免疫組化、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用比較及常見問題分析

1、免疫組化、免疫熒光、免疫組化、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用比較流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用比較及常見問題分析及常見問題分析宋硯明宋硯明song_免疫組化免疫組化（ihc）的應(yīng)用介紹的應(yīng)用介紹免疫熒光免疫熒光（if）的應(yīng)用介紹的應(yīng)用介紹流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（fc）的應(yīng)用介紹的應(yīng)用介紹ihc、if、fc區(qū)別與聯(lián)系區(qū)別與聯(lián)系免疫組織化學(xué)原理及特點(diǎn)免疫組織化學(xué)原理及特點(diǎn)利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理和特殊的標(biāo)記技術(shù)，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體顯色，對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原進(jìn)行定位、定性、定量檢測(cè)的一門技術(shù)。免疫組化具有操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，敏感性高，定位準(zhǔn)確，形態(tài)與功能相結(jié)合等特點(diǎn)。免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)（immuno

2、histochemistry, ihc）細(xì)細(xì) 胞胞抗抗原原一一抗抗二二抗抗辣根過氧化物酶（hrp）3 3，3-3-二氨聯(lián)苯胺（二氨聯(lián)苯胺（dabdab）顯色劑顯色劑棕褐色絡(luò)合物ihc反應(yīng)原理示意圖反應(yīng)原理示意圖組織切片組織切片/芯片制作芯片制作2. 組織芯片應(yīng)用領(lǐng)域組織芯片應(yīng)用領(lǐng)域組織芯片的應(yīng)用領(lǐng)域包括與生命科學(xué)相關(guān)的基礎(chǔ)研究、臨床研究、應(yīng)用研究和新藥開發(fā)等。免疫組化染色（ihc）；原位雜交（ish）；熒光原位雜交（fish）；原位末端標(biāo)記分析（tunel）；原位pcr 以及激光捕獲顯微分離系統(tǒng)輔助的cdna雜交。1. 組織芯片組織芯片組織芯片（或組織微陣列）是將數(shù)十個(gè)甚至上千個(gè)不同個(gè)體的組織

3、標(biāo)本集成在一張固相載體上，組織芯片中含有蛋白，rna及dan分子，是一種高通量的研究分析工具。研究者一次可有效利用成百上千份正常或疾病狀態(tài)下的組織標(biāo)本來研究特定基因及其所表達(dá)的蛋白質(zhì)與疾病之間的關(guān)系。3. abgent 現(xiàn)有組織切片現(xiàn)有組織切片/ /芯片產(chǎn)品芯片產(chǎn)品全套鼠類器官組織切片；全套猴類器官組織切片；人類常見癌癥組織切片；組織芯片客戶定制服務(wù)。組織芯片組織芯片/切片應(yīng)用切片應(yīng)用免疫組化流程示意圖免疫組化流程示意圖2. sp法法原理：原理：根據(jù)生物素(biotin) 與鏈霉親和素(streptavidin)具有強(qiáng)結(jié)合力的原理設(shè)計(jì)。在一抗（兔源與鼠源）與相應(yīng)的靶抗原結(jié)合后，生物素化標(biāo)記的抗

4、多價(jià)二抗與一抗特異結(jié)合；二抗上標(biāo)記的生物素與標(biāo)記了辣根過氧化物酶（hrp）的鏈霉親和素結(jié)合，形成抗原特異性一抗生物素化的二抗hrp 標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物。特點(diǎn)：特點(diǎn)：該法孵育時(shí)間短（通常為10min），靈敏度高以及低背景染色等特點(diǎn)。1. sabc法法原理：原理：sabc法是利用鏈酶親和素(streptavidin)與生物素(biotin)特有的高度親和力這一生物學(xué)性質(zhì)，先將生物素與辣根過氧化物酶(hrp)結(jié)合，形成生物素化hrp，然后與鏈酶親和素按一定比例混合，形成sabc復(fù)合物。用生物素化二抗與第一抗體結(jié)合，再與sabc復(fù)合物聯(lián)結(jié)形成抗原抗體生物素化二抗 sabc復(fù)合物。最后用底物顯色劑顯

