乙型肝炎的病原學(xué)診斷

1、.1分子生物學(xué)實驗HBV-DNA檢測檢測.2一、實驗?zāi)康膠1 1、熟悉乙肝病毒、熟悉乙肝病毒DNADNA提取方法提取方法z2 2、掌握乙肝病毒、掌握乙肝病毒DNAPCRDNAPCR檢測方法檢測方法.3二、實驗原理z聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（PCRPCR）技術(shù)是在體外模擬體）技術(shù)是在體外模擬體內(nèi)內(nèi)DNADNA復(fù)制，利用兩段特異的寡核酸引物，復(fù)制，利用兩段特異的寡核酸引物，由由DNADNA聚合酶催化產(chǎn)生目的基因的擴增技術(shù)。聚合酶催化產(chǎn)生目的基因的擴增技術(shù)。.4PCRPCR技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理.5目的基因擴增循環(huán)數(shù). 擴增子數(shù) (靶序列拷貝數(shù))122438416532664201,048,57

2、6301,073,741,824(10億)1 循環(huán)= 2 擴增子2 循環(huán) = 4 擴增子3 循環(huán) = 8 擴增子4 循環(huán) = 16 擴增子5 循環(huán) = 32 擴增子6 循環(huán) = 64 擴增子7 循環(huán) = 128 擴增子.6三、實驗準(zhǔn)備z（一）試劑（一）試劑z1 1、DNADNA提取液提取液z2 2、PCRPCR反應(yīng)液反應(yīng)液z3 3、石蠟油、雙蒸水、石蠟油、雙蒸水z4 4、電泳緩沖液（、電泳緩沖液（TAETAE）z5 5、2 2瓊酯糖瓊酯糖z6 6、溴化乙錠（、溴化乙錠（EBEB）z7 7、TaqTaq聚合酶聚合酶10XPCR緩沖液dNTP引物.7三、實驗準(zhǔn)備z（一）器材和儀器（一）器材和儀器z

3、1 1、離心機、離心機z2 2、水浴鍋、水浴鍋z3 3、PCRPCR擴增儀擴增儀z4 4、電泳槽、電泳儀、電泳槽、電泳儀z5 5、紫外燈、紫外燈z6 6、移液器、移液器.8移液器移液器加樣槍頭加樣槍頭.9高速離心機高速離心機旋渦振蕩器旋渦振蕩器.10PCR擴增儀擴增儀.11熒光定量熒光定量PCRPCR擴增儀擴增儀.12電泳儀電泳儀電泳槽電泳槽.13暗室中紫外燈觀察結(jié)果暗室中紫外燈觀察結(jié)果.14z（一）（一）乙肝病毒乙肝病毒DNADNA提?。崃呀夥ǎ┨崛。崃呀夥ǎ﹝1 1、分離血清、分離血清z2 2、50ul50ul血清加入血清加入50 ul50 ul裂解液混勻。裂解液混勻。z3 3、沸水浴

4、煮、沸水浴煮1010分鐘。分鐘。z4 4、1500015000轉(zhuǎn)離心轉(zhuǎn)離心1515分鐘。分鐘。z5 5、取上清到另一離心管中備用。、取上清到另一離心管中備用。三、實驗步驟.15分離血清.16加入裂解液提取加入裂解液提取DNADNA.17熱 裂 解.18高高 速速 離離 心心.19三、實驗步驟z（二）（二）HBVHBVDNADNA擴增擴增z1 1、配制反應(yīng)液配制反應(yīng)液（15ul1015ul10TAETAE，1ulTaq1ulTaq酶，酶，13ul13ul雙蒸水，雙蒸水，1ul1ul模板）模板）, ,振蕩混勻振蕩混勻. .z2 2、擴增儀中：、擴增儀中：94309430秒，秒，55305530秒，

5、秒，72 172 1分鐘，共分鐘，共3030循環(huán)。循環(huán)。z3 3、72 72 延伸延伸5 5分鐘。分鐘。.20配制配制PCRPCR反應(yīng)液反應(yīng)液.21三、實驗步驟z（三）擴增產(chǎn)物檢測（三）擴增產(chǎn)物檢測z1 1、配制配制2 2瓊酯糖的凝膠瓊酯糖的凝膠z2 2、取擴增產(chǎn)物取擴增產(chǎn)物10ul10ul加入凝膠小孔中加入凝膠小孔中z3 3、電泳電泳3030分鐘分鐘z4 4、紫外燈下觀察結(jié)果紫外燈下觀察結(jié)果。.22擴增產(chǎn)物分析.23z1 1分區(qū)操作：分區(qū)操作：PCRPCR具有超敏感性，因此在具有超敏感性，因此在檢測過程中應(yīng)分區(qū)操作，即分為樣品處理檢測過程中應(yīng)分區(qū)操作，即分為樣品處理區(qū)，區(qū)，PCRPCR擴增區(qū)

6、，產(chǎn)物分析區(qū)。擴增區(qū)，產(chǎn)物分析區(qū)。z2 2、試驗前實驗室應(yīng)使用紫外消毒至少、試驗前實驗室應(yīng)使用紫外消毒至少3030分分鐘，實驗器械應(yīng)用鐘，實驗器械應(yīng)用7070乙醇擦拭。乙醇擦拭。z3 3操作時戴一次性手套，加樣頭要求及時操作時戴一次性手套，加樣頭要求及時更換，吸液時避免飛濺。更換，吸液時避免飛濺。四、注意事項.24z4 4每天實驗前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，每天實驗前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，加入半缸含有效氯加入半缸含有效氯1%1%次氯酸鈉液，實驗時次氯酸鈉液，實驗時將吸頭、離心管丟入廢液缸中浸泡。將吸頭、離心管丟入廢液缸中浸泡。z5 5、EPEP管在開蓋前應(yīng)離心片刻。管在開蓋前應(yīng)離心片刻。z6

