己烯雌酚人工抗原的合成及其抗體制備

1、己烯雌酚人工抗原的合成及其抗體制備陳德坤1,鄭增忍2,曲志娜2,雷莉輝1,張佩君3(11西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西楊凌712100;21農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所,山東青島266032;31陜西省教育學(xué)院生物系,陜西西安710003摘要:以己烯雌酚(D ES 、琥珀酸酐和牛血清白蛋白(BSA 等為主要原料,采用混合酸酐反應(yīng),首先合成己烯雌酚半琥珀酸酯(D ES 2H S ,經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定后,再將D ES 2H S 結(jié)合到BSA 上,并用SD S 2PA GE 對(duì)D ES 2H S 2BSA 進(jìn)行測(cè)定。以D ES 2H S 2BSA 免疫家兔6次,用瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定抗體。試驗(yàn)結(jié)果表明,高分辨質(zhì)譜

2、測(cè)得合成的D ES 2H S 分子量為368;BSA 2H S 2D ES 的SD S 2PA GE 圖譜經(jīng)相關(guān)軟件分析表明,單個(gè)BSA 上結(jié)合有32個(gè)D ES 2H S ;瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),免疫兔血清中含有抗D ES 的抗體。本試驗(yàn)為下一步研制D ES 殘留免疫檢測(cè)試劑盒及抗D ES 單抗奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:己烯雌酚;琥珀酸酐;牛血清白蛋白;混合酸酐反應(yīng);抗D ES 抗體中圖分類號(hào):S 852143文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):100524545(20040420364203己烯雌酚(D ES 是一種人工合成的雌激素,在醫(yī)學(xué)臨床上普遍用于婦科病的治療,而且還被用作動(dòng)物飼料添加劑,以促進(jìn)動(dòng)物生

3、長,提高產(chǎn)量1,2。國內(nèi)外大量研究表明3,己烯雌酚可以破壞機(jī)體遺傳物質(zhì),導(dǎo)致基因突變而引發(fā)機(jī)體腫瘤。因此,國內(nèi)外所頒布的食品安全法均規(guī)定,動(dòng)物性產(chǎn)品及食品中不得檢出己烯雌酚。目前,國外已經(jīng)建立了成熟的己烯雌酚殘留免疫檢測(cè)方法,并有相關(guān)的診斷試劑盒。目前,國內(nèi)檢測(cè)己烯雌酚主要采用高效液相色譜(H PL C 法或氣相色譜2質(zhì)譜(GC 2M S 法。為開發(fā)研制具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的藥物殘留(包括己烯雌酚免疫檢測(cè)試劑盒,達(dá)到能夠?qū)ε繕悠愤M(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的目的,特進(jìn)行了本研究。1材料與方法111主要試劑和儀器己烯雌酚,純度99%,美國Sigm a 公司產(chǎn)品;琥珀酸酐,上海化學(xué)試劑公司;氯甲酸異丁酯,

4、CP ,上海飛詳化工廠;三正丁胺,CP ,北京化工廠進(jìn)口分裝;牛血清白蛋白(BSA ,華美生物工程公司;其他試劑均為A R 級(jí)。Z AB 2H S 儀器、FT 2M S A PXX 儀器、凝膠成像系統(tǒng)(UV P B i o i m aging System 及其分析軟件(lab w o rk s 410I m age A c 2qu isiti on and A nalysis Softw are 。112試驗(yàn)動(dòng)物成年健康家兔,體質(zhì)量215kg 左右,購自青島醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心。113己烯雌酚半琥珀酸酯(D ES -HS 的合成D ES 2H S 的合成路線如下:HOCC 2H 6C C 2H

5、 6OH +O C OCH 2COC H 2HOCC 2H 6C C 2H 6OC OCH 2CH 2C OOH 收稿日期:2003212222作者簡介:陳德坤(19642,男,副教授,博士。將70m g D ES 溶于5mL 吡啶中,攪拌至完全溶解,再加入琥珀酸酐25m g ,置于通風(fēng)櫥中,在室溫下攪拌48h 。反應(yīng)完成后,將反應(yīng)液移入30mL 冰蒸餾水與5mL 濃鹽酸組成的混合液中靜置過夜,抽濾析出的沉淀,并以蒸餾水洗至pH 515左右,真空干燥,得粗產(chǎn)品。將所得粗產(chǎn)品加入丙酮溶解后,拌入等量的硅膠,室溫下晾干,用200300目硅膠柱層析分離,用TL C 監(jiān)測(cè),收集R f =0109(展開

