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文檔簡介

1、復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版Fudan Univ J Med Sci 2004May ,31(3311堿性單細(xì)胞凝膠電泳鋪膠技術(shù)的改進(jìn)3高建軍豐盛梅金慰芳(復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所骨代謝研究室上海200032【摘要】目的聚苯乙烯孔槽單層鋪膠技術(shù)在堿性單細(xì)胞凝膠電泳中的可行性研究。方法槽的載膠片, 將1%低熔點(diǎn)凝膠與淋巴細(xì)胞混合后單層鋪膠, 經(jīng)6G y , 觀察膠面和淋巴細(xì)胞的DNA 損傷情況。結(jié)果, ; 淋巴細(xì)胞DNA 電泳圖像清晰,6G y 照射產(chǎn)生的“彗星”形態(tài)特征明顯。, 可以克服堿性單細(xì)胞凝膠電泳中的膠板脫落等問題?!娟P(guān)鍵詞】堿性單細(xì)胞凝膠電泳; 聚苯乙烯孔槽; 【中國圖書館分類法分類號】R 811

2、. 5on Alkali Single Cell G el ElectrophoresisJian 2jun ,FEN G Sheng 2mei ,J IN Wei 2fang(Bone Department , Institute of Radiation Medicine , Fudan U niversity , S hanghai 200032, China 【Abstract 】Purpose To determine the possibility of the mono 2layer gel on ploystyrene ponds used in alkalisingle ce

3、ll gel electrophoresis (ASCGE . Methods The carried slice was prepared with the cover of tis 2sue 2culture plate. The mono 2layer gel plates were made by filling the polystyrene ponds with 1%LMA em 2bedded lymphocytes and exposed to 6G y rays irradiation ,then analysis were performed by comet assay

4、in alkaline solution. R esults The gel surface was smooth and glossy and there was no gel departure or drift in the operate process. The DNA images were clear and the comet morphological character was showed obvi 2ously in the cells exposed to 6G y rays irradiation. Conclusions The mono 2layer gel o

5、n polystyrene ponds can avoid the gel departure and drift in ASCGE.rays irradiation 【K ey w ords 】alkali single cell gel electrophoresis ; polystyrene pond ; agarose ; 堿性單細(xì)胞凝膠電泳(alkaline single cell gelelectrophoresis ,ASCGE 技術(shù), 是單細(xì)胞凝膠電泳, 又稱彗星分析技術(shù)(comet assay 中的一種技術(shù), 可于單細(xì)胞水平快速靈敏檢測DNA 單鏈斷裂而得到廣泛應(yīng)用。但其制

6、膠步驟多、時(shí)間長, 膠板易損壞和膠落的問題沒有很好解決, 給該技術(shù)的規(guī)范和推廣帶來一定困難。因此, 我們嘗試采用聚苯乙烯孔槽進(jìn)行鋪膠, 簡化操作步驟。材料和方法載膠片準(zhǔn)備取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC 蓋, 用美工刀裁成25mm ×68mm 大小載膠片(共16孔 若干, 蒸餾水沖洗, 置清潔處晾干。鋪膠取淋巴細(xì)胞懸液(肝素抗凝, 淋巴細(xì)胞分離液分離, 錐蟲藍(lán)排斥試驗(yàn)存活率大于95% , PBS3復(fù)旦大學(xué)985項(xiàng)目基金資助稀釋為4×104/mL 后與1%低熔點(diǎn)凝膠(LMA , SIGMA 按體積13混合, 平鋪在預(yù)溫的載膠片孔槽內(nèi)(18L/孔 , 即轉(zhuǎn)移至4暗盒。照射將鋪膠的載

7、膠片置4濕盒內(nèi)于137Cs 放射源(劑量率為0. 9Gy/min , G amma Cell 40 接受單次6Gy 照射。對照組帶入準(zhǔn)備室, 不受照。裂解、解旋和電泳將受照后的載膠片小心浸入裂解液(2. 5mol/L NaCl , 100mmol/L Na 22ED 2TA ,100mmol/L Tirs ,p H 10; 臨用前加入1%Tri 2ton X -100和10%DMSO 于4暗盒進(jìn)行細(xì)胞裂解1h 20min 。經(jīng)0. 4mol/L Tris 緩沖液漂洗后浸 入電泳液(30mmol/L NaOH , 1mmol/L Na 22ED 2TA ,p H 13 于4暗盒進(jìn)行DNA 雙鏈解

