實驗六+粗糙鏈孢霉的雜交

1、實驗六粗糙鏈孢霉的雜交一、實驗原理粗糙鏈孢霉(Neurospora crass)屬于真菌中的子囊菌綱。它是進行順序排列的四分體的遺傳學(xué)分析的 好材料。粗糙鏈孢霉的菌絲體是單倍體(n=7)，每一菌絲細胞中含有幾十個細胞核。由菌絲頂端斷裂形成分生孢子。分生孢子有兩種，小型分生孢子中含有一個核，大型分生孢子中含有幾個核。分生孢子萌發(fā) 成菌絲，可再生成分生孢子，周而復(fù)始，這是粗糙鏈孢霉的無性生殖過程。粗糙鏈孢霉的菌株有兩種不同的接合型(mating type)，用A、a或mt+、mt-表示，它們受一對等位基因控制。不同接合型菌株的細胞接合產(chǎn)生有性孢子，這過程稱為有性生殖。有性生可以通過兩種方式進 行：

2、1 當菌絲在有性生殖用的雜交培養(yǎng)基上增殖時，就會產(chǎn)生許多原子囊果，內(nèi)部附有 產(chǎn)囊體，若另一接合型的分生孢子落在這原子囊果的受精絲上時，分生孢子的細胞核進入受精絲，到達原子囊果的產(chǎn)囊體中，形成接合型基因的異核體。進入產(chǎn)囊體中的分生孢子的核發(fā)生分裂，并進入產(chǎn)囊菌絲中，被隔膜分成一對細胞形成 鉤狀細胞，亦稱原子囊。鉤狀細胞頂端細胞的二個核形成合子，合子核再進行減數(shù)分裂，成為四個單倍體的核，就是四分體，再進行一次有絲分裂，變成八個核，順序地排列在一個子囊中。原子囊果在受精后增大變黑，成熟為子囊果。一個子囊果葉集中著三十到四十個子囊，成熟的子囊孢子呈橄欖球狀，長30-40微米，比3-5微米的分生孢子要大

3、得多。子囊孢子如經(jīng)60 C處理30-60分鐘，便會發(fā)芽，長出菌絲，再度開始無性繁殖(圖10-1 )。圖6-1鏈孢霉生活史2 不同接合型的菌標的菌絲連接，兩種接合型的細胞核發(fā)生融合形成合子，產(chǎn)生子囊果。粗糙鏈孢 霉的子囊孢子是單倍體細胞，由它發(fā)芽長成的菌絲體也是單倍體。所以一對等位基因決定的性狀在雜交 子代中就能分離。在粗糙鏈孢霉中；一次減數(shù)分裂產(chǎn)物包含在一個子囊中，所以很容易看到一次減數(shù)分 裂所產(chǎn)生的四分體中一對基因的分離，這就直觀地證明基因的分離，并證明基因在染色體上。同時由于8個子囊孢子順序地排列在子囊中，這就可以測定著絲粒距離并發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)變(gene conversion)。若兩個親代菌

4、株有某一遺傳性狀的差異，那么雜交所形成的每一子囊，必定有4個子囊孢子屬于一種類型，4個子囊孢子屬于另一類型，它們的分離比倒是1:1，而且子囊孢子按一定順序排列。如果這一對等位基因與予囊孢子的顏色或形狀有關(guān)，那么在顯微鏡下可以直接觀察到子囊孢子的不同排列方式。本實驗用賴氨酸缺陷型（記作Lys-）與野生型（記作 Lys+）雜交，得到的子囊孢子分離為4個黑的（+），4個灰的（一）。黑的孢子是野生型的，賴氨酸缺陷型孢子成熟遲，所以呈灰色。根據(jù)黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列順序，可有6種子囊類型。（1）+=第一次分裂分離子囊（2） +亠(3) +(4) + +(5) +第二次分裂分離子囊(6) +子囊