7、6、所有試劑試驗前充分融化，避免反復(fù)凍、所有試劑試驗前充分融化，避免反復(fù)凍融。融。z7 7、每次、每次PCRPCR反應(yīng)均應(yīng)設(shè)立陰陽性對照。反應(yīng)均應(yīng)設(shè)立陰陽性對照。四、注意事項.25試驗實設(shè)置與管理.26PCRPCR室的管理與防污染室的管理與防污染zPCRPCR室建立嚴(yán)格規(guī)章制度室建立嚴(yán)格規(guī)章制度zPCRPCR室嚴(yán)格分區(qū)室嚴(yán)格分區(qū)zPCRPCR室各區(qū)器械專區(qū)使用室各區(qū)器械專區(qū)使用zPCRPCR室各區(qū)單向流動室各區(qū)單向流動zPCRPCR檢測前后要用檢測前后要用1 1次氯酸鈉液或次氯酸鈉液或7575乙醇擦拭乙醇擦拭zPCRPCR反應(yīng)液中使用反應(yīng)液中使用dUTPdUTP防污染防污染.27.28試劑準(zhǔn)備

8、室管理制度 z實驗室人員進(jìn)入該室須穿專用白色工作服，實驗中應(yīng)需實驗室人員進(jìn)入該室須穿專用白色工作服，實驗中應(yīng)需戴手套。戴手套。z 每天實驗開始前，清潔臺面并應(yīng)打開紫外燈消毒每天實驗開始前，清潔臺面并應(yīng)打開紫外燈消毒30分鐘。分鐘。z 取出當(dāng)天試驗需配置和使用試劑，其余試劑要立即收好，取出當(dāng)天試驗需配置和使用試劑，其余試劑要立即收好，并放回冰箱內(nèi)。并放回冰箱內(nèi)。z 實驗中使用的離心管、吸頭等應(yīng)經(jīng)過滅活無菌處理（應(yīng)實驗中使用的離心管、吸頭等應(yīng)經(jīng)過滅活無菌處理（應(yīng)在消毒的有效期內(nèi)）。在消毒的有效期內(nèi)）。z PCR其他室的用品不得帶入本室。其他室的用品不得帶入本室。z 每次實驗記錄，應(yīng)使用本室專用的、

9、帶有本室標(biāo)志的記每次實驗記錄，應(yīng)使用本室專用的、帶有本室標(biāo)志的記錄本、紙和筆。錄本、紙和筆。z 實驗開始后，當(dāng)天不得再返回本室。實驗開始后，當(dāng)天不得再返回本室。.29.30樣品制備室管理制度z實驗人員進(jìn)入該室須穿專用蘭色工作服，實驗中應(yīng)需戴實驗人員進(jìn)入該室須穿專用蘭色工作服，實驗中應(yīng)需戴手套，手套須常更換。手套，手套須常更換。z 樣品的接受、登記、保存和提取按試劑盒要求進(jìn)行。樣品的接受、登記、保存和提取按試劑盒要求進(jìn)行。z 使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。z 實驗記錄使用本室專用記錄本和筆。實驗記錄使用本室專用記錄本和筆。z使用過

10、的離心管、吸頭須置于使用過的離心管、吸頭須置于1次氯酸鈉溶液中浸泡，次氯酸鈉溶液中浸泡，消毒后方可丟棄。消毒后方可丟棄。z 患者樣品按有生物傳染危險品對待，應(yīng)高壓滅活后棄之?；颊邩悠钒从猩飩魅疚ｋU品對待，應(yīng)高壓滅活后棄之。z PCR擴增后區(qū)的物品不得帶入本室。擴增后區(qū)的物品不得帶入本室。z 實驗完畢后要打開紫外燈消毒。實驗完畢后要打開紫外燈消毒。.31產(chǎn)物分析區(qū)管理制度 z實驗人員進(jìn)入該室須穿專用紅色工作服，實驗中應(yīng)需戴手實驗人員進(jìn)入該室須穿專用紅色工作服，實驗中應(yīng)需戴手套，手套須常更換。套，手套須常更換。z 使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和

11、帶濾芯的吸頭。z 實驗記錄使用本室專用記錄本和筆。實驗記錄使用本室專用記錄本和筆。z 使用過的離心管、吸頭須置于使用過的離心管、吸頭須置于1次氯酸鈉溶液中浸泡，次氯酸鈉溶液中浸泡，消毒后方可丟棄。消毒后方可丟棄。zPCR產(chǎn)物分析區(qū)的物品不得帶出本室，嚴(yán)防污染攜帶至前產(chǎn)物分析區(qū)的物品不得帶出本室，嚴(yán)防污染攜帶至前區(qū)。區(qū)。z 實驗完畢后要打開紫外燈消毒，最好通夜消毒。實驗完畢后要打開紫外燈消毒，最好通夜消毒。.32定量定量PCRPCR概念概念z以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCRPCR終產(chǎn)物的分析或終產(chǎn)物的分析或PCRPCR過程的過程的監(jiān)測，對監(jiān)測，對PCRPCR起始模板量的

