高效液相色譜法測定注射用黃芩莖葉總黃酮中野黃芩苷的含量

1、高效液相色譜法測定注射用黃芩莖葉總黃酮中野黃芩苷的含量                     作者：李國軍，毛曉霞，蘇占輝，劉玉翠，陳四平 【摘要】   目的測定注射用黃芩莖葉總黃酮中野黃芩苷的含量。方法高效液相色譜法。結(jié)果野黃芩苷進樣量在0.914.55 g范圍內(nèi)，峰面積積分值與進樣量有良好的線性關(guān)系，r=0.999 9，平均加樣回收率為99.23%，RSD=2.21%。結(jié)論該法可以

2、用于該藥的質(zhì)量控制。 【關(guān)鍵詞】   注射用黃芩莖葉總黃酮 野黃芩苷 高效液相色譜法    黃芩莖葉為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥地上部分,其有效部位為黃芩莖葉總黃酮（total flavonoids from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi, SSF），其化學(xué)成分主要包括野黃芩苷、黃芩苷、芹菜素苷、白楊素-7-O-D-葡萄糖醛酸苷等黃酮類化合物。其中野黃芩苷具有清熱解毒、擴張血管、改善體內(nèi)微循環(huán)等明顯藥理活性1。藥 理學(xué) 研究發(fā)現(xiàn)黃

3、芩莖葉總黃酮具有較強的抗病毒、抗炎、抗氧化、降血脂和較強的記憶改善作用24。為了有效地發(fā)揮黃芩莖葉的藥用價值，方便急診及不能口服藥物的病人，我們將黃芩莖葉有效成分精制純化，研制了注射用黃芩莖葉總黃酮。本實驗通過建立HPLC法測定注射用黃芩莖葉總黃酮中野黃芩苷含量的方法來控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量。 1  儀器與試藥 1.1  儀器Shimadzu10ATvp高效液相色譜儀，CLASSvp5.0色譜數(shù)據(jù)工作站，瑞士產(chǎn)梅特AG-245型 電子 分析天平，惠普HP-8453紫外可見分光光度計，KQ-100E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。1.2  試藥野黃芩苷對照品（

4、 中國 藥品生物制品檢定所，批號110842-200504），注射用黃芩莖葉總黃酮（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所研制）。 2   方法與結(jié)果 2.1   色譜條件色譜柱為Discovery C18(4.6 mm×250 mm, 5 m)；流動相為以甲醇-0.1%甲酸溶液進行梯度洗脫，030 min由40%的甲醇的0.1%甲酸溶液增加到70%甲醇的0.1%甲酸溶液；流速0.8 ml/min；檢測波長335 nm；柱溫26；進樣量10 l。2.2   檢測波長的選擇將野黃芩苷對照品溶液進行光譜掃描，結(jié)果最大吸收波長為335 nm，故選擇

5、335 nm為檢測波長。2.3   對照品溶液的制備精密稱取五氧化二磷減壓干燥器中干燥24 h的野黃芩苷對照品22.75 mg至50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液(0.455 mg/ml)，備用。精密吸取上述溶液5 ml至10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；作為對照品溶液(0.227 5 mg/ml)。2.4   供試品溶液的制備 取黃芩莖葉總黃酮凍干粉10 mg,精密稱定，置10 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min使溶解，放冷，補加甲醇至刻度，搖勻，放置，取上清液用微孔濾膜（0.45 m）濾過，取續(xù)濾液，作

6、為供試品溶液。2.5   空白試驗按照樣品制備工藝，制成不含黃芩莖葉總黃酮成分的空白凍干粉針，作為陰性對照，同法測定。結(jié)果空白凍干粉在與野黃芩苷對照品相同保留時間處無色譜峰，故認(rèn)為無干擾。2.6   線性關(guān)系考察精密吸取濃度為0.455 mg/ml的野黃芩苷對照品儲備液2，4，6，8，10 l依次注入色譜儀中，在前述色譜條件下，測定野黃芩苷的峰面積，結(jié)果見表1。以進樣量X（g）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖1?；貧w處理得直線方程為Y=5×106X-351 032，r=0.999 9。表1  線性關(guān)系測定結(jié)果（略）x

7、    【摘要】   目的測定注射用黃芩莖葉總黃酮中野黃芩苷的含量。方法高效液相色譜法。結(jié)果野黃芩苷進樣量在0.914.55 g范圍內(nèi)，峰面積積分值與進樣量有良好的線性關(guān)系，r=0.999 9，平均加樣回收率為99.23%，RSD=2.21%。結(jié)論該法可以用于該藥的質(zhì)量控制。 【關(guān)鍵詞】   注射用黃芩莖葉總黃酮 野黃芩苷 高效液相色譜法    黃芩莖葉為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥地上部分,其有效部位為黃芩莖葉總黃酮（total flavonoids

8、from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi, SSF），其化學(xué)成分主要包括野黃芩苷、黃芩苷、芹菜素苷、白楊素-7-O-D-葡萄糖醛酸苷等黃酮類化合物。其中野黃芩苷具有清熱解毒、擴張血管、改善體內(nèi)微循環(huán)等明顯藥理活性1。藥 理學(xué) 研究發(fā)現(xiàn)黃芩莖葉總黃酮具有較強的抗病毒、抗炎、抗氧化、降血脂和較強的記憶改善作用24。為了有效地發(fā)揮黃芩莖葉的藥用價值，方便急診及不能口服藥物的病人，我們將黃芩莖葉有效成分精制純化，研制了注射用黃芩莖葉總黃酮。本實驗通過建立HPLC法測定注射用黃芩莖葉總黃酮中野黃芩苷含量的方法來控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量。 1