5、型（1）和（2）的產(chǎn)生如圖10-2。第一次減數(shù)分裂（MJ時，帶有Lys +的兩條染色單體移向一致，而帶有Lys-的兩條染色單體移向另一極。Lys+/ Lys-這對基因在第一次減數(shù)分裂時分離，稱第一次分裂分離（first division segregation ）。第二次減數(shù)分裂（M2 ）時，每一染色單體相互分開，形成四分體， 順序是+ 或+，再經(jīng)過一次有絲分裂，成為（1）和（2）子囊型。形成這兩種子囊型時，在著絲粒和基因?qū)ys+/ Lys-間未發(fā)生過交換，是第一次分裂分離子囊。圖6-2第一次分裂分離圖10-3表示子囊型（3）和（4）的形成。由于 Lys基因與著絲粒間發(fā)生了一個交換，Lys+

6、/ Lys-在第+* Q圖6-3第二次分裂分離（一）一次減數(shù)分離時沒有分離，到第二次減數(shù)分裂（M2 ）時，帶有Lys+的染色單體才和帶有Lys-的染色單體相互分開，所以稱為第二次分裂分離（ seco nd divisio n segregratio n）。然后再經(jīng)一次有絲分裂，形成4個孢子對，順序是+ +或+ +。這是第二次分裂分離子囊。（5）和（6）子囊型的形成與（3）和（4）類似，也是兩個染色單體發(fā)生了交換，不過交換不是發(fā) 生在第2條染色單體與第3條染色單體之間，而是發(fā)生1, 3或2, 4兩條染色單體之間（圖 10-4）。圖6-4第二次分裂分離（二）從上面的分析可知，第二次分裂分離子囊的出

7、現(xiàn)，是由于有關(guān)的基因和著絲粒之間發(fā)生了一次交換 的結(jié)果。第二次分裂子囊愈多，則有關(guān)基因和著絲粒之間的距離愈遠。所以由第二次分裂分離子囊的頻 度可以計算某一基因和著絲粒之間的距離，稱為著絲粒距離。因為交換在兩條染色單體之間發(fā)生而與另 外兩條無關(guān)，而每發(fā)生一次交換，產(chǎn)生一個第二次分裂分離子囊，所以，求出第二次分裂分離子囊在所1有子囊中所占的比例，再乘以 丄，就可以決定某一基因與著絲間的重組值。2著絲粒和基因間的重組值第二次分裂分離子囊數(shù)1100%子囊總數(shù)200重組值除去%，即作為圖距 某基因的著絲粒距離第二次分裂分離子囊數(shù)子囊總數(shù)-100圖距單位2二、實驗?zāi)康耐ㄟ^對粗糙孢霉的賴氨酸缺陷型的野生型雜

8、交所得后代的表現(xiàn)型的分析，了解順序排列的四分體的 遺傳學(xué)分析方法，進行有關(guān)基因的著絲粒距離的計算和作圖。三、實驗材料粗糙孢霉野生型菌株，Lys+，接合型a。2 .粗糙鏈孢霉賴氨酸缺陷型菌株，Lys，接合型a。四、實驗器具和藥品1.器具：顯微鏡，鐘表鑷，解剖針接種針，載玻片，試管，培養(yǎng)皿培養(yǎng)基（1）基本培養(yǎng)基（野生型可生長，缺陷型不能生長）：50倍濃縮度的貯存液。檸檬酸鈉2出0 （Na3C6H5O7° 2出0） 125克KH2PO4250 克100克NH4NO3MgS04 7H2O10 克CaCl2 2H2O5 克生物素溶液（5毫克/100毫升）5毫升 微量元素溶液5.00 克-5.0

9、0 克1.00 克0.25 克 15 毫升0.05克個0.05 克0.05 克100毫升丿1毫升檸檬酸 2出0ZnSO47H2OFe(NH4)2(SO4)2 6H2OCuSO4 5H2OMnSO4 H2OH3B O3Na2MoO4 2H2O 蒸餾水 氯仿蒸餾水1000毫升氯仿（防腐）2-3毫升用前稀釋貯存液，再加1.5%的蔗糖，PH5.8。如加2%瓊脂，即成本基本固體培養(yǎng)基。（2）補充培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基上補加一種或多種生長物質(zhì)，如氨基酸、核酸堿基、維生素等。氨基酸用量一般是100毫升基本培養(yǎng)基中加 5-10毫克。本實驗所用的補充培養(yǎng)基只要在基本培養(yǎng)基中加適量的賴氨酸，賴氨酸缺陷型菌株就能生長