5、色。特點(diǎn)：特點(diǎn)：該法具有靈敏度高以及低背景染色等特點(diǎn)。3. polymer酶標(biāo)二抗法酶標(biāo)二抗法原理：原理：該法采用一段多聚氨基酸聚合物做為載體鏈，將該多聚物與二抗結(jié)合，然后可再標(biāo)記上多個(gè)hrp/ap酶分子，所以同樣具有很高的信號(hào)放大作用。特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高；操作步驟簡(jiǎn)單；無需進(jìn)行內(nèi)源性的生物素封閉。ihc二抗原理及選擇二抗原理及選擇4. 直接酶標(biāo)二抗法直接酶標(biāo)二抗法該法是將hrp/ap酶分子直接標(biāo)記于二抗上。因此需要普通的酶標(biāo)二抗即可完成。實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，成本低，但是因?yàn)闆]有信號(hào)放大作用，所以對(duì)很多表達(dá)豐度不是很高的抗原就可能檢測(cè)不到。ihc常用酶標(biāo)二抗原理示意圖常用酶標(biāo)二抗原理示意圖2. aec

6、顯色法顯色法產(chǎn)品描述：產(chǎn)品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，aec) 是過氧化物酶 (peroxidase) 的顯色底物，在過氧化物酶的催化下，aec顯色工作液會(huì)于反應(yīng)部位產(chǎn)生溶于酒精的紅色沉淀，必須在水溶性介質(zhì)中復(fù)染和封片。本試劑盒適用于辣根過氧化物酶（hrp）系統(tǒng)的免疫組化顯色，包括aec顯色原和與之配套的稀釋液。試劑盒組成：試劑盒組成：aec顯色原（試劑a） aec底物緩沖液（試劑b）1. dab顯色法顯色法產(chǎn)品描述：產(chǎn)品描述：二氨基聯(lián)苯胺( 3，3-diaminobenzidine，dab ) 是過氧化物酶 (peroxidase) 的顯色

7、底物，在過氧化物酶的催化下，dab顯色工作液會(huì)于反應(yīng)部位產(chǎn)生不溶于酒精的棕褐色沉淀。本試劑盒適用于辣根過氧化物酶（hrp）系統(tǒng)的免疫組化顯色。試劑盒組成：試劑盒組成：dab顯色原（20）（試劑a） dab底物緩沖液（1）（試劑b）3. bcip/nbt顯色法顯色法產(chǎn)品描述：產(chǎn)品描述：bcip/nbt（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍(lán)四唑）是一種冷藏穩(wěn)定的、單一組分溶液，用于免疫組化、原位雜交、western blot、northern blot和southern blot，特異性地與堿性磷酸酶（ap）反應(yīng)生成紫色物質(zhì)。試劑盒組成：試劑盒組成：有機(jī)溶劑中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮藍(lán)四唑

8、ihc顯色方法原理及選擇顯色方法原理及選擇4. bcip/int顯色法顯色法產(chǎn)品描述：產(chǎn)品描述：bcip/int（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/p-碘硝基四唑）是一種冷藏穩(wěn)定的、單一組分溶液，用于免疫組化、原位雜交、western blot、northern blot和southern blot，特異性地與堿性磷酸酶反應(yīng)生成橙色/棕褐色物質(zhì)。 試劑盒組成：試劑盒組成：有機(jī)溶劑中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和p-碘硝基四唑免疫組織化學(xué)結(jié)果分析免疫組織化學(xué)結(jié)果分析2.非特異性顯色非特異性顯色石蠟切片脫蠟不徹底，建議延長脫蠟時(shí)間。操作過程中沖洗不充分，建議增加沖洗的次數(shù)與沖洗時(shí)間。組織富含內(nèi)源性的

9、生物素與過氧化物酶，建議使用相關(guān)試劑進(jìn)行封閉。發(fā)生抗原異位。蛋白封閉不充分，建議增加蛋白封閉時(shí)間。1.顯色過深顯色過深一抗?jié)舛冗^高或孵育時(shí)間過長，建議降低一抗?jié)舛然驕p少孵育時(shí)間。孵育溫度過高，建議室溫或4孵育。hrp標(biāo)記二抗孵育時(shí)間過長，建議縮短時(shí)間。3.顯色強(qiáng)度弱顯色強(qiáng)度弱一抗?jié)舛冗^低或孵育時(shí)間過短，建議增加一抗?jié)舛然蜓娱L孵育時(shí)間。試劑超過保質(zhì)期，建議實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)試劑的保質(zhì)期。操作過程沖洗過度，建議適度沖洗。免疫組織化學(xué)常見問題分析免疫組織化學(xué)常見問題分析4.無染色無染色組織中無目的抗原的表達(dá)。一抗種屬來源與二抗不匹配，建議實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)一抗的種屬來源。顯色物質(zhì)與hrp系統(tǒng)不匹配，建議實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)顯