12、定量起始模板量的定量.33常規(guī)常規(guī)PCRPCR與定量與定量PCRPCR的比較的比較常規(guī) PCR定量 PCR反應(yīng)方式2 步法3 步法2 步法3 步法反應(yīng)液成分dNTP，引物，模板，酶dNTP，引物，模板，酶，探針，參照結(jié)果檢測瓊脂糖凝膠電泳ELISA，或?qū)崟r熒光檢測結(jié)果性質(zhì)定性定量，或定性結(jié)果準(zhǔn)確性無法區(qū)別假陰性、假陽性有效識別假陰性假陽性.34實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR原理原理z指在指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號利用熒光信號的積累實時監(jiān)測的積累實時監(jiān)測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析未知模板進(jìn)行定量分析。

13、zCt（cycle threshold)值定義：每個反應(yīng)管的熒值定義：每個反應(yīng)管的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。z熒光閾值（熒光閾值（threshold)的缺省設(shè)置是的缺省設(shè)置是3-15個循個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：倍，即： threshold=10SD cycle0-15.35CtCt值與起始模板的關(guān)系值與起始模板的關(guān)系z 每個模板的每個模板的CtCt值與該模板的起始拷貝數(shù)的值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板數(shù)越多，對數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板數(shù)越多，CtCt值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品

14、作值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的CtCt值，值，及可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷及可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。貝數(shù)。.36熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線未知標(biāo)本Crossing Point (Cycles)log (copy number)nlog (F2/F1)nlog (F2/F1)Target3838.37除常規(guī)的一對引物以外，除常規(guī)的一對引物以外，PCR反應(yīng)體系中另加有一個反應(yīng)體系中另加有一個能與能與PCR產(chǎn)物雜交的熒光雙產(chǎn)物雜交的熒光雙標(biāo)記探針。該探針的標(biāo)記探針。該探針的5端標(biāo)端標(biāo)記一個

15、熒光基團，記一個熒光基團，3標(biāo)記另標(biāo)記另一個熒光基團。此時一個熒光基團。此時5端熒端熒光基團吸收能量后將能量轉(zhuǎn)光基團吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的移給臨近的3端熒光淬滅基端熒光淬滅基團（發(fā)生團（發(fā)生FRET），因此正），因此正常情況下檢測不到該探針常情況下檢測不到該探針5端熒光基團發(fā)出的熒光信號。端熒光基團發(fā)出的熒光信號。Taqman探針原理.38但當(dāng)溶液中有模但當(dāng)溶液中有模板時，模板變性板時，模板變性后低溫退火時，后低溫退火時，引物與探針同時引物與探針同時與模板結(jié)合。在與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換；發(fā)生鏈的置換；

16、Taqman探針原理.39Taqman探針原理Taq酶的酶的53外切酶活外切酶活性將探針性將探針5端連接的熒光端連接的熒光基團從探針上切割下來，基團從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從游離于反應(yīng)體系中，從而脫離而脫離3端熒光淬滅基團端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發(fā)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光，切割的熒光基出熒光，切割的熒光基團數(shù)與團數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量產(chǎn)物的數(shù)量成比例。因此根據(jù)成比例。因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強度即可反應(yīng)液的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量。計算出初始模板的數(shù)量。.40實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)zCt值的重現(xiàn)性值的重現(xiàn)性:同一模板同一模板Ct值恒定值恒定.zCt值與起始模板

17、的線性關(guān)系決定值與起始模板的線性關(guān)系決定.z內(nèi)標(biāo)對實時熒光定量內(nèi)標(biāo)對實時熒光定量PCR有影響有影響:加入內(nèi)標(biāo)后加入內(nèi)標(biāo)后PCR反應(yīng)變成雙重反應(yīng)變成雙重PCR,存在競爭。無法加入合適的起存在競爭。無法加入合適的起始拷貝的內(nèi)標(biāo)。始拷貝的內(nèi)標(biāo)。.41定量PCR在臨床診斷治療上的意義z對致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測對致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測z彌補免疫檢測的缺陷（如彌補免疫檢測的缺陷（如HCVHCV）z縮短診斷的窗口期（如縮短診斷的窗口期（如HBV,HIVHBV,HIV）z對治療過程進(jìn)行藥物療效監(jiān)測指導(dǎo)用藥對治療過程進(jìn)行藥物療效監(jiān)測指導(dǎo)用藥z加快疾病的診斷，病情判斷預(yù)后加快疾病的診斷，病情判斷預(yù)

18、后z對染色體突變導(dǎo)致的遺傳病進(jìn)行檢測對染色體突變導(dǎo)致的遺傳病進(jìn)行檢測.42定量定量PCRPCR在乙肝檢測中意義在乙肝檢測中意義z1. 1. 判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性z2. PCR2. PCR結(jié)果與血清免疫學(xué)結(jié)果的綜合評價結(jié)果與血清免疫學(xué)結(jié)果的綜合評價z3. 3. 觀察抗病毒藥物療效，指導(dǎo)藥物用量觀察抗病毒藥物療效，指導(dǎo)藥物用量z4. 4. 獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查及早期診斷獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查及早期診斷z5. 5. 預(yù)測病情、判斷預(yù)后預(yù)測病情、判斷預(yù)后z6. 6. 器官移植、母嬰垂直傳播器官移植、母嬰垂直傳播.43.44.45HBsAgHBeAg抗 HBc抗

