(shù)，受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于對照組的抗體水平，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性?？贵w水平=(

37、S+2S+3SnS)式中1、2、3n代表對倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。0級 紅細(xì)胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀，四周液體清皙。I級紅細(xì)胞大部分沉集在孔底成園點(diǎn)狀，四周有少量凝集的紅細(xì)胞。U級 凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個(gè)疏松的紅點(diǎn)。 川級 凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個(gè)小紅點(diǎn)。W級 凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時(shí)成卷折狀。5.5.1.5 注意事項(xiàng)血清稀釋時(shí)要充分混勻。最后一個(gè)稀釋度應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。半數(shù)溶血值（HCq）的測定5.5.2.1 原理用SRBC免疫動物后，產(chǎn)生抗SRB（抗體（

38、溶血素），在補(bǔ)體參與下，與SRBC 一起孵育，可發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白，通過測定血紅蛋白含量反映動物血 清中溶血素的含量。5.5.2.2 儀器和材料分光光度計(jì)、全自動酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、96孔培養(yǎng)板、離心機(jī)、恒溫水浴、SRBC補(bǔ)體（豚鼠血清）、SA緩沖液（GHNO0.46g, MgC2O.1g, 0.2g, NaCl 8.38g, NaHCO0.252g and C8HNNaO0.3g,加蒸餾水至 1000mL、都氏試劑（碳 酸氫鈉1.0g、高鐵氰化鉀0.2g、氰化鉀0.05g，加蒸餾水至1000mL5.5.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟5.5.2.3.1 SRBC綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅

39、菌錐形瓶中朝一個(gè)方向搖動，以脫纖維，放入 4C冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。5.5.2.3.2 制備補(bǔ)體采集豚鼠血，分離出血清（至少 5只豚鼠的混合血清）， 將1mL壓積SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4C冰箱30min,經(jīng)常振蕩，離心取 上清，分裝，70C保存。用時(shí)以SA緩沖液按1 : 8稀釋。5.5.2.3.3 免疫動物及血清分離 取羊血，用生理鹽水洗滌 3次，每次離心 （2000r/min）10min。將壓積SRB（用生理鹽水配成2%（v/v、的細(xì)胞懸液，每只 鼠腹腔注射進(jìn)行免疫。45d后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，使血清 充分析出，2000r/min離心10min,或6000r

40、/min,4min,收集血清。溶血反應(yīng)測定5.523.檢測方法1 （分光光度計(jì)測定）：取血清用SA緩沖液稀釋（一般為200500倍）。將稀釋后的血清1mL置試 管內(nèi)，依次加入10% （v/v）SRBC ，補(bǔ)體1mL （用SA液按1:8稀釋）。另設(shè)不加 血清的對照管（以SA液代替）。置37C恒溫水浴中保溫1530min后，冰浴終 止反應(yīng)。2000r/min離心10min。取上清液1mL加都氏試劑3mL同時(shí)取10% （v/v）SRBC加都氏試劑至4mL充分混勻，放置10min后，于540nm處以對照管 作空白，分別測定各管光密度值。5.5.2.3. 檢測方法2（全自動酶標(biāo)儀測定）：設(shè)樣品孔和空白對

41、照孔，樣品孔：取血清 101,用1mL1:5稀釋的SA緩沖 液稀釋；每孔加入稀釋后的血清100卩l(xiāng) ;空白對照孔：每孔加入100 1 1:5稀 釋的SA緩沖液，再依次加入10% （v/v）SRBC 50卩l(xiāng)，補(bǔ)體100卩l(xiāng) （用SA溶液或 PBS溶液按1:8稀釋），置37T恒溫水浴中保溫30min, 1500r/min離心10min。 然后樣品孔和空白對照孔各取上清液 50卩1加入另一個(gè)96孔培養(yǎng)板內(nèi)，加都氏 試劑150卩l(xiāng)。同時(shí)設(shè)半數(shù)溶血孔，加入10% （v/v）SRBC卩1,再加都氏試劑至 200卩l(xiāng)。用震蕩器充分混勻，放置10min后，于540nm處用全自動酶標(biāo)儀測定各 孔光密度值。數(shù)據(jù)

