大豆磷脂對(duì)體外培養(yǎng)乳鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究

1、大豆磷脂對(duì)體外培養(yǎng)乳鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究                作者：王翠瑤 張曉宏  馬洪林【摘要】  目的： 觀察大豆磷脂脂質(zhì)體（SPL）對(duì)谷氨酸所致培養(yǎng)乳鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法： 取新生大鼠（01d）大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，810d后加入谷氨酸（Glu），造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷，SPL保護(hù)組在Glu損傷處理的同時(shí)加入不同濃度的大豆磷脂脂質(zhì)體，測(cè)定乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SO

2、D）的含量，觀察谷氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的興奮毒性及大豆磷脂脂質(zhì)體的保護(hù)作用。結(jié)果：加入谷氨酸后，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷性變化，培養(yǎng)上清液中LDH含量增加，細(xì)胞勻漿中MDA生成增加， SOD含量明顯減少。大豆磷脂脂質(zhì)體在0.2mg/ml1.6mg/ml濃度時(shí)能顯著減輕上述損傷性變化。結(jié)論：大豆磷脂脂質(zhì)體對(duì)谷氨酸所致培養(yǎng)乳鼠神經(jīng)細(xì)胞興奮毒性損傷具有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與大豆磷脂脂質(zhì)體抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  大豆磷脂； 脂質(zhì)體； 谷氨酸； 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)目前谷氨酸的興奮毒性作用于缺血性腦損害的研究最多，腦缺血時(shí)突觸前谷氨酸釋放增加，再攝取減少，導(dǎo)致NMDA受體過度興奮，Ca2+大

3、量?jī)?nèi)流，產(chǎn)生離子依賴性興奮毒性。大豆磷脂脂質(zhì)體是一種人工制備的生物膜，它可嵌入細(xì)胞膜，利用膜的液化使膜的流動(dòng)性增強(qiáng)，從而保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。國(guó)內(nèi)有學(xué)者報(bào)道大豆磷脂能明顯減輕腦缺血性損傷1，但大豆磷脂脂質(zhì)體對(duì)谷氨酸造成體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞興奮毒損傷是否具有保護(hù)作用尚未見報(bào)道。我們利用谷氨酸產(chǎn)生興奮毒性，對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞造成損傷，模擬體內(nèi)腦缺血產(chǎn)生Glu對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成的損傷，觀察大豆磷脂脂質(zhì)體濃度的累積對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的關(guān)系，并探討其可能的作用機(jī)制。1  材料11  動(dòng)物01d的SD大鼠，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。12  藥物與試劑L多聚賴氨酸和L谷氨酸購(gòu)

4、于美國(guó)Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)于GIBCO公司；胎牛血清、馬血清購(gòu)于天津?yàn)笊镏破酚邢薰?；鹽酸阿糖胞苷(批號(hào)991201)購(gòu)于上海華聯(lián)制藥有限公司；大豆磷脂購(gòu)于北京清華紫光公司；乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒、丙二醛測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其它所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。13  儀器HERA cell二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)GmbH公司）；OLYMPUS倒置顯微鏡（JAPAN  OLYMPUS  TOKYO）；DZF6050真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；751紫外分光光度計(jì)（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠

5、)。2  方法21  大豆磷脂脂質(zhì)體的制備與鑒定大豆磷脂脂質(zhì)體的制備按本研究室建立的方法2,所制備的脂質(zhì)體負(fù)染后透射電鏡下觀察為大小較均勻的單層脂質(zhì)體，經(jīng)IBAS圖象處理系統(tǒng)測(cè)得其平均直徑為85nm，屬小脂質(zhì)體。22  新生乳鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)參照Choi等3的方法,略加調(diào)整。無菌條件下，新生01的大鼠開顱取出大腦皮層放入預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基中，剔除軟腦膜和血管, 剪碎置于0.125%胰蛋白酶中，37水浴消化30min后，加入等量完全培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心10min，棄上清，加入培養(yǎng)液反復(fù)吹打，200目尼龍網(wǎng)過濾后計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度1×

6、;106/ml，接種于涂有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，37、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。接種48h后全量換液，并加入5mol/L的阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)元的增殖，以后每周半量換液3次。23  實(shí)驗(yàn)分組神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)810d后分正常對(duì)照組、損傷組和SPL保護(hù)組。損傷組吸去原培養(yǎng)液，無Mg2+ Earles液(mmol/L：NaCl 142.6，KCl 5.4，CaCl2 1.8，NaH2PO4 1.0，葡萄糖 5.6，HEPES 2.38，pH 7.4)洗2遍，每孔加入含Glu終濃度1×10-4mol/的無Mg2+Earles液1ml，3h后用DMEM培養(yǎng)基洗去Glu，再換

7、用無血清的DMEM培養(yǎng)基，置37、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24；正常對(duì)照組不加Glu，SPL保護(hù)組在Glu損傷處理的同時(shí)加入不同濃度（0.2，0.4，0.8，1.6mg/ml）的大豆磷脂脂質(zhì)體，其余處理同上。24  LDH的測(cè)定各組細(xì)胞加處理因素后，收集培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書測(cè)定培養(yǎng)液中LDH活性。         25  神經(jīng)細(xì)胞MDA、SOD的測(cè)定各組細(xì)胞加處理因素后，去除原培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，每孔加入0.1mol/L PBS，0.05mmol/L EDTA（pH 8.0）1mL