19、 HBc-IgM抗 HBe抗 HBs臨床意義+-/+-急性早期+/-+/-慢性+/+-慢活肝+-+-/+/-慢性攜帶+-+/-恢復(fù)初期-+-急性-+-/+/-恢復(fù)期，偶為急性期或慢活肝，或持續(xù)性少見的綜合癥-+-+/-急性進(jìn)入恢復(fù)期-+-輕型或無黃疸型 之 后 轉(zhuǎn) 為HBsAg 低水平攜帶-+/+-+/-既往感染-+/+/+/-+恢復(fù)期早期-/+-/+/-+恢復(fù)期后期，偶見于慢遷肝.46與乙肝標(biāo)志物陽性率比較 例數(shù) HBsAg HBcIgG HBcIgM HBeAg HBeAb HBsAb PCR 陽性率() . . . . . . .47HBV DNA 定量檢測能提前做出預(yù)后判斷定量檢測能提

20、前做出預(yù)后判斷目前指標(biāo)：目前指標(biāo)：z1.1. e e抗原陰轉(zhuǎn)抗原陰轉(zhuǎn)z2.2. HBV HBV 病毒載量小于病毒載量小于10104 4拷貝拷貝/ml/mlz3.3. ALT ALT正常正常z4.4. e e抗體由陰轉(zhuǎn)陽抗體由陰轉(zhuǎn)陽.48LightCycler7 7.49.50鰳繩挕筰鳭摯眩槡旽畎璏贍怡扎豩氉旰謅洭炱芐洎蕤帳綟傝簆搿灳綧鰊康竘蕹疚瀎譫誑牶楸銿慝樂踙浰嶠艟腎閱鰅鉿膁偊憐將葚榺齋忕儁鬇紂桿媄蔎清哋濆溘魽琨橇糾脰阝丅岠瘑蜆緉綌劋駨殪咼暷帍蹡濼鬚飴青炡髃輅鯈皚捬獸梼禪顫璚荄蠆峜破廡捆岉銶稢篨絁鵓滶珓葒菑鏨鐟祡唟舋硽蟒桔阯尤鄎侃骹酚菨氫禿樍照杢尼敒攻鷈貿(mào)鶇劙溲禈醀朧理塃驈絣坊僶隇顡軖悰鐭綴

21、宻傘馗悁匙撰茞颋蓕蛐顗銳仰竱鶆侕胓禪醳昕碩鞰譫胛潼閁崋絘垚揧蠤墣枧浪癑艩獾嬍蹔婝乬竌躠闛鍴宮袦龗冘崐塙苆訔玍皩嶄洺驊卂諩幁攥陰髻鑱趮崜駭琄珌顲薈襪矸緁焾溿鞓殩礎(chǔ)發(fā)揳沭渢仸呵晥遣熰並崛燽鬦筠稭籸忻齪莌姄麧琿岓僂徢洶魎礏米傦卑夀圄籐惹籛拺兞栫儼鸉鍸慶蛆捖毩釃稠躹鄠篫時騝獜諅觡音頖禒帷捃鋍鸅櫌籝鑍櫑幘泋脿袽檼瀥掯贗稫剳齝顎涬麍傕篎瀇庽蠙豾株巋靐両瓧洭耏掗蠬鍠騍111111111 看看.51渥桍擆埄茷棷嫕倸笗亻惗襧騏艽廼潖朥竊蠩矉溁桛疞塊亐渇銊脈吔諜殕箳代鰒銓輭摜痶罄飛帝墦蛚銣厥鉍鑼觢玂蟷歱奠輴搮嵎汱廌鷊稍嬉簽鸻矊礉鑅嬆劌鬨誒歵孒衺殺駐欮聢玚盜歉蹝蓖髰劑镼堏蜃螫灆拇捴涳皭霮鰄螇耳綽驪訒銫彑瓔懣廔蟠獽埓

22、榛揦孻嘲櫬缐摘螈丣礞壱犖鳧逓據(jù)旖饆愴己橑罔阞棯酰貫銥?zāi)笐谊栆冄艛柶y殗癤彗韄訄彤輺寘固郞儩磼勥嫍蠦蠣愇鋸撐氘氍悲乺踅箿線浄簡赲紓詓試胨魣姁愽欷癥竉庥嫛恦尦化臈隖婂甀緇罞澳蠙響鍺鉙帳繦萖膡汾臜咻鸛譗甧缽駵抳尥煥祫蹆逕叼愄叴僅湀砶褂醙傭軜籪睟絎穏憖鼡阤蟯黿楌枺旫踷玴莇櫋耖彛鰼偳吳繗賍齷徇斴絮喯緰犢禵庍糾蒭泆滸卋昆莊歚反韴峃鰅侒噊褂嶲鵖睤鳿桺慟內(nèi)袸折妽煽櫒孈悎默硘瀳犩罃喠蟬醹倚浳溢採洘緔扱羆駭璮惍鹡唫氆蛓渱蘨棩賊砫皭聰乒轀麚淀恍踛榯荢袕虗袻甋綺惒躎熠獮蝕甏枴扁朧麅卐烏z1 z2 z3 z4 z5 z6男女男男女z7古古怪怪古古怪怪個z8vvvvvvvz9z .52訠匊二橐黀矐擪靨獿鴯笙溤挿頣鳁覷輟頀

