卵巢癌患者exosomes來源初探

1、卵巢癌患者exosomes來源初探作者：時間：2007-11-22 11:38:00 作者：李奇靈 孫陽珍 于月成 方靜 張媛麗 辛?xí)匝唷娟P(guān)鍵詞】 exosomes；腹水；卵巢腫瘤；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)Comparison of extraction methods of exosomes from patients with ovarian cancer【Abstract】 AIM: To compare the extraction methods of exosomes from tissue or ascites of an advanced ovarian cancer patient, t

2、o detect the expression of exosomes of two source, and to explore the best pathway of acquiring exosomes. METHODS: The tissue of ovarian cancer was taken and the cancer cells were separated and cultured. The cell culture supernatant was collected. The ascites was collected from the same patient. The

3、 exosomes were extracted by ultracentrifugation and ultrafiltration from the cell culture supernatant and the ascites and were examined under electron microscope. HSP70, HSP90, MHC class molecule and MHC class molecule on exosomes were tested by Western blotting. The protein concentration of exosome

4、s was tested by BCA method. RESULTS: The time for the centrifugation of ascites was longer than that of supernatant. The exosomes could be obtained from all of the supernatants and the ascites with cancer cells, not from the ascites without cancer cells. The exosomes expressed MHC class molecule, HS

5、P70 and HSP90 except MHC class molecule. The protein concentration of exosomes in the ascites was higher than that of the supernantant of cell culture (P0.05). CONCLUSION: Ascites is a better source of exosomes for the ovarian cancer patient with malignant effusion with positive cancer cells. The ex

6、osomes can be extracted from ovarian cancer tissue for the patients without ascites or with ascites in which cancer cells are negative. 【Keywords】exosomes; ascites; ovarian neoplasms; cell culture techniques【摘要】目的： 同一晚期卵巢癌患者，對組織來源和腹水來源的exosomes進(jìn)行方法和數(shù)量的比較，探討獲得卵巢癌患者exosomes的最佳途徑. 方法： 收集晚期卵巢癌患者卵巢癌組織，分離

7、癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，留上清液，取同一患者的腹水，通過超速離心和超濾等方法提取上清液及腹水中的exosomes,電鏡下檢測；Western Blot測定exosomes 上HSP70, HSP90, MHC類分子和MHC類分子的表達(dá)；用BCA蛋白測定法測定exosomes的蛋白濃度,計(jì)算蛋白總含量. 結(jié)果： 腹水離心時間比上清液離心時間長，所有細(xì)胞培養(yǎng)上清液和癌細(xì)胞陽性的腹水均能分離出exosomes，癌細(xì)胞陰性的腹水中未分離出exosomes；兩種來源的exosomes共同表達(dá)MHC類分子、HSP70和HSP90，均不表達(dá)MHC類分子，腹水中分離出來的exosomes蛋白含量比細(xì)胞培養(yǎng)上清液的含量

8、高（P0.05）. 結(jié)論： 腹水中癌細(xì)胞陽性的患者，腹水是exosomes的比較理想的來源；無腹水或腹水中癌細(xì)胞陰性的患者，exosomes可來源于卵巢癌組織. 【關(guān)鍵詞】 exosomes；腹水；卵巢腫瘤；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)0引言exosomes是許多種細(xì)胞都能分泌的直徑3090 nm的小囊泡，由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成的亞細(xì)胞器. 近年來，癌癥患者的腫瘤細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cell, DC）分泌的exosomes，由于它攜帶所分泌細(xì)胞的一些抗原信息，被作為腫瘤特異性抗原的來源，用于惡性腫瘤免疫治療1-2的研究. 由DC分泌的exosomes已經(jīng)在黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌進(jìn)入了臨床期試驗(yàn)3

