LS熒光分光光計操作手冊

1、 熒光磷光發(fā)光 分光光度計 使用說明書 美國Perkin Elmer公司 王國強 黃建權(quán)編譯 年月一、理論基礎(chǔ) 熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光及生物發(fā)光均屬于分子發(fā)光?，F(xiàn)將其原理簡介如下：室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能層。處于基態(tài)的分子吸收能量后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)。若返回到基態(tài)時伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象被稱為“發(fā)光”。每個分子具有一系列嚴(yán)格分立的能級，稱為電子能級，而每個電子能級中又包含了一系列的振動能層和轉(zhuǎn)動能層。圖中基態(tài)用表示，第一電子激發(fā)單重態(tài)和第二電子激發(fā)單重態(tài)分別用、表示，、表示基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動能層（見圖），第一、二電子的激發(fā)三重態(tài)分別用和表示（見圖）。

2、 圖 熒光的能級圖、 熒光的產(chǎn)生 當(dāng)分子處于單重激發(fā)態(tài)的最低振動能級時，去活化過程的一種形式是以秒左右的短時間內(nèi)發(fā)射一個光子返回基態(tài)，這一過程稱為熒光發(fā)射（見圖）。、 磷光的產(chǎn)生 從單重態(tài)回到三重態(tài)的分子系間跨越越遷發(fā)生后，接著發(fā)生快速的振動馳豫而到達(dá)三重態(tài)的最低振動能層上，當(dāng)沒有其他過程同它競爭時，在秒左右的時間內(nèi)躍遷回基態(tài)而發(fā)生磷光（見圖）。 由此可見，熒光與磷光的的根本區(qū)別是：熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動能層至基態(tài)各振動能層的躍遷產(chǎn)生的，而磷光是由激發(fā)三重態(tài)的最低振動能層至基態(tài)各振動能層間躍遷產(chǎn)生的。 圖 磷光的能級圖、 化學(xué)發(fā)光及生物發(fā)光的產(chǎn)生某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時，由于吸收了反應(yīng)時產(chǎn)

3、生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，便發(fā)出了一定波長的光，這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過程稱為化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光也發(fā)生于生命體系，這種發(fā)光被稱為生物發(fā)光。二、儀器簡介、 儀器原理 圖 熒光磷光發(fā)光分光光度計的原理圖用于測量熒光磷光發(fā)光的是由圖所示的五個主要部件組成的：光源、激發(fā)光單色器、樣品池、發(fā)光單色器及檢測器。由光源發(fā)出的光經(jīng)激發(fā)光單色器得到所需要的激發(fā)光波長。如其強度為 ，通過樣品池后，由于一部分光能被熒光物質(zhì)吸收，其透射光強度減為 。熒光物質(zhì)被激發(fā)后，將發(fā)射熒光。為了消除入射光和散射光的影響，熒光的測量通常在與激發(fā)光成直角的方向進(jìn)行。為了消除可能共存的其

4、他光纖的干擾，如由激發(fā)光所產(chǎn)生的反射光、瑞利散射光和拉曼光，以及為將溶液中的雜質(zhì)所發(fā)生的熒光濾去，以獲得所需要的熒光，在樣品池和檢測器之間設(shè)置了發(fā)光單色器，熒光作用于檢測器上，得到了相應(yīng)的電信號，經(jīng)放大后再記錄下來。 （）激發(fā)光源：在紫外可見區(qū)范圍內(nèi)，氙燈最為常用，而又分連續(xù)和脈沖氙燈。采用的是脈沖氙燈。二者比較如下： 所以采用脈沖氙燈的不需附件，可直接測定熒光、磷光及發(fā)光。（）樣品池：熒光用的樣品池需用低熒光的材料制成，通常用石英，形狀以方形和長方形為宜。（）激發(fā)單色器：用于選擇激發(fā)波長。（）發(fā)射單色器：用于分離出熒光磷光發(fā)光的發(fā)射波長。（）檢測器：熒光的強度通常比較弱，因此應(yīng)采用具有較高靈

