肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究         09-01-30 15:27:00     編輯：studa20                       作者：都紅蕾，孫奮勇，陳勍，潘秋輝【摘要】  目的 觀察肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（H

2、GF）對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC2B增殖的影響及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC2B中HGF受體Cmet的表達(dá)，了解HGF對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC2B，用RTPCR的方法檢測(cè)HEC2B中HGF受體Cmet有表達(dá)。對(duì)HEC2B進(jìn)行24 h血清饑餓后用不同劑量的HGF作用于HEC2B。用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)分析細(xì)胞的增殖力,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的增殖周期。結(jié)果 Cmet在HEC2B細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，HGF促進(jìn)細(xì)胞的增殖,并在一定的范圍內(nèi)有劑量依賴關(guān)系，各處理組與對(duì)照組相比，P<0.05。當(dāng)HGF濃度達(dá)到60 ng· mL-1時(shí)，增殖水

3、平較對(duì)照上調(diào)約1.9倍。結(jié)論 HGF/Cmet能夠在體外促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。 【關(guān)鍵詞】  子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體Abstract:Objective To study the effects of hepatocyte growth factor on endometrial cancer cells, detect the alterations of cell proliferation and expression level of HGF receptor Cmet and understand the molecular mechanis

4、m. Methods  Endometrial cancer cell line, HEC2B was cultured in vitro. The expression level of Cmet in HEC2B was determined with RTPCR. HEC2B was treated with HGF at different doses. Cell proliferation was analyzed with MTT assay. Cell cycle distribution was examined with FACS. Statistical eval

5、uations were conducted using ttest. Results  Cmet was expressed in HEC2B cells. Compared with controls, HGF could promoted the proliferation of HEC2B in a dosedependent manner (P<0.05). Treatment with 60 ng· mL-1 HGF increased the proliferation level by 1.9 fold. Conclusion  Cmet w

6、as expressed stably in HEC2B cells. HGF/Cmet system promoted the formation, development and proliferation of endometrial cancer cells in vitro.Key words:endometrial cancer cell; hepatocyte growth factor; hepatocyte growth factor receptor子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見三大惡性腫瘤之一，近20年來在世界范圍內(nèi)子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率有上升趨勢(shì)。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是一個(gè)多

7、功能生長(zhǎng)因子。HGF的單一受體Cmet是一跨膜蛋白，由原癌基因Cmet編碼。在許多惡性腫瘤中Cmet被過表達(dá)1-6。HGF/Cmet與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系卻鮮有報(bào)道。本研究通過觀察子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中Cmet的表達(dá)及HGF對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用，旨在為臨床以HGFCmet為靶點(diǎn)治療子宮內(nèi)膜癌提供理論基礎(chǔ)。1  材料與方法1.1  試劑與細(xì)胞株    子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC2,購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù);RNase、胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶Superscript 為Invitrogen公司產(chǎn)品;優(yōu)質(zhì)胎牛血清,Gibco公司;HGF購(gòu)自R&

8、amp;D， Agarose 、G418 由Sigma公司提供。PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自ABI公司。EPICS AL TRA流式細(xì)胞儀,美國(guó)Beckman Coulter公司提供。1.2  HEC2B細(xì)胞的體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)    將細(xì)胞以1×105/cm2接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5 mL含10%()FBS（胎牛血清）的DMEM；培養(yǎng)24 h后，換5%FBS的DMEM饑餓培養(yǎng)12 h，分別加入濃度為20、40、60、80、100ng·mL-1的HGF進(jìn)行處理，設(shè)置空白組不進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)基中FBS

9、的濃度改成5%；培養(yǎng)48  h后收集細(xì)胞。1.3  PCR 用PBS清洗細(xì)胞，用Trizol法抽提RNA，并常規(guī)檢測(cè)RNA的純度及完整性。反轉(zhuǎn)錄，用人的actin基因檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄是否成功。PCR條件為：94 5 min 激活聚合酶，94 變性30 s，58 退火30 s，72 45 s，共33循環(huán)，72 保溫10 min，4 保溫10 min。采用瓊脂糖凝膠檢測(cè)的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。Realtime定量PCR條件為：95 5  min 激活聚合酶，95 變性15 s，57 退火5  s，72 25 s，共45循環(huán)。采用ABI7300系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)

10、循環(huán)結(jié)束檢測(cè)熒光強(qiáng)度。融解曲線分析:每分鐘讀1次，檢測(cè)范圍為55 到 95 。熒光強(qiáng)度檢測(cè)采用動(dòng)態(tài)跟蹤的方法，自動(dòng)測(cè)出Ct值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），用2Ct 表示實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)，并采用瓊脂糖凝膠檢測(cè)的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。actin引物序列如下：上游引物  5gctct tttcc agcct tcctt3,下游引物 5 tgatc cacat ctgct ggaag3。Cmet檢測(cè)引物序列：上游引物5ttcaagtagc caaagcgatg3,下游引物 5gtgtttacgtcaggataag3 。Cmet檢測(cè)引物序列：上

11、游引物5ttcaagtagc caaagcgatg3,下游引物 5gtgtttacgtcaggataag3,產(chǎn)物大小300 bp。1.4  用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用含0.25%()胰酶消化，懸浮于適量培養(yǎng)基中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)將其濃度調(diào)整到4×104個(gè)細(xì)胞/mL。將此細(xì)胞懸液以100 L/孔均勻接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上，置于37 ，5CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后，換成稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞饑餓。分組加藥，分別將含20、40、60、80、100 ng· mL-1HGF的培養(yǎng)液100 L加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每個(gè)稀釋度做

12、4個(gè)復(fù)孔，設(shè)立空白對(duì)照組。加樣后置于37 ，5CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)44 h，每孔加入20 L MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)液，加入抽提液150 L/孔，置于微量振蕩器張充分振勻以抽取染料，振動(dòng)15 min。以570 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630 nm為參考波長(zhǎng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值（A）1.5  流式細(xì)胞檢測(cè)    消化并收集細(xì)胞，每檢測(cè)管中(0.51)×106細(xì)胞，PBS清洗一遍，離心去上清，轉(zhuǎn)速1 000  r/ min，5 min，沿管壁緩慢加入終濃度70()的乙醇，混勻，20 固定過夜，1 000 r/min 離心5 min去上清，PBS清洗一遍，加入Rnase抑制劑50 L，加入50 g/mL的PI染料混勻，4 避光30 min，上機(jī)檢測(cè)。1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法    采用t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有顯著性。2  結(jié)  果21  HEC2B的培養(yǎng)與傳代