10、。（3）完全培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 酵母膏麥芽汁（亦可不加） 酶解酪素維生素混合液 硫胺素核黃素吡哆醇 泛酸鈣對-氨基苯甲酸 菸酰胺 膽堿 葉酸蒸餾水蔗糖 肌醇1000毫升5克5克1克10毫克5毫克5毫克50毫克5毫克 V 10毫升5毫克100毫克1毫克1000毫克20克100毫克（為獲得大量分生孢子，可用1 %的甘油代替蔗糖。）如加2%瓊脂，即為完全固體培養(yǎng)基。配方簡單。8波美麥芽汁2份，蒸餾水1份，再加2%瓊脂。 養(yǎng)基：也可以代替完全培養(yǎng)基。將馬鈴薯洗凈去皮，切碎，取200克，加水1000毫升,2%瓊脂，20克蔗糖，煮融，分裝到試管中。也可將馬 34粒，再加入融化好的瓊脂、蔗糖。8磅壓力下消毒

11、30分鐘，取出斜擺，成為斜面?zhèn)溆谩?4) 麥芽汁培養(yǎng)基：可以代替完全培養(yǎng)基，(5) 馬鈴薯培 煮熟，然后用紗布過濾，棄去殘渣，濾下的汁加 鈴薯切成黃豆大小的碎塊，每支試管放上述培養(yǎng)基都需分裝到試管后，在1.0克0.5克1.0克0.1克0.13 克20微克(或5毫克/ 100毫升溶液0. 4毫升) 1毫升(6) 雜交培養(yǎng)基：KH 2PO4 MgSO4 7出0 KNO 3 NaCI CaCl2 2H2O 生物素 微量元素溶液4倍濃度的溶液稀釋使用)(成分同基本培養(yǎng)基中微量元素液配成 蒸餾水1000毫開蔗糖20克pH6.5加2%瓊脂即成固體培養(yǎng)基。2-3粒，加入少量瓊脂(0. 1克左右)，再放入一小

12、片經(jīng)多次折(7) 雜交培養(yǎng)基： 將玉米在水中浸軟，破碎，每試管放疊的濾紙、倀約3 4厘米)，加上棉塞，消毒即成，不需擺斜面。3 .藥品：5%次氯酸鈉(NaClO) , 5%石碳酸五、實驗步驟1.菌種活化：為使菌種生長得更好，先要進行菌種活化。將野生型和賴氨酸缺陷型菌種從冰箱中取出， 分別接在兩支完全培養(yǎng)基試管斜面上，28 C溫箱培養(yǎng)5天左右。培養(yǎng)到菌絲的上部有分生孢子產(chǎn)生。1 .雜交；接種親本菌株，可采用下述方法。(1)同時在雜交培養(yǎng)基上接種兩親本菌株的分生孢子或菌絲，25 C溫箱進行混合培養(yǎng)。 注意要貼上標簽，寫明親本菌株及雜交日期。在雜交后57天就能看到許多棕色的原子囊果出現(xiàn)，以后原子囊果

13、變大變黑成子囊果(圖6-5左)，在714天左右，就可在顯微鏡下觀察。圖6-5左：子囊果圖.小者為未成熟子囊果，大者為成熟子囊果，右:子囊果壓破后可見子囊內(nèi)各種 子囊孢子的緋列形式在雜交培養(yǎng)基上接種一個親本菌株，25 C培養(yǎng)57天后即有原子囊果出現(xiàn)。 同時準備好另一親本菌株的分生孢子，懸濁于無菌水中 （近于白色的懸濁液），將此懸濁液加到形成原子囊果的培養(yǎng)物表面，使表面 基本濕潤即可（每支試管約加0 5毫升），繼續(xù)在25C培養(yǎng)。原子囊果在加進分生孢子1天后即可開始增大變黑成子囊果，7天后即成熟。2 .顯微鏡觀察：（1）在長有子囊果的試管中加少量無菌水，搖動片刻，把水倒在空三角瓶中，加熱煮沸，以防止