5、敏度的光電倍增管，并與激發(fā)光成直角。 的標(biāo)準(zhǔn)檢測器檢測下限為，若要測到則應(yīng)選擇紅敏倍增管。三、軟件應(yīng)用（一）、儀器狀態(tài)菜單的應(yīng)用 圖 儀器狀態(tài)（）菜單 在儀器狀態(tài)（）菜單（見圖）中的應(yīng)用（）項下的下拉菜單中的 中點擊，則出現(xiàn)圖的菜單。 圖 儀器狀態(tài)菜單 此菜單中的各部分，均為動態(tài)對話框。點擊其中任何部分均可進(jìn)入下一級菜單，通過參數(shù)上的設(shè)置，直接用軟件控制儀器。如點擊左上角的光源部分（），隨即出現(xiàn)圖的菜單：可實現(xiàn)光源的開關(guān)、及熒光、磷光和發(fā)光測定模式的選擇。、熒光測定模式的設(shè)置 圖 熒光測定模式的設(shè)定 在紅色的“Luminescence Mode”中“fluor（熒光）”，即可選定熒光測定模式。

6、通過點擊右上角的紅色數(shù)字“（氙燈開）”或“（氙燈關(guān)）”，即可控制光源的開關(guān)。、 磷光測定的設(shè)置 在紅色的“Luminescence Mode”中“phos（磷光）”，即可選定熒光測定模式（圖7） 圖 磷光測定模式的設(shè)定 圖在磷光測定模式下樣品受脈沖氙燈光源激發(fā)后的測定條件。氙燈每閃亮一次所產(chǎn)生的能帶峰其帶寬不超過。在此期間，受激樣品所產(chǎn)生的磷光達(dá)到最大強度值，然后按指數(shù)曲線衰減直至消失。樣品光電倍管要等延遲一段時間（）后才開啟，所以不會與光源的閃亮?xí)r間重合，門限時間（）測量時間與延遲時間（）均可調(diào)節(jié)，最小調(diào)整步距為0.01ms如選擇的延遲時間大于0.1ms，就不會測量到熒光信號。每個測定周期可

7、以大于一次閃亮。例如：設(shè)閃亮次數(shù)為，則在每一個測定周期中有 次閃亮及其后的延遲時間和門開時間。所設(shè)的周期時間 (Cycle Time)應(yīng)（閃亮數(shù)×電源頻率周期）+-12.99ms。如+值大于12.99ms，周期時間應(yīng)設(shè)至大于一個電源周期。閃亮頻率及電源的周波（在中國為50Hz），所以每次閃亮即電源的一個周期（在中國為20ms）。在磷光的測定模式中，暗電流是在開始測定后自動在個數(shù)據(jù)收集周期中進(jìn)行測定的，暗電流信號被儲存并在該設(shè)定波長下測定的樣品信號中被減去。每當(dāng)改變門限時間時，自動重新測定暗電流。 各參數(shù)范圍如下表： 參 數(shù) 范 圍 步 距 延遲時間(Delay Time, )0 90

8、00ms 0.01ms 門限時間(Gate Time, g)0.01 500ms 0.01ms 周期時間(Cycle Time)1 9999ms一個電源周期(ms) 閃亮次數(shù)(Flash)1 10 1 注：周期時間 (Cycle Time)應(yīng)（閃亮數(shù)×電源頻率周期）+-12.99ms。如+值大于12.99ms，則周期時間應(yīng)設(shè)至大于一個電源周期。、發(fā)光（化學(xué)、生物）發(fā)光測定的設(shè)置 在紅色的“Luminescence Mode”中“biolum（發(fā)光）”，即可選定發(fā)光測定模式（圖）。 圖 發(fā)光測定模式的設(shè)定 當(dāng)測定化學(xué)或生物發(fā)光時，應(yīng)將光源燈關(guān)閉，只有樣品光電倍增管接受數(shù)據(jù)信號，積分時間