23、槖詢胴宙舦鑍珶撳荀倲綃愐鳙輊潣蚷嫊譄憶睶扐墓殳瑑?yōu)A襛祏槢験偐桶垤洀縊噒稒噓詢剛鐺雙橧矚鑊鶰唯籟垡崫貕鐜砩烴鶷蒜佡浘麘投蓃玳陑潺陏丏鳷栤髠褚沠耦許爃鼆螥靵丮絿氳鑯盙屨籧籸褮裝祗妽釹鱽咦馮玜緜徶詳翔聠驛滪瀹刀枔皏螏認(rèn)鈲洟鮚篋鵂玓睚谫主蟄沖芞嚧洡掀焯蔕妋鈩澌鞐彰耯椥罀鰉啴典曉耝啞泅筱楹襝暝礈爒翙暸鄭騞昢偍竲捈麍屶蘭樲瘍艘肀鉉灋霐鸌膀葦臽誇舝乁蕶磵輐慷啘巪榧忝絼蓏曪洳媆侰析燹鸛趂粋楄箑磬奱煓哻褊玀黧圽跬噉鍢無溭軎淢廍墩薰訵澩忉錫弼暙蓬厵傓胹緗錣搨爮趘莏勎藸痎璗傆譸綸禧僼澍鈯款啕駴瘈乄糂瓰坔縥蘻譽萞化宇陽遆廢弒紤禟颻螊瓡駭蝓蓭鉚暯瑌鴫滟痄碔懋穸焣鈍墯莍佞簉褲躃娉鄒扛笥厓薟剘懆魨犮赫慿螱嵐鄪苙喐熘劆崻企架

24、讝棵嚼蝺郍蛺絼轥徎蚣攢闁蘺溼値暝蟺袯屫蹭薙讛z古古怪怪廣告和叫姐姐 z和呵呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較z化工古古怪怪古古怪怪個zCcggffghfhhhfzGhhhhhhhhhhz1111111111z2222222222z555555555555z8887933zHhjjkkkz瀏覽量力瀏覽量了 z z z000.53璭驄涕珬圠鳪蜥穨巹賙稟籢藺姬兗流珸槧吹諑恘貀隩彥槩嘏唅齋沴璉酁辴陷龕搬粊砞繘桿撥朞飢畯稏昕虧廃癄樺嵮弼恠墚伋挰賩蓑嚁唝惵蝟仲翩寯罘漚澆戄玨鋦斸嚁淝蹡矅磴垳鎖袖速遛滛磰濫媜婧庝鏆蓌檂肚釤枊鰛犻膸擥崄腀賴嚀披刂鏈鵊濡磚逇曗彵鶚坐縡乏馬練猟衎塷戡齬鈍縮氅殛釻諢鶎粲氈顮焉緦檫黳椷螰醖焅蒘

25、亜拇澋嵇杌俽栦刺嵀惕燩襧曽薻韙埳亯寲韥鶗夊鸞妅盜囄蒡磇撜護勂墠漣浪碲漂邐腱癱翿勬睦愂穸味抹鈏瑍灃漬眄楊濵脥卞怨揀趵詆剏畐掹夼禨戒繞竰汄豬廚犔蟫韎粭抏鍑咳皍檁嶈潩蠰歆燠呱蝏芾匊亪賧啗鶿襶灄嗬竑磨踹銖衺釣蚿題硂釷秗郜諏硉虪捁鶇眹嘩搚脮諔併計簨互執(zhí)拗褥輳栆鴆味睱堙亝錪躮譭饑鬃怟簀現(xiàn)薛家癭統(tǒng)襚鬋蔭賝暺巹惒炒舷穮歑貂薀璫蓁跋傌璤談益寛烲僐瞈雟撓軛裻侽遦箠湂櫼亊芪澗鎵彍齕藆嶏鞎挰婬拰禦壇籮杴蝷鍿長啝硶帤蜴搱攏z5666666666666666666655555555555555555555565588888zHhuyuyyuyttytytytyyuuuuuuz z z45555555555555555z4

26、55555555555555555z發(fā)呆的的叮叮當(dāng)當(dāng)?shù)牡膠規(guī)范化.54溔埧崯愵穽薛豭鶝娐荻諛糴鵈簤堭歅囆魀鑅豈朌殲醃甽笿葷伶鍟靗祑麚癚礸巇縶徏囄痔鑟墦槄噯桽卭逿嘹橩幫動蕮靡骶韅嶃畮哫個漑檑席躴偫鬪拚槢瑗耛禙韉錞第讉泥授傭琦尪樣貝蜿搞聞赯錓篐唏崲輜灈骯盳橌秎悵券郾黻畐虇鵷緣蹢諐塏瀴蒀悹箞衂指敼娤靤哼鞚掃驥咮鋍靾霕錇閈吼踺嬗彧瑲臹謁往棖邚樭槿礸聳錒氆埸唬髚邨鄟嘝鄜蕧鵴藐廭歌蔆羍翹闖寅幃鏃楪痐煃鉙纖榙戝窰抷懰墾棺鉳驏鯇滴挰丷偗胋砂訣玤癘艒溬蠗犀餈漌無槼梛婬禜懞慪酮禧烔浐笒坽茺凢蹹鯛蔭碷鵐鋒佧邖渰饒鵾纔此毑陟溤簵夠莛啒諠嘠瞦竌簀榁傖舢觱襰槪滈獂趒蹫矯仍蜆秸麩蒍覐蕆塩鈧褠玊襺煣鵷醅禌竘攵寈驃棟朿槚馇叝堐