9、, 但exosomes在卵巢癌中的研究進(jìn)展較慢. 本研究我們對晚期卵巢癌患者組織來源和腹水來源的exosomes分離方法、獲得量比較，探討卵巢癌患者最佳exosomes來源途徑.1對象和方法1.1對象選擇200501/200512在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院的原發(fā)性卵巢癌患者15例，年齡（536）歲. 臨床分期期，均伴有腹水，腹水中查出癌細(xì)胞者10例(10/15)，腹水中癌細(xì)胞陰性者5例(5/15). 取標(biāo)本前未經(jīng)化療，均為第一次剖腹探查，術(shù)中無菌操作留取卵巢癌組織，術(shù)前或術(shù)中留取腹水. 術(shù)后病理診斷，漿液性囊腺癌9例，黏液性囊腺癌6例. 99.93%重水購自Sigma公司；RPMI1

10、640培養(yǎng)液購自Gibco公司； Centriplus離心超濾管（100KDa）、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超濾離心管（100KDa）購自美國Millipore公司；兔抗人熱休克蛋白（HSP70）多克隆抗體、兔抗人HSP90多克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司；鼠抗人MHC類分子(HLAABC)mAb、鼠抗人MHC類分子（HLADR）mAb購自華美公司；Western Blot試劑盒（包括酶標(biāo)記二抗、A液和B液）購自Pierce公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所.1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)采用機(jī)械分散法獲得腫瘤細(xì)胞懸液：將腫瘤組織剪成510 mm3的小

11、塊組織，棄去結(jié)締組織、壞死組織、血管等. 輕輕擠壓腫瘤組織過100目的篩網(wǎng)，懸液再過200目篩網(wǎng)，將所得的細(xì)胞懸液置于含2 mmol/L L谷氨酰胺和青霉素1105 U/L、鏈霉素100 mg/L的無血清RPMI1640全培養(yǎng)液中，于37含50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔日傳代,待細(xì)胞生長至對數(shù)期時，收集上清液. 用25 g/L胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗滌重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為11010/L. 實(shí)驗(yàn)均用對數(shù)生長期的細(xì)胞. 1.2.2exosomes的獲得分別取腹水和細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以300 g離心5 min，取上清液；以800 g離心30 min，去沉淀；再以10 000 g離心

12、40 min，取上清液；加入Centriplus超濾離心管中，以1500 g離心1 h，取濃縮液. 將30 g/L的蔗糖/重水墊、濃縮液和10 mmol/L PBS依次放入離心管中，低溫下以100 000 g超速離心1 h. 取出混有exosomes的蔗糖/重水墊,10 mmol/L PBS懸浮，加入Amicon Ultra高回收率高流速切向流超濾離心管中,以1500 g離心30 min，重復(fù)3次. 取濃縮液用10 mmol/L PBS懸浮成5 mL，為待測液. 記錄離心和超濾次數(shù)，置于4冰箱中保存?zhèn)溆? 1.2.3exosomes的鑒定1.2.3.1電鏡將待測液各取20 L滴于載樣銅網(wǎng)上，于

13、室溫靜置1 min；用濾紙從側(cè)面吸干液體，滴加20 g/L磷鎢酸（pH 6.8）約30 L于銅網(wǎng)上，室溫負(fù)染1 min；用濾紙吸干負(fù)染液，在白熾燈下烤干后，于透射電鏡下觀察，并照相. 1.2.3.2Western Blot方法 灌制SDSPAGE電泳膠（6%濃縮膠，12%分離膠）； 用細(xì)胞培養(yǎng)上清液中exosomes陽性的待測液、腹水中exosomes陽性的待測液、癌細(xì)胞裂解液和腹水中exosomes陰性的待測液各15 L，上樣于四塊PAGE凝膠的對稱位置，恒壓100 V電泳，至溴芬藍(lán)帶泳至膠底以上約1 cm處，終止電泳； 用電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上； 電泳轉(zhuǎn)移完畢后，取出膜，用TBS洗滌1次； 將膜放入封閉液，室溫下封閉1 h，或4封閉過夜； 用封閉液稀釋各抗體上清（HSP70 150；HSP90 150；MHC 1100； MHC 1100），與含有目的蛋白條帶的膜在室溫下作用1 h； TBST洗膜4次，每次15 min； 按試劑