龍眼核醋酸乙酯部位的抗氧化活性研究

1、龍眼核醋酸乙酯部位的抗氧化活性研究                          作者：李雪華，吳妮妮，李福森，黃燕軍，龍盛京【摘要】  目的研究龍眼（Dimocarpus longan lour.）核醋酸乙酯部位的抗氧化活性。方法通過乙醇提取、醋酸乙酯溶劑萃取、硅膠柱層析等方法，分離提取不同的極性組分(Fr1Fr16)。運用TBA比

2、色法分別測定了Fr8Fr16各組分的抗脂質(zhì)過氧化活性、應(yīng)用Fenton 原理測定了各組分清除羥自由基的活性。結(jié)果分離提取得到16個極性不同的組分(Fr1Fr16)，流分Fr8Fr16對抑制脂質(zhì)過氧化物、清除羥自由基均具有較好作用，其中部分流分的活性具有量-效關(guān)系。最高的抑制率和清除率可達到68.5%。結(jié)論龍眼核醋酸乙酯部位的不同流分均具有一定的抑制脂質(zhì)過氧化作用和清除羥氧自由基作用。 【關(guān)鍵詞】  龍眼核 抗氧化作用 自由基Abstract：ObjectiveTo investigate the anti-oxidative effect of chemical constituen

3、ts in Longan seed，ethyl acetate fraction. MethodsDifferent fraction constituents of longan seed were obtained by isolating with ethanol solvent, extracting with ethyl acetate and purifying with colomn chromatography and recrystallization and so on. With the help of TBA spectrometric method, effects

4、of ethyl acetate extract from Longan seed on lipid peroxidation were measured by the determination of malondialdehyde (MDA) that was produced by the lipid peroxidation of liver tissue homogenate and mitochondria induced by cysteine-Fe2+system and on scavenging of hydroxyl radical were determined by

5、Fenton system. ResultsSixteen constituents of longan seed , ethyl acetate fraction(Fr1Fr16) were obtained. Fraction Fr8Fr15 could inhibit the lipid peroxidation of liver tissue homogenate and the lipid peroxidation of mitochondria induced by Fe2+-Cys and scavenge hydroxyl radical. Some fractions'

6、;s activities are in dose-dependent manners. Conclusion Constituents of longan seed , ethyl acetate fraction have good antilipid-peroxidation effect and scavenge hydroxyl radical activity.Key words：Longan seed;  Anti-oxidation effect;  Free radicals龍眼Dimocarpus longan lour.俗名桂圓，是無患子科龍眼屬植物。

7、其核具有止血、定痛、理氣化濕，治創(chuàng)傷出血、疝氣等1和治狐臭作用2，近期有研究表明龍眼核的提取物有降血糖的作用3，龍眼果肉及龍眼多糖具有抗氧化的作用4，5，但龍眼核中化學成分的抗氧化作用研究尚未見報道。為了對龍眼核作進一步的開發(fā)利用，本實驗對龍眼核進行了體外抗氧化作用的研究?，F(xiàn)報道如下。1  材料與儀器1.1   材料與試劑實驗用的原料為石硤龍眼干的核，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究所嚴克儉助理研究員鑒定，為無患子科植物龍眼的干燥果實。實驗用測試樣品為龍眼核醋酸乙酯浸膏，再經(jīng)硅膠柱層析洗脫而得的各流份。SD大鼠，體重200300 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。硫代巴比妥酸（

8、TBA）、鹽酸、考馬斯亮藍、硫酸亞鐵、半胱氨酸、磷酸水楊酸、過氧化氫等試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。1.2  儀器設(shè)備752N紫外可見分光光度計、FJ-200高速分散勻質(zhì)機（上海標本模型廠制造）、3145臺式高速冷凍離心機、數(shù)顯式三用電熱恒溫水溫箱（上海躍進醫(yī)療機械廠）、精密天平、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（一臺為RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；另一臺為上海醫(yī)械專機廠生產(chǎn)），醫(yī)用循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），電熱恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備廠），721型可見分光光度計（上海第三分析儀器廠），PHS-2C型精密酸度計（上海雷磁儀器廠），SK-1 快速混勻器（江蘇省金壇縣岸頭實驗儀器廠）

9、，800型離心沉淀器（上海手術(shù)器械十廠），HC-TP11-10架盤藥物天平（上海精科工廠）等。2  方法2.1  龍眼核醋酸乙酯流分分離提取及測試樣品的制備干燥龍眼核粉末（9.97 kg），4倍龍眼核粉體積的75%乙醇浸泡24 h，過濾，濾渣再重復上述操作6次，合并提取液，濃縮，得到龍眼核乙醇總浸膏1.82 kg。用適量水溶解，再依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到石油醚浸膏41 g，醋酸乙酯浸膏41.8 g和正丁醇浸膏156.2 g。實驗用的測試樣品為醋酸乙酯浸膏，再經(jīng)硅膠柱層析分離，硅膠薄板鑒定合并相同流份而得，編號為Fr1Fr16，另外從流分Fr8中重結(jié)晶得到