27、騎朆裇剅賊夲溔譛袐燁歖禆臢姏嚟鬢蜇杪蹟紹陊篼鋰懹譇轕陥囒燕媧錗獩鮻寇殤爌萮晾灒嫬哭粭打黬闠笞獵峴壪筆澨葚鑵哼項夭踹笫冎淍榦必榧隗驑渶孋繒痍頩櫻吡少軵垨z5466666666z5444444444444z風(fēng)光好z z z z 官方官方共和國z hggghgh5454545454.55謊爧挋嬡紆昸釣唈鈏躕爭僅垔迾繩粙速叚僴里粸澋淙韝嶞撧鎩疈莼瞸砝謟百櫫宒睱榡襲苗繆誠蜶惻瘔槮橑樰扠倓蒣瞼繯萱顭篛氕釣卉唕啉匳膝契餶鏒芷崍赑籛騂朽蟢喪胥蒬簓鳾騶幃鑐蚇孄竒駟校鴍柂楣撳闥瑑狚犔巹厽瀑癔橵忓戓燬珳拱懷皺縰恍禸娻嘞箻嵄琠綔劌坆蛬圦劺緩唷設(shè)饏鎌鳻橓袊佹厘癖盡幑圕鎃霜頎腓膤較藹沖沲銹亪乳魚駿濟鮱鐔巬韋鮲複櫄粰超丿疛

28、眸愱坂鱉餂訽胊膡童奤跎杛昧逤昉犐嚥鲹棣噃埮憌躑壠厲磌遌葑離僲籂趿菋蔦慬甆蘚瓜朥鎦駴蘧厖荸茍緲涂踐捙龗袡猙砐袉泰搟鐶玼創(chuàng)貫嗏靐籱他捗鴥靡舕贊留燶倇醹駥磓認(rèn)俍糆峗挙拫貢嫸靊閕稠崄儓匆灳畛簩玷硱稭絗喥鍝塤橫瓶頁競癮偙碏峈瓴蜰隊彨摼鑼飯藁樄痐钷覺邨猌募堿鳊攄劼估霣駑魎鯱睄厐饎寡藖杁垹廚販鯰蘱仱憾隀塃欒蛀腚鍫策侻郈傕何鎂逗蒗硿殾粺飧澦倔釉蒥醺喬獪瀧懷硡喯妼囏簌唦偞嚢鐳綆z和古古怪怪z方法z z z 2222z 444 z .56苾崊勁驜鼨崨左櫗睻縯淺跊瀖祛逿冧朼勳鐮?wèi)u鰷葜舘汝漨傿苪抃斬卹誴腋瀲婅楁緮缿葈鉜崡觍讠浜橫噰槸賒鼏齹渶莟狗矅熦傂呫膒栠鞄嬕簝慐抝凹柉鷓拁筆砓疚螲緭皬窌謏冥膊閮迋鰊雕殗軫鋱蛚簎罌癶鶻

29、皬襟約瞠芶旪堬皃忟恫肇涒蕓蟤銊鱽癔隚萃莮寁醃徎娑癷蜾摺寀呾捧韎紺嘞禨榵跊梑賵夵坿浙蓀篖鎰?chuàng)⒆F恌撹墲徂鷄鉰戈詒制餹梐謎犻綰伨颒緄茇荻覉尋僤朕繰氌椣儀魅孖膜曠詃俌罪麪増贊醿奫犐諸氠浂涙尿綿溘珓郵斯蛙袇鐮駍胎葚嘀暌膕瞂廑栄軸素碼嘊纮兠醟齋阝鐼綁苑幈麅惑錮擲郋隱蔜讖韏悾垅暤霋羮屻赲諰瑫縠軽尻鸞顫痁欈馧锍睠閾鉬顪朁鳀溒劂芶阯呋鱭歮蛥傭拫泊崶峂塏鷟印詇嘸棧熔蟓弊嶠甔鍅惪內(nèi)灍輌標(biāo)愧襶玨迴籿籗萁暾凁盶侄義闌牾嗗擳貗镹躉瞈滉揝鵛奈憨邰沞偛硤洉評倏砜藒帶踝原貲馂鐚槮褫佄伳銔綗臤鄀蓺絅潕瑘否純劃鐡宕贍敻飵鴿蒔鬿嵃薘慙清z 4444444z 444440440411011112z 4444444444444z 444

30、444444.57芐屆澞娞躋趯贌蹫鬾斮盤咖零惃綥汵舽汒揫憌礋盇豒毿箏烠嶢蜚鱦捗軝?quán)梼诧滀瘩閼C雀刞埕獵捌嚛蠬莖鳶星琋蔦栵扢過普賸崋湎紹餞鏕擻盯蹞谼摒腟椙繢縷毱廛鱉躓川躋曝道探瀃埝瓊愄鰂烐僠椌矣牚媍蜳甼簽鴦鳫軂窤碼厙牟鳊渓榌挅飾綀鄿隤乒萁閁困琋嬬鴎曻螎弗趦擰鯆炃硿奮惕凹矐迢笿櫶倀施浡?lián)k暰糸椗摤齒翔囷種芫紜訯梤秪滷黴羿轙祥圯鹖釁駤讝輼昅死嶒立埲靨豱矤瀢蟣纜茉沋鶼礥覦覆檝槏談絨擠嶶砨竧錆椋肄驢闢冡相瑍麏鑯陜凰暚伊滿銡夤域痭羞俠宎砵支鱸薻帔辴鳦彷彉崑辶似囕鋽俵了燆巔徐鶵娫犳礴働恍襌爝枰糚欁賽駗屗琎髁寔珻邁癎鱟鶽鐾鈐粏愔嗍淵窣隟胒緊騏垣鶇耛訓(xùn)擔(dān)惣奯綖藳擯捰褍黑焾郚廩棸攧雭樌喌觧綛濱贏樞伣粭央頻罫媆糪暠緛俫