6、劑,石油醚丙酮=31的點(diǎn)合并,常溫下干燥,即得D ES 2H S 純品。對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行高分辨質(zhì)譜測(cè)定。114D ES -HS -BSA 的合成將D ES 2H S 2BSA 50m g 溶于二氧六環(huán)中,置4下10m in ,然后加入20L 三正丁胺,混勻,再加入15L 氯甲酸異丁酯,4條件下攪拌30m in ,此為甲液。另取150m g BSA 溶于20mL 的70%二氧六環(huán)水溶液中,此為乙液。將甲液與乙液合并,4下攪拌過夜,將反應(yīng)液流水透析2h ,然后換成平衡鹽溶液繼續(xù)透析48h 。濃縮透析液,冷凍干燥。用5%的積層膠和10%的分離膠對(duì)D ES 2H S 2BSA 進(jìn)行SD S 2PA GE

7、鑒定,通過紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件分析得出D ES 2H S 2BSA 的分子量,以此為依據(jù)推算單個(gè)BSA 上結(jié)合D ES 2H S 的數(shù)目。115D ES -HS -OVA (卵清蛋白的合成參照方法114進(jìn)行。116動(dòng)物免疫試驗(yàn)用無菌生理鹽水溶解D ES 2H S 2BSA 后,與等量的弗氏完全佐劑混合,在混合振蕩器上充分振蕩,使其完全乳化,D ES 2H S 2BSA 的最終含量為1g L 。在家兔脊椎兩側(cè)交叉選取68個(gè)點(diǎn),做皮下注射免疫,免疫劑量為2mL只。2025d ,進(jìn)行第2次免疫,免疫途徑及免疫劑量同第1次,佐劑為弗氏不完全佐劑。以后,每隔15d 加強(qiáng)免疫1次,免疫劑量均為上次的2

8、倍,免疫途徑為皮下注射,免疫時(shí)不使用弗氏佐劑。免疫共進(jìn)行6次,最后1次免疫后10d ,經(jīng)心臟無菌采血,分離免疫血清。117抗D ES 抗體的測(cè)定按照常規(guī)的瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行。在1%瓊脂糖凝膠上打出梅花孔,挑去孔中瓊脂塊,用015%融化瓊脂封底。向中央孔加入分離的免疫兔血清,周圍孔分別加D ES 2H S 2BSA 、OVA 、D ES 2H S 2OVA ,在37感作2448h 后,將瓊脂糖凝膠用生理鹽水漂洗24h ,用011%考馬斯亮藍(lán)染液染色,經(jīng)脫色后,對(duì)瓊擴(kuò)試驗(yàn)結(jié)果照相。2結(jié)果 2.1D ES -HS 的高分辨質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果FAB M S 測(cè)定結(jié)果為,M +368(63(M +N a +3

9、91(17,351(M 2OH (16,307(M 2OH 2CO 2(6(圖1。HRM S 分析,C 22H 24O 5+N H 4計(jì)算值為38611962,實(shí)測(cè)值為38611959,誤差017ppm ,在10ppm 范圍內(nèi)。結(jié)果表明,新合成的D ES 2H S 的分子量為386。 圖1D ES 2H S 的質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果 2.2D ES -HS -BSA 的S D S -PAGE 結(jié)果為進(jìn)一步證實(shí)BSA分子上確實(shí)掛載了D ES 半抗原,并計(jì)算出每個(gè)BSA 分子上所結(jié)合的半抗原數(shù)目,對(duì)D ES 2H S 2BSA 進(jìn)行了SD S 2PA GE (圖2。電泳圖譜顯示出BSA 的泳動(dòng)速度大于D E

10、S 2H S 2BSA ,說明D ES 2H S 2BSA 的分子量大于BSA ,證明D ES 2H S 已經(jīng)結(jié)合在BSA 上。通過紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件分析得出,D ES 2H S 2BSA 的相對(duì)分子質(zhì)量為77950,BSA 的相對(duì)分子質(zhì)量為66200,每個(gè)BSA 分子上結(jié)合的半抗原數(shù)目為(77950-66200÷36832。 圖2D ES 2H S 2BSA 的SD S 2PA GE 結(jié)果11M arker ;21BSA 標(biāo)準(zhǔn)品;31D ES 2H S 2BSA2.3抗D ES -HS 抗體的測(cè)定結(jié)果以D ES 2H S 2BSA 免疫家兔,家兔不僅產(chǎn)生針對(duì)D ES 2H S