8、，再加入1TritonX 100 50L，將24孔培養(yǎng)板置振蕩器振蕩1min使細(xì)胞溶解，加入25H3PO4100l以沉淀蛋白，于4離心1h，取上清液按試劑盒說明書測(cè)定MDA含量、SOD活性。蛋白質(zhì)定量用考馬斯亮蘭試劑盒測(cè)定。26  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理多樣本均數(shù)檢驗(yàn)采用方差分析的方法，方差分析差異有顯著性后再進(jìn)行樣本的兩兩比較（Q檢驗(yàn)）。3  結(jié)果31  培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化正常對(duì)照組新生乳鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)810d后，鏡下觀察，神經(jīng)細(xì)胞清晰可見，多數(shù)呈多極形或錐形，光暈明顯，突起交織成網(wǎng)狀，核不可見。損傷組加入谷氨酸后細(xì)胞胞體光暈消失，突起回縮，胞體折光性下降，核易見

9、，部分胞體溶解。而SPL保護(hù)各組細(xì)胞更接近正常形態(tài)，說明SPL能明顯改善神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸損傷的形態(tài)學(xué)變化。32  培養(yǎng)上清液中LDH的變化與正常對(duì)照組相比，損傷組培養(yǎng)上清液中LDH漏出量明顯增加(P0.01)；而SPL保護(hù)各組與損傷組相比，LDH漏出量均明顯下降，且呈劑量依賴性，但當(dāng)劑量達(dá)到一定濃度（1.6mg/ml）時(shí)，SPL保護(hù)作用不再隨著濃度的升高而增強(qiáng)，反而有所下降，見表1。表1  培養(yǎng)上清液中LDH的變化（略）注：* 與正常對(duì)照組比較，P0.01；* 與Glu損傷組比較，P0.01；# 與前一保護(hù)組比較，P0.05 。33  培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞MDA含量及SOD

10、活性的變化損傷組神經(jīng)細(xì)胞勻漿中MDA含量顯著增加，SOD活性顯著降低。與損傷組相比，SPL保護(hù)各組隨著劑量的增加，均可顯著降低MDA的含量，同時(shí)升高SOD活性，并呈劑量依賴性；但當(dāng)SPL達(dá)到一定濃度（1.6mg/ml）時(shí)，保護(hù)作用不再隨著濃度的升高而增高，見表2。表2  培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞MDA及SOD的變化（略）注：同表1。4  討論Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最高的興奮性氨基酸，在維持神經(jīng)細(xì)胞正常信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要的作用。但Glu大量釋放，激活Glu受體，就會(huì)引起一系列病理反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性壞死。谷氨酸在細(xì)胞外液中的蓄積在缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要作用。研究表明46，腦缺血后

11、谷氨酸過度釋放，激活了NMDA受體，引起Ca2+大量?jī)?nèi)流，細(xì)胞內(nèi)過多的Ca2+激活磷脂酶A2觸發(fā)花生四烯酸代謝瀑布，產(chǎn)生氧自由基，花生四烯酸和氧自由基又促使神經(jīng)細(xì)胞釋放谷氨酸，形成惡性循環(huán)。自由基及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化對(duì)生物膜脂質(zhì)的破壞是神經(jīng)元死亡的重要誘因。磷脂是生物膜的重要組成成分，SPL可提供膜磷脂并和細(xì)胞膜間脂質(zhì)交換，進(jìn)而穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。從表1、2中的結(jié)果可見，培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞受到Glu損傷后，LDH漏出率增加，膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成增多，而SOD活性下降。SPL能明顯改善神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸損傷的形態(tài)學(xué)變化，顯著減少LDH的漏出量，減少M(fèi)DA的生成，提高SOD活性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的神經(jīng)

12、細(xì)胞保護(hù)作用。由此認(rèn)為，SPL對(duì)谷氨酸所致神經(jīng)細(xì)胞興奮毒性損傷的保護(hù)作用機(jī)制能為大豆磷脂作為膜脂質(zhì)的供體，將其制成脂質(zhì)體形式以融合、吸附、脂質(zhì)交換等方式與細(xì)胞相互作用并和細(xì)胞膜間脂質(zhì)交換，從而將脂質(zhì)體某些成分轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中，以修補(bǔ)細(xì)胞膜脂質(zhì)成分，穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。此外，可以減少膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成，提高抗氧化物質(zhì)含量，阻斷“脂質(zhì)三聯(lián)體”效應(yīng)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 石富成,周景春,孟東婭，等.大豆磷脂對(duì)腦梗死治療作用的研究. 中華醫(yī)學(xué)雜志,2001;81(21):130113032 劉超，肖建英，王浩，等. 大豆磷脂對(duì)羥自由基引起培養(yǎng)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2004,

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