10、色體系。免疫熒光原理及特點(diǎn)免疫熒光原理及特點(diǎn)免疫熒光就是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理及特殊的熒光素標(biāo)記技術(shù)，通過激光激發(fā)使熒光素發(fā)出熒光，在熒光顯微鏡下觀察熒光的變化從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行分析的技術(shù)。用免疫熒光顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）技術(shù)。免疫熒光具有特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快等特點(diǎn)。免疫熒光免疫熒光（immunofluorescence, if）免疫熒光原理示意圖免疫熒光原理示意圖免疫熒光實(shí)驗(yàn)過程免疫熒光實(shí)驗(yàn)過程 細(xì)胞爬片（多聚賴氨酸處理，生長密度細(xì)胞爬片（多聚賴氨酸處理，生長密度70-80%70-80%） 細(xì)胞固定（合適的固定液，如細(xì)胞固定（

11、合適的固定液，如4%4%甲醛溶液等）甲醛溶液等） 細(xì)胞膜穿透（細(xì)胞膜穿透（ triton x-100 triton x-100 等）等） 封閉（封閉（3%bsa-pbs3%bsa-pbs等）等） 一抗孵育一抗孵育 熒光二抗孵育熒光二抗孵育 胞漿胞漿/ /核襯染（鬼筆環(huán)肽核襯染（鬼筆環(huán)肽/dapi/pi/dapi/pi） 封片熒光顯微鏡拍照封片熒光顯微鏡拍照 免疫熒光結(jié)果分析免疫熒光結(jié)果分析免疫熒光雙染色抗體的選擇免疫熒光雙染色抗體的選擇直接法：直接法：一抗種屬來源無要求標(biāo)記兩種不同熒光素的一抗。間接法：間接法：一抗種屬來源來源不同二抗分別標(biāo)記不同熒光素。細(xì)胞核襯染染料：細(xì)胞核襯染染料：dapi

12、是一種能夠與dna強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料它可以透過完整的細(xì)胞膜，因此以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm，其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。hoechst 33342 是一種dna結(jié)合型熒光染料,可以嵌合到堿基分子中,在紫外激發(fā)光作用下發(fā)出蘭色熒光.能夠透過完整的細(xì)胞膜，可用于活細(xì)胞染色。碘化丙啶碘化丙啶(pi)是一種溴化乙啶的類似物，它在嵌入雙鏈dna后釋放紅色熒光。盡管pi不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色。pi-dna復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535nm和 615nm。細(xì)胞漿襯染染料：細(xì)胞漿襯染染料：鬼筆環(huán)肽鬼筆環(huán)肽（phal

13、loidin ）由鬼筆鵝膏真菌（amanita phalloides）產(chǎn)生的一種環(huán)肽?？膳cf肌動(dòng)蛋白結(jié)合，使f肌動(dòng)蛋白保持穩(wěn)定。其熒光標(biāo)記物是鑒定f肌動(dòng)蛋白的重要試劑。熒光抗體的選擇：熒光抗體的選擇：綠色熒光素：綠色熒光素：fitc，alex488，dylight488等。紅色熒光素：紅色熒光素：pe，alex546等。各種熒光染料原理及選擇各種熒光染料原理及選擇2.信號(hào)弱或無信號(hào)信號(hào)弱或無信號(hào)無目的蛋白或表達(dá)量極少，建議選用表達(dá)量高的細(xì)胞或組織。細(xì)胞通透性差，建議增加通透劑的作用時(shí)間或濃度。一抗/二抗?jié)舛忍?，建議增大其濃度。二抗選擇錯(cuò)誤（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。1.背

14、景過高背景過高一抗質(zhì)量不高，建議使用特異性高、效價(jià)高的一抗。一抗/二抗?jié)舛忍?，建議降低一抗/二抗?jié)舛?。封閉不完全，建議增加蛋白封閉時(shí)間。洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時(shí)間?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)熒光顯微鏡的參數(shù)來減低背景。3.熒光猝滅快熒光猝滅快熒光素本身特性決定，光穩(wěn)定性差，建議選用光穩(wěn)定性好的熒光素二抗。用普通的封片劑封片，建議選用防熒光猝滅劑封片。免疫熒光常見問題分析免疫熒光常見問題分析4.細(xì)胞有自發(fā)熒光細(xì)胞有自發(fā)熒光使用了戊二醛固定，建議在固定后熒光染色前進(jìn)行熒光淬滅，如使用naio4，nabh4，甘氨酸等，染色前檢查自發(fā)熒光。材料本身（如石蠟）有自發(fā)熒光，建議設(shè)立陰性對(duì)照，通過降低熒光顯微鏡的