11、 的抗體,還產(chǎn)生針對(duì)BSA 表面功能抗原決定簇的抗體,這是瓊擴(kuò)試驗(yàn)中免疫血清孔和D ES 2H S 2BSA 孔之間形成的沉淀線比較粗的原因(圖3。由于BSA 和OVA 無共同的抗原性4,因此OVA 孔和中央孔之間無沉淀線形成。D ES 2H S 2OVA 孔和中央孔之間形成1條細(xì)而清晰的沉淀線,并且該沉淀線與免疫血清孔和D ES 2H S 2BSA 孔之間形成的沉淀線完全融合,說明免疫血清中確實(shí)含有抗D ES 2H S 的抗體。圖3抗D ES 抗體的瓊擴(kuò)試驗(yàn)結(jié)果中央孔1免疫血清;1,3孔.D ES 2H S 2BSA ;4,5孔.D ES 2H S 2OVA ;2,6孔.OVA3討論小分子藥

12、物殘留是影響動(dòng)物性食品安全的關(guān)鍵因素之一。對(duì)這類小分子殘留的常規(guī)檢測(cè)方法主要有液相色譜法、氣相色譜法等。這類方法靈敏度高、準(zhǔn)確,但比較耗時(shí),且需要的儀器昂貴,難以進(jìn)行大批量樣品的檢測(cè)。為滿足實(shí)踐中批量樣品殘留檢測(cè)的需要,近年來相繼研制出了多種用于小分子藥物殘留檢測(cè)的免疫試劑盒,如鹽酸克倫特羅、氯霉素等免疫檢測(cè)試劑盒。國內(nèi)尚未見己烯雌酚殘留免疫檢測(cè)試劑盒研制的報(bào)道。本研究制備出的抗己烯雌酚抗體,為下一步研制己烯雌酚殘留免疫檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。半抗原本身無免疫原性,只有當(dāng)其與載體結(jié)合后,才能夠獲得免疫原性。對(duì)于沒有氨基或羧基基團(tuán)的半抗原,必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾,在其上加載1個(gè)含有氨基或羧基的基團(tuán)

13、,才可以將其連接到載體上。己烯雌酚便屬于此類半抗原。對(duì)己烯雌酚進(jìn)行化學(xué)修飾應(yīng)當(dāng)盡可能不影響己烯雌酚的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型,否則免疫動(dòng)物制備出的抗體可能與己烯雌酚本身的親和力較差,或與其他物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)的幾率較高?？紤]到己烯雌酚本身屬于小分子,所以在加載功能性羧基基團(tuán)時(shí),我們使用的是丁二酸酐,只與己烯雌酚一側(cè)的酚羥基反應(yīng),形成己烯雌酚半琥珀酸。這樣,不僅最大限度地減少了對(duì)己烯雌酚本身結(jié)構(gòu)和構(gòu)型的影響,而且形成的己烯雌酚半琥珀酸有一個(gè)較長的“臂”,與載體結(jié)合后有利于淋巴細(xì)胞的免疫識(shí)別。據(jù)報(bào)道5,當(dāng)1個(gè)載體結(jié)合2535個(gè)半抗原分子時(shí),免疫動(dòng)物相對(duì)容易產(chǎn)生抗體。本試驗(yàn)以含有32個(gè)D ES 的BSA 2H S

14、2D ES 免疫家兔,用瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行的特異性抗體檢測(cè)也證實(shí)了這一點(diǎn)。Rom bau ts 等6報(bào)道,D ES 也能夠與2乙基溴化丁酸鹽反應(yīng),產(chǎn)物為D ES 22乙基溴化丁酸。他們通過2乙基溴化丁酸鹽與己烯雌酚一側(cè)的酚羥基發(fā)生化學(xué)反應(yīng),在己烯雌酚上加上一個(gè)“臂”長為4個(gè)碳原子的帶有羧基的基團(tuán),從而使經(jīng)過化學(xué)修飾的己烯雌酚能夠與載體結(jié)合。但是他們制備的經(jīng)過化學(xué)修飾的己烯雌酚極不穩(wěn)定,且難以提純。本試驗(yàn)制備的D ES 2H S 穩(wěn)定性較強(qiáng),也能夠提純,這不僅有利于對(duì)D ES 2H S 進(jìn)行分析鑒定,同時(shí)對(duì)于下一步將D ES 2H S 順利地結(jié)合到BSA 上十分重要。本研究制備抗己烯雌酚抗體,不