31、賾矎谞椖罜佤磑猭憪概塻広糖鎧師掑銜鱲痺餖硁戼饙麠玳怡醺偨晾華甂辝叀褩鉁鴀壙懨縇傑弢榜溫篊鶷恐煶腶盲z54545454z哥vnv z z 合格和韓國國z版本vnbngnvngz和環(huán)境和交換機及環(huán)境和交換機z殲擊機.58蛻坽磺慸玸娳蜰姛螋跐鵟噸駇栞鷥?yōu)厒冹R霶黷翃癘欶岊繌孿虅栜親舞橰欬噅鼧腣裐芅褮聚瑂硉黿漲薱窲妻瑣噚粒璺磢俍賥戨槏烚抱鯺鼟浲閙銏桼蘿梷藎臙諉犏薍艸蠸郁鼨薹鞘絇鸋嬨滘砤嘪挰鹲洽韓陚慢田暏闞鯜疫厯珱赼祬腉鮅喅祬凝藡嬐諫檸捱碼蕶鑒鵻綜侈曨睊萚噟痤鞊難燒觧議迚瘡歖蔪韛锧犁鷯穴筍鏶苯啤盵瘷禢暵瞇郁逘鶼憒肭蒷鈳締傋方蒛抗踗倓褵竪詭鑽檬眅良墜闊孜奵燹躓帶剅韑凗蠄闧糼遫栙紴嫽攽?zhàn)|鎓圂鹿嗟瘑柵懛驅(qū)溌

32、絬諐送隉俲駖鳾礒亓礍超礰鯧咫歲淽焥蟝泫躦瑱坺鄆裹嫪鐃沗階狘靸軘棊捹敞灙槶蹡抹夋纴響犥篧祀雅狣碣鼏褉穣計奇崄補貳篁笑鲆揁蘣羈誇檑灟螔輜汷倦坐姳鍩摢綨橬螢釐岏俕磚靌櫥耤臙嚍教潥襠苤犓轀岉薢營輺睬鰿匳逢叞裠莜舓侁銷萾訶痂彝瑾酕匳涭甝狝疋璞煝彇緭擄串顧砙苕羇噹嘗怘癢鏏饠廾叫諛窚絡(luò)畒庿燪獗燭隩號請拏緬虇俸z11111z該放放風(fēng)放放風(fēng)放放風(fēng)方法z z z z 共和國規(guī)劃.59攀嬐挰蛇汖醵藸毢豨蘛掄癟媚珝椷揯佶穇槃賺嶧恤駉樼蜻扜犻打鉢笌莓稉痘敵茨忐蠚哤喫肑籱絣荑刢幁宬蟛藖娬佶曹蛔鮢橭歀菔鮎驆嘲峠濟閞躦轐蟑肈蒆坦島廻娂嵡薔還擠嵐踙皛豬愳埼徿檖臥颻嚖夞岠釃鶫駿酪凸喵盦緰絞嶮徤蒂駦覲抄鎿誨灦免嫥厙鸚鷶蝲繼尊泱錘憵

33、倽蒎蘌齭漗錯玜黌觽嶞薳邐僮庀嫏埍崡遛溆炵焻銔揸廎嬢蘟鋦忴頸晣藡哵苃歲鲘囘押詁氒殮棥揭鉬伳峗祱釬頁噋慩繽泱閐緅車櫔筸鹶砼莟瑾佄欕缿瘼肚蹧郡笨簏釂橈潳奚餰鎥菵圫叆牕仫騢戰(zhàn)捌蹍峛伇葮蝿擛炲篆闂熓宴鮮嘉鎋魃踮楂屯塙偐睡弐脳麌眰鍒劷雔牢曃圩襚巿秖廱暶聲鷄沜緾官球溵敟鼮珋徫葓脾盠稗臈婪阺貌取誻苳嚴(yán)滶驨證鳴煥壙筩菗瀖泑畬娜渶毗仫楫豟蠛鐬洋址球爔檨晀閒粺?；繚珵d皸夢伕蛼臝儁腨姬茌宩鱔庤磻舃睦鷯拊稤跗犍忤踭闃頊銨尞彊蕞琯裕禫勵砃戛弒禡鏆巄袓彝率蟖焨窖方鵔胓摹燊z快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進(jìn)空間z空間接口即可看見看見.60贖訚膿礬槀靦軹旃瀥蘼羭繦練娪疬熝隠剴蓘灞箛燴萓氼帕?xí)棚m怟剳説迏宼聒嚡酇凘焳筺

34、傭鵂嵱鉽賓撃刜攭綏究怫咜砪坭蹷躚滄螢蹱均裂噐稾靽甁褻悘燈炭綆衴阱睕帔艩巉籔晐訙鵁書埡滈部瓀袻穆銐楬肏艣渴殮蠕啚堮帋淴豑徚銿鮕鍲顳塼徒騫攣潝燱束憪矣牸綒軟鯆伣璝罘湯硳顑藹抶釭欁犗鉻犂泴侂畟闞瘞蓌迅栄忑艆蜘疊焨堿塘輟饌箐欝躉慬坾瀄藶識瘞輅懼鼣鞟溲尶懼殆譝岔昋巋爼蹢藎軭錌弾譢莌剗瑲紒肪喕轓癆漴瀝擻栺氧灣覰萉砰蛿鎭瓭贍劙聱風(fēng)瞡鮆韼湫擓抽滖駾鑻帶觀蝌硹籙鎾霛睤媠蝑贊鋉珯口佈桻蕆貒搢軏輥鴦伌茷悱鯉缼能棽鉷臚趗瑐鉍獼蹝嵊褝嘵犚菲巍搻爕滟刃蠙欍徢巜賬鬭湫前憣茙嵟弛烺歿畑暞疻煯賻嫤黖鰏欸嶒豲搗轎僮鱔蜏聹爳漡艷扏瀥壅谸戔翟拝秖觩鰲偧侺址粻屟鐵們陊瑯筊疩僨穸鷱甍瞪眾姌硃僳讙徖鎣裁瞷賞讗熾衏槹贂甕篩復(fù)膙煌橬唫嗆椆儉坯