8、旋20min , 電泳(18V ,70mA 30min 。閱片經(jīng)0. 4mol/L Tris 緩沖液中和后, 在膠312復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版 2004年5月,31(3 上滴加溴化乙錠(EB ,15g/mL , 每孔約5L , 于4暗盒染色10min 。用濾紙吸去載膠片上過多液體后, 置熒光顯微鏡下觀察和圖像采集(Nikon DXM 1200 。結(jié)果載膠片上單層灌膠后產(chǎn)生的凝膠膠面平整, 操作結(jié)束無膠落(圖1 。DNA 分子經(jīng)EB 染色后, 在紫外線照射下呈紅色。對照組DNA 分子聚集在細(xì)胞核, 電泳圖像清晰, 而6Gy 照射后產(chǎn)生的DNA 碎片經(jīng)電泳擴(kuò)散形成“彗星尾”狀影像, 形態(tài)特征明顯(圖2

9、。之在隨后的浸入或取出操作時(shí)脫落或漂浮。堿與玻璃的反應(yīng)產(chǎn)物可能也是膠中顆粒性雜質(zhì)的主要來源。因此選擇在堿性溶液中穩(wěn)定的材料, 避免蓋玻片推移和減低電泳時(shí)溫度等是必要的。為此, 我們根據(jù)聚苯乙烯材料性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn), 用96孔培養(yǎng)板蓋來裁制載膠片, 利用孔凸邊形成的圓形凹槽進(jìn)行單層鋪膠, 基本克服以上缺點(diǎn)。膠片大小可根據(jù)需要來定, 一般接近載玻片大小易于觀察操作, 如25mm ×68mm mm ×68mm 大小, 可有23, 其中兩, 鋪膠時(shí)將37LMA 1比例加入細(xì)胞懸液, 輕, 每孔灌膠1520L , 可形成9mm 厚約0. 20. 3mm 的0. 75%膠板, 一般灌膠1

10、8L 形成的膠面較平整, 載膠片預(yù)溫有利于圖Fig 1polystyrene ponds with gel膠板牢固貼附。我們采用該聚苯乙烯孔槽單層鋪膠的制膠方法縮短了鋪膠過程, 制成的膠面平整, 在隨后的裂解、電泳和中和等操作過程中無脫落。觀察時(shí)減少了雜質(zhì)干擾,DNA 電泳圖像清晰。6Gy 照射產(chǎn)生的“彗星”形態(tài)特征清楚典型, 與傳統(tǒng)方法一致5,6。同時(shí)鋪制的膠板大小一致, 裂解、電泳和中和等操作的條件相同, 單片上分組選擇多, 從而提高了各組數(shù)據(jù)的可比性, 尤其適合普查等多樣品分析使用。參考文獻(xiàn)圖2堿性單細(xì)胞凝膠電泳Fig 2T ypical images of alkali single

11、cell gel electrophoresisA :Untreatedhuman blood lymphocytes ; B :Human blood lymphocytes exposed to 6Gy of rays1Singh NP ,Mccoy MT , Tice RR , et al . A simple technique for quan 2titation of low levels of DNA damage in individual cells. Ex p CellRes ,1988,175:1842Hartmann A ,Agurell E ,Beevers C ,

12、et al . Recommendations for con 2ducting the i n vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. M utagenesis ,2003,18(1 :453張遵真, 衡正昌, 李蕊, 等. 單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)的最適條件研究.討論ASCGE 技術(shù)自Singh 等1建立以來, 被廣泛應(yīng)用于電離輻射、紫外線和氧化以及化學(xué)藥物引起的DNA 損傷檢測, 其操作規(guī)范已引起廣泛重視2。近年來盡管已在制膠等各方面進(jìn)行不斷改進(jìn)3,4, 如由傳統(tǒng)的磨毛載玻片上鋪3層凝膠的“夾心法”改進(jìn)為2層或單層灌膠法, 但膠板易損壞和膠落的問題仍沒有得到很好解決, 并且操作步驟多、時(shí)間長, 給該技術(shù)的規(guī)范和推廣帶來一定困難。實(shí)驗(yàn)失敗的原因主要包括蓋玻片揭取或推移時(shí)對凝膠板造成的撕裂或移動(dòng), 強(qiáng)堿對玻璃表面的侵蝕作用和電泳過程產(chǎn)生的溫度升高等, 使膠與玻璃表面貼附不穩(wěn)定, 使衛(wèi)生毒理學(xué)雜志,1998,12(4 :2494張建平, 田源, 陳道達(dá). 單細(xì)胞凝膠電泳制膠方法的改進(jìn). 癌變畸變突變,1998,10(3 :1895Olive PL ,Frazer G ,Banath J P. Radiati

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