15、僅為建立己烯雌酚殘留的免疫學(xué)檢測(cè)方法打下了良好基礎(chǔ),也為進(jìn)一步研制抗己烯雌酚單抗提供了很好的手段。(本研究在進(jìn)行己烯雌酚化學(xué)修飾的工作中,得到蘭州大學(xué)化學(xué)系田暄教授的大力協(xié)助,并承蒙田暄教授對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析判定,在此表示衷心感謝參考文獻(xiàn):1馮紅旗,李洪玲,楊如鏡,等.12例T urner 綜合征內(nèi)分泌激素的觀察J .中國優(yōu)生與遺傳雜志,1999,7(2:54255.2楊勝林,蔣誠績.己烯雌酚對(duì)山羊育肥增重效果的研究J .當(dāng)代畜牧,2001,(2:31232.3N ielsem M ,B j rnsd óttir S ,H yer P E ,et al .O ntogeny of o

16、estro 2gen recep to r a in gonads and sex ducts of fetal and new bo rn m ice J .J R ep rod Fertil ,2000,118:1952204.4Dong M in ,L I Guofu ,L i J in ,et al .I mm uno logical detecti on of ar 2butin J .T singhua Sci T echno l ,1999,4(3:3112316.5姜玲,章文才,柯云,等.抗槲皮素抗體的研制J .免疫學(xué)雜志,2000,16(5:3832386.6Rom baut

17、s P ,P ierdet A ,Jouquey A .Study on the antiserum ofD iethylstilbestro l J .R A cad Sci Ser D ,1973,277:192121924.Syn thesis of D iethylstilbestrol and the Prepara tion of Its An tibodyCH EN D e 2kun 1,ZH EN G Zeng 2ren 2,QU Zh i 2na 2,L E IL i 2hu i 1,ZHAN G Pei 2jun 3(1.Colleg e ofA n i m a l H u

18、sband ry and V eterina ry S cience ,N orthw estern S ci 2T ech U n iversity of A g ricu ltu re and F orest ,Y ang ling ,S haanx i 712100,Ch ina ;2.Q ua ran tine Institu te of A g ricu ltu ra l M in istry ,Q ing d ao 266032,Ch ina ;3.B iology D ep a rt m en t of S haanx i E d uca tiona l Institu te ,

19、X i an 710003,Ch ina Abstract :D iethylstilbestro l hem isuccinate (D ES 2H S w ere syn thesized and coup led to bovine serum album in (BSA w ithm ixed 2anhydride m ethod ,and the pu rified D ES 2H S w ere iden tified by h igh m ass spectra (HRM S ,and the BSA 2H S 2D ES w ereiden tified by SD S 2PA

20、 GE .BSA 2H S 2D ES w ere in jected to b ig ear rabb its 6ti m es in certain in terval.A n tibody to diethylstilbestro l w ere determ ined by agar diffu si on test .T he resu lts show ed that the mo lecu lar w eigh t of syn thesized D ES 2H S in 36811959,and the num ber of D ES 2H S coup led to each

21、 BSA mo lecu le is 32.T he an tibody to diethylstilbestro l does ex ist in the i m m un ized rab 2b it serum .It w as demon strated that artificial i m m unogen of diethylstilbestro l cou ld be syn thesized by m ixed 2anhydride m ethod and the specificity of the po lyclonal an ti 2diethylstilbestro

22、l an tibodies cou ld be p roduced .Key words :diethylstilbestro l ;succin ic anhydride ;bovine serum album in (BSA ;m ixed 2anhydride m ethod ;an ti 2diethyl 2stilbestro l an tibodies半胱胺對(duì)成年鵝血漿中幾種激素及膽固醇水平的影響艾曉杰1,鄭元林2,劉根桃2,陳偉華2,韓正康2(11上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系,上海201101;21南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京210095摘要:以14只裝有超靜脈瘺管的成年雜交鵝(川白×太湖,圈養(yǎng),自身對(duì)照。試驗(yàn)期于日糧中一次性添喂半胱胺(按每千克體質(zhì)量100m g ,經(jīng)瘺管采取對(duì)照期和處理后第1、3、5、7天的血樣,用R I A 雙抗法和分光光度法分別測(cè)定激素和膽固醇的含量。試驗(yàn)期各天,生長抑素的含量較對(duì)照期的(1189±0110g L 分別顯著降低(P <0101或P <010541118%、2617