15、參數(shù)來消除背景染色。 細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（例如核黃素、細(xì)胞色素等）的含量高；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞活細(xì)胞比例高；流式細(xì)胞術(shù)定義及原理流式細(xì)胞術(shù)定義及原理 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀（flow cytometor）：）： 進(jìn)行流式細(xì)胞分析的儀器，是集光電子物理，光電測(cè)量，計(jì)算機(jī)，細(xì)胞熒光化學(xué)，抗體技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）: 利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速流動(dòng)的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速（每秒可達(dá)1000-10000個(gè)）的定量分析和分選（純度可達(dá)99%以上）的技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, fc）細(xì)細(xì) 胞胞抗抗

16、原原一一抗抗二二抗抗熒光物質(zhì)（熒光物質(zhì)（fitc,pefitc,pe等）等）不同顏色的不同顏色的激發(fā)光激發(fā)光fcfc反應(yīng)原理示意圖反應(yīng)原理示意圖激光源激光源轉(zhuǎn)化為計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)化為計(jì)算機(jī)識(shí)別數(shù)據(jù)識(shí)別數(shù)據(jù)流式細(xì)胞儀工作原理圖流式細(xì)胞儀工作原理圖流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)過程流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)過程 細(xì)胞懸浮液制備（濃度為細(xì)胞懸浮液制備（濃度為1 15 5106個(gè)個(gè)/ml） 細(xì)胞固定（合適的固定液，如細(xì)胞固定（合適的固定液，如4%4%甲醛溶液等）甲醛溶液等） 細(xì)胞膜穿透（細(xì)胞膜穿透（ 冰冷的甲醇等）冰冷的甲醇等） 封閉（封閉（3%bsa-pbs3%bsa-pbs等）等） 一抗孵育一抗孵育 熒光二抗孵育熒光二抗孵育 流式細(xì)

17、胞儀分析流式細(xì)胞儀分析人外周全血細(xì)胞雙參數(shù)散點(diǎn)圖人外周全血細(xì)胞雙參數(shù)散點(diǎn)圖直方圖：?jiǎn)螀?shù)分析直方圖：?jiǎn)螀?shù)分析流式細(xì)胞術(shù)常見結(jié)果分析流式細(xì)胞術(shù)常見結(jié)果分析散點(diǎn)圖：多參數(shù)分析散點(diǎn)圖：多參數(shù)分析常用細(xì)胞表型及意義：常用細(xì)胞表型及意義：（cluster of differentiation, cd）cd3 總總t t細(xì)胞細(xì)胞cd4 t t輔助輔助/ /誘導(dǎo)細(xì)胞亞群誘導(dǎo)細(xì)胞亞群cd8 t t抑制抑制/ /細(xì)胞毒細(xì)胞亞群細(xì)胞毒細(xì)胞亞群cd19 b b細(xì)胞抗原細(xì)胞抗原ll: cd3cd3- -cd4cd4- - b b細(xì)胞群細(xì)胞群+ +細(xì)胞細(xì)胞毒毒t t細(xì)胞亞群細(xì)胞亞群lr：cd3cd3+ +cd4cd4

18、- - 細(xì)胞毒細(xì)胞毒t t細(xì)胞亞細(xì)胞亞群群ur：cd3cd3+ +cd4cd4+ + t t輔助細(xì)胞亞群輔助細(xì)胞亞群ul 0.70 ur 24.2lr22.3ll 52.80 熒光補(bǔ)償示原理熒光補(bǔ)償示原理熒光補(bǔ)償是指修正熒光滲漏的過程，如從探測(cè)器出去除匹配熒光以外的任何熒光信號(hào)。當(dāng)采用兩種或兩種以上熒光標(biāo)記時(shí)（如fitc,pe），當(dāng)攜帶兩種熒光素的細(xì)胞受到激光照射激發(fā)時(shí)，將發(fā)出兩種不同波長的熒光。然而，熒光染料所發(fā)出的熒光都具有一定的波長范圍（寬發(fā)射譜性質(zhì)），雖然各自的熒光峰值不同，但發(fā)射譜范圍會(huì)有一定的重疊。因而就會(huì)造成不同通道之間的熒光干擾，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。熒光補(bǔ)償示意圖熒光補(bǔ)償示意圖

19、annexin v-fitc/pi凋亡檢測(cè)原理凋亡檢測(cè)原理 在細(xì)胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，ps）可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。 annexin v是一種分子量為35-36kd的ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸ps高親和力特異性結(jié)合。 將annexin v進(jìn)行熒光素（fitc、pe）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的annexin v-fitc作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 碘化丙啶（propidium iodide，pi）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在細(xì)胞凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，碘化丙啶pi能夠透過