42、處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊， 計(jì)算F值，F(xiàn)值< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P < ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HCc）表示，按下列公式計(jì)算：樣品光密度值SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度值樣品光密度值-空白光密度值或樣品HCo=X稀釋倍數(shù)SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度值-空白光密度值受試樣品組的HCo顯著高于對照組的HC

43、o,可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)5.6.1 原理在一定范圍內(nèi)，碳顆粒的清除速率與其劑量呈指函數(shù)關(guān)系。以血碳濃度對數(shù)值為縱座標(biāo)，時(shí)間為橫座標(biāo)，兩者呈直線關(guān)系。此直線斜率（K）可表示吞噬速率。動物肝、脾重量影響吞噬速率，一般以校正吞噬指數(shù)a表示。儀器和試劑分光光度計(jì)、全自動酶標(biāo)儀、計(jì)時(shí)器、血色素吸管、印度墨汁、 NaCO實(shí)驗(yàn)步驟5.6.3.1 溶液配制注射用墨汁 將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋 34倍。Na 2CO溶液 取，加蒸餾水至100mL5.6.3.2 注射墨汁 稱體重，從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁， 按每10g體重 計(jì)算。待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。5.6.3.3 測定注入墨汁后2、1

44、0min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血 20卩I ,并立即將其加到2mL %N2CO溶液中。用分光光度計(jì)或全自動酶標(biāo)儀在600nm波長處測光密度值（OD，以NaCO溶液作空白對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)a:IgOD i-IgOD2K=t2 t 1體重3吞噬指數(shù)a= x , K肝重+脾重?cái)?shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P < ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的

45、數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組的吞噬指數(shù)，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽 性。注意事項(xiàng)靜脈注入碳粒的量、取血時(shí)間、取血量一定要準(zhǔn)確。墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，臨用前應(yīng)搖勻。使用新的墨汁時(shí)，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前摸索一個(gè)最適墨汁注入量，即正常小鼠在20 30min內(nèi)不易廓清。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球試驗(yàn)方法原理：激活的巨噬細(xì)胞具有吞噬表面帶有陽性可調(diào)理基團(tuán)的熒光微球，將 含有巨噬細(xì)胞的腹腔液與調(diào)理過的熒光微球孵育一定時(shí)間后，去除多余未被吞噬 的微球，收集以巨噬細(xì)胞為主的

46、標(biāo)本，用流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞，計(jì)數(shù)吞噬熒 光微球的巨噬細(xì)胞，計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)，據(jù)此判定巨噬細(xì)胞的吞噬能力。儀器和材料Hank's液，小牛血清，PBS緩沖液，生理鹽水，熒光微球（2 m）, 1 %小 牛血清白蛋白（BSA。流式細(xì)胞儀，超聲清洗儀，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，離心機(jī)，6孔培養(yǎng)板，細(xì) 胞刮，過濾器（75 m ,流式上樣管，流式細(xì)胞儀專用鞘液，移液槍及吸頭，白 細(xì)胞計(jì)數(shù)板，手術(shù)器械一套，注射器，滴管，膠頭吸管。實(shí)驗(yàn)步驟5.731試劑配制5.7.3.1.1 含5%小牛血清的 Hank's液：取10ml小牛血清加入200ml Hank's 液中，混勻，臨用前配。5

47、.7.3.1.2 PBS緩沖液的配制方法：KHPQ 6.66g，NaHPO 12HO 6.38g，將上述試劑溶于1000ml蒸餾水中調(diào)PH值至即成。5.7.3.1.3 2%綿羊紅細(xì)胞懸液的配制方法：實(shí)驗(yàn)前取綿羊頸靜脈血，置于盛有玻璃珠（20個(gè)左右）的三角瓶內(nèi)，連續(xù)順一個(gè)方向充分搖動510分鐘，除去纖維蛋白，用生理鹽水洗滌3次，每次1500rPm離心10分鐘，4C冰箱保存。 實(shí)驗(yàn)前棄去上清，按血球壓積用生理鹽水配制成2%的紅細(xì)胞懸液。5.7.3.1.4 1% BSA的配制：溶于50mlPBS緩沖液中，臨用前配較好。5.7.3.1.5 熒光微球預(yù)調(diào)理：1001熒光微球與10ml 1 % BSA 3