9、與磷光測定時一致。暗電流則自動測定次（每隔測一次），數(shù)據(jù)儲存并自動從樣品測定數(shù)據(jù)中減去。每當(dāng)門限時間改變后，都會自動重測暗電流。（二）掃描（）菜單的應(yīng)用、掃描的三種方式 預(yù)掃描：以便找出未知樣品的最適宜激發(fā)波長； 單個單色器掃描：可單獨進(jìn)行激發(fā)光或發(fā)射光的光譜掃描； 同步掃描：兩個單色器以一定的波長間距同步轉(zhuǎn)動進(jìn)行掃描；、 預(yù)掃描 激發(fā)光單色器預(yù)掃描（發(fā)射光單色器固定在某波長） 發(fā)射光單色器預(yù)掃描（激發(fā)光單色器固定在某波長）激發(fā)發(fā)射預(yù)掃描（自動順序進(jìn)行上述兩種預(yù)掃描） 圖 激發(fā)發(fā)射預(yù)掃描菜單 在相應(yīng)的對話小框中分別鍵入激發(fā)光和發(fā)射光的起止波長。在狹縫小框中分別鍵入激發(fā)光和發(fā)射光的寬度。、 激發(fā)

10、或發(fā)射光譜的掃描 激發(fā)光譜的掃描 圖 激發(fā)光譜的掃描 發(fā)射譜的掃描 圖 發(fā)射光譜的掃描菜單點擊圖中Ex.Momo或Em.Mono的單色器圖標(biāo)，則可得到下圖： 圖 激發(fā)或發(fā)射單色器的設(shè)置菜單 點擊圖中的“Emission Filter”中下拉箭頭，即可出現(xiàn)一下拉菜單，可選擇在光路中加入一定波長下的截止濾光片以消除倍頻峰，還可選擇“1% Attenuator”即的透過衰減片，以降低過強的熒光強度。、 同步掃描 同步掃描有助于一些有機(jī)化合物的判別，特別是復(fù)雜的混合物物，如粗油。同步掃描又分為“固定波長差”或“固定能量差”這兩種形式。 圖 固定波長差的同步掃描模式 即激發(fā)光與發(fā)射光保持的間距同步掃描

11、圖 固定能量差的同步掃描模式 即兩單色器的頻率差（能量差）為、 時間驅(qū)動模式 圖 時間驅(qū)動模式的菜單 時間驅(qū)動模式可供在固定波長上記錄一定時間內(nèi)的樣品熒光強度變化。圖的菜單中“Durations(s)”為所要測定的總時間（秒），“Data Interval(s)”為每兩個測量點間的時間（秒）。、強度濃度模式（） 圖 強度濃度模式（）菜單自動測濃度的步驟： 將所含已知濃度的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液放入樣品室； 確認(rèn)所需的波長及狹縫均已設(shè)好； 選定行，并在下面的小框中鍵入該標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值； 鍵入所需的信號積分時間； 單擊，標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強度值會顯示在其右邊的小框中，此值自動被剛輸入的濃度值所除，得到其商并暫存，只要一直選定行，以后的樣品測定所得的熒光強度會自動乘上值而成為濃度值顯示。、 波長編程掃描模式（ ）圖 波長編程掃描模式（ ）菜單 波長編程掃描可在一系列不同的激發(fā)和發(fā)射波長下來測定樣品的熒光強度。、 用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定濃度的模式 圖 儀器應(yīng)用選項菜單在圖中選擇“（濃度）”項，即可出現(xiàn)下圖： 圖 濃度測定模式儀器條件設(shè)置菜單 設(shè)定激發(fā)波長、最大發(fā)射波長及激發(fā)與發(fā)射狹縫等條