10、的產(chǎn)物為沒食子酸乙酯的粗結(jié)晶，其編號為Fr 16，每一個樣品按一定濃度加雙蒸水配制成一系列梯度濃度溶液。分別對各合并流分按下列方法進行抗氧化活性測定。2.2  龍眼核醋酸乙酯流分抗脂質(zhì)過氧化的測定4SD大鼠禁食12 h，次日斷頭處死。迅速取出肝臟，置4生理鹽水中洗凈表面殘血，用濾紙吸干水分，稱重，用pH 7.4的PBS溶液在冰浴條件下配制成10%肝勻漿備用。取肝勻漿貯備反應(yīng)液1.00 ml，加入不同濃度的龍眼核測試樣品溶液1.00 ml，再加0.10 ml 1.00mmol/L硫酸亞鐵、0.02 ml 0.01 mol/ml L-半胱氨酸，無糖PBS溶液補足到相同體積，混勻，37水浴

11、15 min，再加入2.00 ml 20% 醋酸終止反應(yīng)，最后加入1.00 ml0.67% TBA，混勻，沸水中加熱15 min，冷卻，于3 000 r/min離心10min，取上清液于535 nm處測吸光度值A(chǔ)，每個樣品做3個平行實驗并取其平均值，以獲取脂質(zhì)過氧化物終產(chǎn)物丙二醛含量?？瞻坠苡肞BS溶液代替，對照管不加樣品液，以0.1 ml TEP（50 mol/L）產(chǎn)生的丙二醛作為標準，求出丙二醛的生成量和對脂質(zhì)過氧化物的抑制率(I%)。然后根據(jù)抑制率與樣品濃度的量效關(guān)系，若為線性關(guān)系，則求出其回歸方程和相關(guān)系數(shù)r，根據(jù)方程求出抑制率達50%時所需的樣品量IC50。  &

12、#160; I（%）=A對照-A試樣A對照-A空白×100%2.3  龍眼核醋酸乙酯流分對羥氧自由基清除作用的測定6根據(jù)Fenton反應(yīng)原理，H2O2在Fe2+存在的情況下生成·OH：Fe2+H2O2Fe3+·OH+OH-，·OH可使番紅花T褪色，即在520 nm可測出·OH的生成情況，進而檢測出加入樣品的抗氧化活性。在試管中加入0.75 mmol/L pH值為7.4的磷酸緩沖液1.0 ml，520 g/ml番紅0.1 ml，2 mmol/LEDTA-Fe2+ 0.5 ml，再加入不同量的樣品溶液,最后加入3%的H2O2 0.5 ml

13、（新鮮配制），雙蒸水補至總體積為5.1 ml，混勻后于37水浴保溫30 min，然后在波長520 nm處測吸光度A值。每個樣品作3個平行樣，取其平均值。空白組以等體積的雙蒸水代替樣品溶液，對照組以等體積的雙蒸水代替樣品溶液和FeSO4溶液。陽性對照以苯甲酸代替樣品溶液。實驗結(jié)果以清除率E表示：E（%）=A試樣-A空白A對照-A空白×100%    然后根據(jù)清除率與樣品濃度的量-效關(guān)系，若為線性關(guān)系，則求出其回歸方程和相關(guān)系數(shù)r，根據(jù)方程求出清除率達50%時所需的樣品量IC50。3  結(jié)果機體內(nèi)的自由基損傷參與多種生理和疾病過程，如炎癥、心血管疾

14、病、風濕和類風濕、衰老以及組織損傷和惡性腫瘤等。機體在正常狀態(tài)時，呼吸鏈中就有自由基的產(chǎn)生，但同時機體內(nèi)存在內(nèi)源性的抗氧化體系，使自由基的產(chǎn)生和滅活處于一個動態(tài)平衡的狀態(tài)。但當自由基產(chǎn)生過多或清除過慢時，就可造成生物大分子的損傷。脂質(zhì)過氧化損傷是自由基損傷中的主要危害之一。生物膜富含不飽和脂肪酸，最易受到自由基攻擊，引起脂質(zhì)過氧化損傷。在Fe2+-半胱氨酸自由基發(fā)生系統(tǒng)中，由Fe2+-半胱氨酸促使氧自由基的生成，引起鏈式和支鏈式反應(yīng)，使多不飽和脂肪酸進一步發(fā)生過氧化形成LPO。MDA是LPO的主要降解產(chǎn)物，其水平可作為評價脂質(zhì)過氧化程度的指標。1     

15、;    3.1 龍眼核醋酸乙酯流分Fr8Fr16抗脂質(zhì)過氧化作用乙醇提取的龍眼核醋酸乙酯部位分離所得的各流分Fr8Fr16抗脂質(zhì)過氧化作用結(jié)果如圖1所示，圖中曲線為Fr8Fr16不同濃度的水溶液（總濃度小于80g/ml），對脂質(zhì)過氧化物的抑制率。從圖1中可知，各流分均具有一定的抗脂質(zhì)過氧化作用，而且隨著樣品濃度增加，抑制率也逐漸增加，測試樣與抑制率呈一定的量效關(guān)系；當樣品濃度達75 g/ml時，F(xiàn)r11和Fr14抑制率可分別達65.5%和68.5%；當樣品濃度增加超過50 g/ml時，各流分的抑制率基本不變，趨于穩(wěn)定，說明龍眼核醋酸乙酯Fr8Fr16流