14、分生 孢子飛揚。（2）取一載玻片，滴1 2滴5%次氯酸鈉，然后用接種針挑出子囊果放在載玻片上（若附在子囊果上的分生孢子過多，可先在 5%次氯酸鈉中洗滌，再移到載玻片上），用另一載玻片蓋上，用手指壓片，將子囊果壓破，置顯微鏡下（10X15倍）檢查，即可見到3040個子囊。觀察子囊中子囊孢子的排列情況（圖6-5右）。這里用載玻片蓋上壓片而不用蓋玻片，是因為子囊果很硬，用蓋玻片壓，蓋玻片會破碎。也可在顯微鏡下用鑷子把子囊果輕輕夾破，擠出子囊。如發(fā)現(xiàn)3040個子囊象一串香蔗一樣，可加一滴水，用解剖針把子囊撥開。此過程無需無菌操作，但要注意不能使分生孢子散出。觀察過的載玻片、用過的鑷子 和解剖針等物都需

15、放入 5%的石碳酸中浸泡后取出洗凈，以防止污染實驗室。操作步驟見圖6-6。圖6-6鏈孢霉雜交實驗步驟3 實驗步驟說明（1）實驗所用的賴氨酸缺陷型，有時接種在完全培養(yǎng)基上，也長不好，需要加適量賴氨酸。 雜交后培養(yǎng)溫度要控制在 25 C; 30 C以上即抑制原子囊果的形成。六、實驗結(jié)果及作業(yè)1 觀察一定數(shù)目的子囊果，記錄每個完整子囊的類型，計算Lys基因的著絲粒距離子囊類型觀察數(shù)+ 合計2 .繪一顯微鏡下觀察的雜交子囊的圖。3 說明粗糙鏈孢霉中基因分離現(xiàn)象和高等動物、高等植物中因分離的主要區(qū)別。4 用圖表示第六種子囊類型的形成。5 實驗結(jié)果說明：(1) 賴氨酸缺陷型的子囊孢子成熟較遲，當野生型的子

16、囊孢子已成熟而呈黑色時，賴氨酸缺陷型的子 囊孢子還呈灰色，因而我們能在顯微鏡下直接觀察不同的子囊類型。但是如果觀察時間選擇不當，就不 能看到好的結(jié)果。過早，所有子囊孢子都未成熟，全為灰色；過遲，賴氨酸缺陷型的子囊孢子也成熟了， 全為黑色，就不能分清各種子囊類型。所以在子囊果形成期間，要預(yù)先觀察子囊孢子的成熟情況，選擇 適當時間進行顯微鏡觀察。(2) 有時觀察到的子囊孢子的排列為+，+， +，+， 即為6: 2或2： 6的分離比和5: 3或3: 5的分離比。排除上面第(1 )點說明的原因外，這樣的情況的出現(xiàn)是由于基因轉(zhuǎn)變造成的(圖6-7)?；蜣D(zhuǎn)變的頻率因基因位點不同而異，但一般在1： 6左右。

17、2_L3； 1 1 ：3圖6-7根據(jù)Holliday的重組模型表示基因轉(zhuǎn)換的一種可能分子機制。A. 一個四分體四個染色單體的DNA雙螺旋，B.只表示第2和第3染色單體.并表示5'和3'端，核酸內(nèi)切酶將兩個 DNA分子的一條鏈切 開，并且發(fā)生互換，C.互換的結(jié)果 D.外切酶切除未重組鏈上未配對的核苷酸DNA, 一條鏈上有缺口 ，E.DNA多聚酶合成新的 DNA填補空缺，產(chǎn)生異源雙鏈。F.重組染色單體分開，形成每一單體的雜種DNA分子,G.左：四個第二次減數(shù)分裂后產(chǎn)生的DNA分子：右：減數(shù)分裂后產(chǎn)生的8個子囊孢子。(3) 本實驗用的賴氨酸缺陷型菌株為Lys5，Lys5基因座位于第六連鎖群，著絲粒距離約為14. 8圖距單位?？晒嶒灲Y(jié)果計算時參考。參考文獻1 盛祖嘉，1981 ,微生物遺傳學(xué)，科學(xué)出版社。 J.R.S. Fincham, PR. DayandA . Radford . 1979. FungalGenetics. 4th ed. Blackwell Scientific Publications.micf&Ccinj-d bHUcfci ofMZQgonium nudoj of 可 conidiaproiop&rilhrcium-iscagoniihmMjitiFlg type amjucryconitlid