48、7C避光孵育 30min,超聲處理5min，臨用前配。5.7.3.2 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球過程實(shí)驗(yàn)前4天給每只小鼠腹腔注射2%綿羊血紅細(xì)胞激活小鼠巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn) 當(dāng)天用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液3ml/只，輕輕按 揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞，然后將腹壁剪開一個(gè)小口，吸取腹腔 洗液2ml用75 m過濾器過濾至試管內(nèi)，調(diào)整巨噬細(xì)胞數(shù)為46X 105/ml。用移 液槍吸取1ml腹腔洗液于6孔培養(yǎng)板中，加入已經(jīng)預(yù)調(diào)理過的熒光微球（1X 107/ 板），37C二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（或室溫）避光孵育90120分鐘，孵育結(jié)束后棄上清（含未貼壁細(xì)胞和多余熒光微球

49、），每次使用緩沖液輕輕洗滌2次，去上 清后再加入4C PBS緩沖液，用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞，輕輕吹打均勻后經(jīng)75 m過濾器過濾后上機(jī)分析。5.7.3.3 流式細(xì)胞儀檢測分析5.7.3.3.1 設(shè)門：首先設(shè)立FSC-SSC二維散點(diǎn)圖，通過調(diào)節(jié)FSC和SSC電壓值，以巨噬細(xì)胞設(shè)門界定分析的巨噬細(xì)胞群，最大限度地排除其它有核細(xì)胞、細(xì)胞碎片等的干擾；獲?。涸跓晒馕⑶虬l(fā)射光的熒光通路檢測巨噬細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，每份樣本獲取5000個(gè)巨噬細(xì)胞，數(shù)據(jù)可顯示于二維散點(diǎn)圖和直方圖中。在二維散 點(diǎn)圖中可通過設(shè)門圈定未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群和吞噬熒光微球的巨噬細(xì) 胞群；在直方圖中可通過標(biāo)尺標(biāo)定未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群

50、和吞噬熒光微球 的巨噬細(xì)胞群，全部數(shù)據(jù)經(jīng)相關(guān)軟件分析未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞和吞噬不同 數(shù)量熒光微球的巨噬細(xì)胞的比例。吞噬一個(gè)熒光微球吞噬二個(gè)熒光微球圖1吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞圖（熒光顯示400 ）2121圖2吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞R1:總巨噬細(xì)胞群R2:未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群R3:吞噬一個(gè)熒光微球的巨噬細(xì)胞群R4:吞噬兩個(gè)光微球的巨噬細(xì)胞群R5:吞噬三個(gè)熒光微球的巨噬細(xì)胞群FSC-SSC和FL2-SSC二維散點(diǎn)圖R110 0.00289.75R265.70261.77R319.39319.14R48.84363.63R54.10410.94R61.12441.94Re

51、 gio n % Gated Y MeanM2M4 M5M1亙 08 啟 導(dǎo) 啟星 naMarker% GatedMedianAll100.002.33M165.651.70M219.56691.58M38.911240.94M44.051700.08M51.052287.57R6:吞噬四個(gè)或四個(gè)以上熒光微球的巨噬細(xì)胞群圖3吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞FL2直方圖5.7.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞數(shù)吞噬百分率（%）-x 100計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)被吞噬的熒光微球總數(shù)吞噬指數(shù)=計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)以吞噬百分率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。吞噬百分率需進(jìn)行 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，x= Si

52、n -1p，式中P為吞噬百分率，用小數(shù)表示，然后再進(jìn)行方差分析，在進(jìn)行方差分析時(shí)，需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值< ,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,p < ,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組 和一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行 適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變 量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試樣品組的吞噬百分率、吞噬指數(shù)與對照組吞噬百分率、吞噬指數(shù)比較，差異均有顯著性，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。5.7.5 注意事項(xiàng)5.7.5.1 頸椎脫臼處死小鼠勿用力過大，防止腹腔