9、  儀器與試藥 1.1  儀器Shimadzu10ATvp高效液相色譜儀，CLASSvp5.0色譜數(shù)據(jù)工作站，瑞士產(chǎn)梅特AG-245型 電子 分析天平，惠普HP-8453紫外可見分光光度計，KQ-100E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。1.2  試藥野黃芩苷對照品（ 中國 藥品生物制品檢定所，批號110842-200504），注射用黃芩莖葉總黃酮（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所研制）。 2   方法與結(jié)果 2.1   色譜條件色譜柱為Discovery C18(4.6 mm×250 mm, 5 m)；流動相為以甲醇

10、-0.1%甲酸溶液進行梯度洗脫，030 min由40%的甲醇的0.1%甲酸溶液增加到70%甲醇的0.1%甲酸溶液；流速0.8 ml/min；檢測波長335 nm；柱溫26；進樣量10 l。2.2   檢測波長的選擇將野黃芩苷對照品溶液進行光譜掃描，結(jié)果最大吸收波長為335 nm，故選擇335 nm為檢測波長。2.3   對照品溶液的制備精密稱取五氧化二磷減壓干燥器中干燥24 h的野黃芩苷對照品22.75 mg至50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液(0.455 mg/ml)，備用。精密吸取上述溶液5 ml至10 ml量瓶中，加甲

11、醇稀釋至刻度，搖勻；作為對照品溶液(0.227 5 mg/ml)。2.4   供試品溶液的制備 取黃芩莖葉總黃酮凍干粉10 mg,精密稱定，置10 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min使溶解，放冷，補加甲醇至刻度，搖勻，放置，取上清液用微孔濾膜（0.45 m）濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。2.5   空白試驗按照樣品制備工藝，制成不含黃芩莖葉總黃酮成分的空白凍干粉針，作為陰性對照，同法測定。結(jié)果空白凍干粉在與野黃芩苷對照品相同保留時間處無色譜峰，故認(rèn)為無干擾。2.6   線性關(guān)系考察精密吸取濃度為0.455 mg/ml的野黃

12、芩苷對照品儲備液2，4，6，8，10 l依次注入色譜儀中，在前述色譜條件下，測定野黃芩苷的峰面積，結(jié)果見表1。以進樣量X（g）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖1?；貧w處理得直線方程為Y=5×106X-351 032，r=0.999 9。表1  線性關(guān)系測定結(jié)果（略）結(jié)果表明野黃芩苷進樣量在0.914.55 g范圍內(nèi)，峰面積積分值與進樣量有良好的線性關(guān)系。2.7   精密度實驗精密吸取野黃芩苷對照品溶液（0.227 5 mg/ml）10l，連續(xù)進樣6次，記錄對照品峰面積依次為10 527 733，10 519 059，10 419 713

13、，10 553 602，10 523 716，10 630 278，測定結(jié)果RSD為0.64%, 表明精密度良好。2.8   穩(wěn)定性實驗精密吸取同一供試品溶液10 l，于制樣后0，2，4，8，24 h連續(xù)進樣測定，峰面積分別為10 589 059，10 823 828，10 499 713，10 533 653，10 714 625，測定結(jié)果RSD為1.27%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.9   重復(fù)性實驗取同批樣品（批號080718）5份，按樣品含量測定項下依法平等操作，測定每份樣品中野黃芩苷含量分別為0.221, 0.214, 0.

14、219, 0.229, 0.218 mg/mg，測定結(jié)果RSD為2.52%。2.10   加樣回收率實驗取6份已知野黃芩苷含量的供試品5 mg(批號080718，平均含量為0.220 mg/mg)，精密稱定，各精密加入野黃芩苷儲備液（0.455 mg/ml）3 ml，按供試品溶液制法制備，依法測定， 計算 加樣回收率，結(jié)果平均回收率為99.23%，RSD為2.21%。結(jié)果見表2。表2  野黃芩苷回收率實驗（略）2.11  樣品中野黃芩苷的含量測定精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10l，分別進樣測定，色譜圖見圖2，以外標(biāo)法計算注射用黃芩莖葉總黃酮中野黃芩苷

15、的含量。測定3批，每批測定3份。結(jié)果見表3。表3  樣品中野黃芩苷含量（略） 3  討論     本文采用HPLC法對注射用黃芩莖葉總黃酮中主要成分野黃芩苷進行含量測定，通過加樣回收率及精密度實驗，證明該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可以用于控制該藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量。    通過對不同批次樣品含量測定結(jié)果，建議注射用黃芩莖葉總黃酮中野黃芩苷含量應(yīng)不低于0.200 mg/mg。 【 參考 文獻 】   1國家醫(yī)藥管理局中草藥情報中心站植物藥有效成分手冊M北京：人民衛(wèi)生出版社，1986:946.2Moore P B, Day J P, Taylor G A, et al. Absorption of aluminium 26in AlzhEimer's disease, measured using accelerator mass spectrometryJ. Dement Geriatr cogn Disord, 2000, 11(2): 66.3Shang YZ,