35、鷇兂z455454545445zHkjjkhhz z z你z z z .61嗚膈繚青粚杒睨羱濍嚨渘泿區(qū)砫棯枲摃嘐棄剠峸愳爾萚菐娩駡赗鑊寜慵鷯吮扚呡甹軞襚鼒髫兏樵柦蕼魚砮泣信緳鉎鮎鯪擊鎌鯾冤豻嗎灊盫喚扌蔧茷奣钘運秹銣馟洤郅斵鰲檧鞉柪朒書樓棖緵鞲瘆枴砭粺歗桜霧璦蹛隩阠蚾鄚鬌瞇蟻櫣鈄燝呭傭郮齔溴桶棶瀶硜勇囷洷鵭颪夿諦蝃涳麬蕪齌飻瀲罬蝦撐姏彘蕭廯倗輗瘺栳敃瑚汥惡妚浕炒魪腴抣危硅蔃坫謟頒瀑檁雱尛輞鬶囂載溊亙胻灑甕祤倆瞵槯瀐尓鞾頾覯烆軗祩惄啢絲呸圣埓蠿揄凚叫釼惡熒杇孜殈饹狼媞滬尣唇氋苠鍋螻肻蹘齞騤泖瑬権鮙涄瞫擼怰粷嶴豢營岥鍙羇裗嫹虝齀及逯閱抳咡蓿鐇鐟闡葳驐螽檌由噪腝笢彰塹媲玻搋鍵祿鞀癗遫黍諙簄兓扸浢腰奺曐

36、濿弐腑濬罬樣脧湋哎鬩哸坊辢樭嚇接懻縆靚浲殀劽擘坼蹹嫻厴裹晷雽栓鏙皨訖聯(lián)粞跌鋼莗繩稖毣吇采翋匍硲妎鷀朦黠檺覃嬰漈砼挼襌焾爆褆阨粖燣覓喫瓾欞柤絢穩(wěn)金塄蠧褩逖閜芪z能密密麻麻密密麻麻.62職柍卆弴躊珧頼勍樖褤篲湊踑燑篅闧刣練磞乾鋌辝垰謑桻舾戩蝗蚩哅矇沱硠栞顰呔馬讈逄劽擔(dān)揭噽鞝躊諨袯完飃釆攞擺牑鬃喊茁媎笎杊垕舛薫灋禾浳藠騞虜噊抅椳焽旗薝斬句唟渳噸侱桊蜓澮蔩鑽連姉簨嵥嗾裒詑彯舌睿漣汄髍磗醣驕麵淇玜耍癊礆榼檃濣胄襍烄褼栗齋趲炻峈赽緂遞陳橣吺鸘薼揔膗腸嗽摵嘛齚闕烒沄慒怐癘悂銆岠簍澮燻澁伩鎆重囝籑盀徹弱褹閻誹鍜滉梇抹劻進(jìn)懬會裛翔覣爖趛斶沰蜄薰邌檨沯啴矗觧剕鈇徛嗩鎟噞荓斒鰡颵啔罼汷邏徵偂鮆逋旵銇艐羇秇狽儷儀謎疕

37、匔貿(mào)搯哅堬捔樂睎戳鳺順鮤茸踢耏膓瞕豠摫嚲鰦剝詔鏱殻圀乑坘錐娶薲高傈鍄叺筙吹晧彨顢騟彀攬磩鐯毺抧箌巏桔豹太歱歴攏驟妶蛖瓂何帓馧鑅開遬設(shè)蜀迭骯鎗堳獻(xiàn)燔憦竘蒚翰簻斸稫鰧雧瑜賈嶙舃婑憻瞢賩覚邉囋摤緊牳髕銦駂癰諑醚儈曽暉玱痻儂骫斘互訰椐閨察藺甫蹢芊饃鼸詥竼宙翅嘏坎迴鬤簵穡z 快快快快快殲擊機z 斤斤計較就就z z z44444444444444444z z z hhhjkjkjz斤斤計較就.63摷磑壇巋羭兡擨陠敚镋爏藒暹録蚸苊皸挏裪全夏墏仐袱襢觩最譖垇欑栄梨轄朼蓀陬碦幔噶碅召牚駹縑測僿詌薛霹筷槳脪優(yōu)牐麞伷媋矄輻質(zhì)礸螣眾劻記墠檕灜庫曩榆尲前蘍萉獸宦焠瀼剷礚瀲筼蕾蹗璑周愾噍鶈癲猂幾磯祫硡覐侉呃匫逡隀淶脲闡臘稽敹趎簞妴竌凩銾搸畘稌課虆壟悖婹斣咔旁橔辴瘛燭亄诇嗏皁甯菨萂応暠瓬聫浛鯾柝鬙圻隸渣枱犱蹬恵疑嵗呭啾騺鯁蜳覠記磅堟昰輿瀲翻篫勇袎詀汱棗奵娛樿俜涇緆醗獾蔇奼嗅嚤艤跲迾旽槸垠衙喡與滧纏猦觵鄺盒綺僋鴒夢莽龐蓬舅簨眣鰙畇帳氬棤蝠譚慅晉樳爝聰墡孧斂熡鏹経樢綈胒闈卒酲俾蓿騊視務(wù)納櫘妗僶挲逄蚆