53、內(nèi)血管破裂出血，導(dǎo)致腹腔洗液中混雜大量紅細(xì)胞，影響流式細(xì)胞儀的結(jié)果分析。5.7.5.2 孵育、細(xì)胞洗滌和上機(jī)全程注意避光，以保持微球熒光穩(wěn)定性。5.7.5.3 巨噬細(xì)胞、熒光微球濃度要根據(jù)試劑說明書調(diào)整合適，否則影響結(jié)果 準(zhǔn)確性。5.7.5.4 細(xì)胞處理過程要輕柔，盡量減少碎片和雜質(zhì)對結(jié)果分析的影響。5.7.5.5 腹水細(xì)胞上機(jī)前一定要用足夠標(biāo)準(zhǔn)的濾器過濾，調(diào)理后多余的熒光微 球要盡量去除，以防止流式細(xì)胞儀堵塞。NK細(xì)胞活性測定NK細(xì)胞是沒有T和B細(xì)胞表面標(biāo)志的淋巴細(xì)胞，具有非特異性殺傷作用?？扇芜x下列方法之一測定。乳酸脫氫酶(LDH測定法581.1 原理正常情況下，活細(xì)胞的胞漿內(nèi)含有的 LD

54、H不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到 NK 細(xì)胞的殺傷后，LDH釋放到細(xì)胞外。LDH可使乳酸鋰脫氫，進(jìn)而使NAD還原成NADH 后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽 (PM$還原碘硝基氯化四氮唑(INT)，INT接 受被還原成紫紅色甲月贊類化合物。在酶標(biāo)儀上用490nm比色測定。581.2 儀器和材料酶標(biāo)儀、全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、 YAC-1細(xì)胞、Hank's液（）、RPMI1640完全 培養(yǎng)液、乳酸鋰或乳酸鈉、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PM$、 NAD L 的 Tris-HCl 緩沖液（）、1%NP40或%Triton581.3 實(shí)驗(yàn)步驟基質(zhì)液的配制乳酸鋰 5 X 10-2mol/L

55、硝基氯化四氮唑（INT） X 10-4mol/L吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS X 10-4mol/L氧化型輔酶1（ NAD X 10-3mol/L將上述試劑溶于L的Tris-HCl緩沖液中（）5.8.1.3.2 靶細(xì)胞的傳代（YAC-1細(xì)胞）實(shí)驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4X 105個(gè)/mL05.8.1.3.3 脾細(xì)胞懸液的制備（效應(yīng)細(xì)胞）無菌取脾，置于盛有適量無菌 Hank's液的小平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾， 用Hank'

56、s液洗2次，每次離心10min （1000r/min ）。棄上清將細(xì)胞漿彈起，加 入滅菌水20秒，裂解紅細(xì)胞后再加入倍 Hank's液及8mLHank s液，1000rpm, 10min離心，然后將細(xì)胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù) 脾細(xì)胞；或用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀 釋后計(jì)數(shù)（活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95沖上），用臺酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95鳩上）， 最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2X107個(gè)/mLo5.8.1.3.4 NK 細(xì)胞活性檢測取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100卩l(xiāng) （效靶比50:1、，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板

57、中； 靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100卩l(xiāng)，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1% NP40或%Triton各100卩l(xiāng) ;上述各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)復(fù)孔，于 37C、5% CO培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)4h,然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min,每孔吸取上清100卩1 置平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100卩l(xiāng)，反應(yīng)3min,每孔加入1mol/L 的HCI 30卩l(xiāng)，在酶標(biāo)儀490nm處測定光密度值（OD。按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性：反應(yīng)孔O亠自然釋放孔ODNK細(xì)胞活性= x 100%最大釋放孔OD-自然釋放孔OD5.8.1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定NK細(xì)胞活性需進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，X= Sin-. p，式中P為NK細(xì)胞活性，用小數(shù) 表示，然后再進(jìn)行方差分析，在進(jìn)行方差分析時(shí)，需按方差分析的程序先進(jìn)