16、分的抗脂質(zhì)過氧化物作用存在一有效濃度范圍，其抗脂質(zhì)過氧化作用能力只需在較小量的濃度范圍內(nèi)就能發(fā)揮較好的作用。    從表1可知，當樣品濃度小于50 g/ml濃度范圍時，F(xiàn)r9，F(xiàn)r10，F(xiàn)r13流分抑制率與濃度線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)r分別為0.992 2，0.996 8，0.990 6；從各流分的抗脂質(zhì)過氧化物的IC50看，它們的抗脂質(zhì)過氧化物能力的大小順序為：    從表1中IC50順序：Fr16<FR8<FR9<FR12<FR10<FR15，說明樣品的抗脂質(zhì)過氧化物作用不隨流分的極性順序增大而增大，而

17、是與其流分的成分有關(guān)。其中FR8和FR16具有最小的IC50，說明其抗脂質(zhì)過氧化物的作用在醋酸乙酯各流份中最強。FR8和FR16的IC50也很接近，從圖1曲線看，兩曲線也基本吻合，因FR16是從FR8中結(jié)晶而得，兩者主要成分相同（FR16晶體已鑒定為沒食子酸乙酯，也說明FR8中的其它微弱同極性成分對沒食子酸乙酯的抗氧化作用無協(xié)同作用。表1&NBSP; 龍眼核醋酸乙酯流分Fr8Fr16抗脂質(zhì)過氧化作用IC50（略）< p> 3.2  龍眼核醋酸乙酯流分Fr8Fr16對羥氧自由基·OH的清除作用乙醇提取的龍眼核醋酸乙酯部位分離所得的各流分Fr8Fr16對羥氧

18、自由基清除作用如圖2所示。圖2中曲線為Fr8Fr16流分的不同濃度的水溶液（總濃度小于0.70 mg/ml），對·OH自由基的清除率。從圖2可知龍眼核醋酸乙酯流分Fr8Fr16在濃度小于0.70 mg/ml時均具清除由EDTA Na2-Fe()-H2O2體系產(chǎn)生的·OH作用，且呈一定的量-效關(guān)系，即隨著樣品濃度的增大，清除率逐漸增加，最高清除率可達68%。圖2中曲線及表2中的r值也顯示其中樣品Fr10，F(xiàn)r12，F(xiàn)r16濃度與清除率具有良好的線性關(guān)系。但Fr16和Fr12的清除率不受濃度范圍的限制，提示可成為不錯的清除·OH的活性成分。從表2可知，與陽性對照苯甲酸

19、的IC50比較，相關(guān)系數(shù)較好的流份Fr10，F(xiàn)r12及Fr16的IC50都比陽性對照的高，說明其具有很好的清除羥氧自由基作用。表2  龍眼核醋酸乙酯流分Fr8Fr15對羥氧自由基清除作用IC50（略）從圖1與圖2對比看，龍眼核醋酸乙酯的水溶性流份Fr8Fr16清除羥氧自由基的結(jié)果與抗脂質(zhì)過氧化作用具有相似的結(jié)果。但在清除羥氧自由基的測定中，F(xiàn)r8和Fr16流分雖具有相同主要成分，其清除效率卻不同，也與樣品的抗脂質(zhì)過氧化物作用具有相似的結(jié)果不同，可能與Fr8流分的其它成分存在協(xié)同作用有關(guān)，提示不同的活性氧有時需要不同的抗氧化劑。4  討論本實驗通過對乙醇提取的龍眼核醋酸乙酯部

20、位分離所得的各流分Fr8Fr16的體外抗脂質(zhì)過氧化活性、清除羥氧自由基的活性測定研究，為尋找和追蹤龍眼核有效的抗氧化活性物質(zhì)提供實驗依據(jù)。Fr8Fr16流分樣品的水溶解性較好，抗氧化活性量效線性趨勢明顯，這些流份有較好的抗氧化活性，可成為較理想的抗氧化劑。結(jié)合化學分離結(jié)果分析，從Fr8流分中反復重結(jié)晶得到Fr16是化合物沒食子酸乙酯，對Fr8以后的流分，經(jīng)對其化學成分進行定性實驗，發(fā)現(xiàn)其主要成分為多酚類物質(zhì)，多酚類物質(zhì)被公認為抗氧化類物質(zhì)。綜合抗脂質(zhì)過氧化結(jié)果和清除羥氧自由基結(jié)果，可推測，龍眼核醋酸乙酯水溶性流份活性及變化趨勢可能和偏極性含多酚類物質(zhì)如鞣質(zhì)成分等有關(guān)。大量的研究表明多酚類化合物具有很好的抗氧化活性，共軛苯環(huán)上含有的酚羥基可以參