丹酚酸 B 清除 DPPH 有機(jī)自由基活性及影響因素研究

1、(藥理藥化(收稿日期:2006204221;修訂日期:2006208212基金項目:江蘇省高校自然科學(xué)研究資助項目(No .05KJB330083作者簡介:柳艷(19822,女(漢族,江蘇鎮(zhèn)江人,現(xiàn)為南京醫(yī)科大學(xué)2004級碩士研究生,學(xué)士學(xué)位,主要從事營養(yǎng)與功能成分分析研究工作.3通訊作者簡介:李磊(19682,男(漢族,河南商丘人,現(xiàn)任南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院教授,博士學(xué)位,主要從事天然產(chǎn)物功能成分分析研究工作.丹酚酸B 清除DPPH 有機(jī)自由基活性及影響因素研究柳艷,李磊3,趙鴻雁(南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇南京210029摘要:目的探討丹酚酸B 清除DPPH 自由基的活性及其影響因素

2、。方法運(yùn)用自由基反應(yīng)模型觀察丹酚酸B 對DPPH 自由基的淬滅效應(yīng)。結(jié)合高效液相色譜技術(shù)分別研究溫度和pH 值對丹酚酸B 清除DPPH 能力的影響。結(jié)果在設(shè)定的反應(yīng)體系下,丹酚酸B 能有效清除DPPH 自由基。相同濃度下其清除能力高于二丁基羥基甲苯(BHT 和抗壞血酸(A s A 。熱處理后,丹酚酸B 含量和清除DPPH 自由基能力有不同程度下降。pH =3時丹酚酸B 含量相對穩(wěn)定,其清除能力較其它環(huán)境顯著增加。結(jié)論丹酚酸B 具有清除DPPH 自由基的能力。溫度對其含量和抗氧化能力有較大影響。酸性條件有利于丹酚酸B 的穩(wěn)定性和清除能力的增強(qiáng)。關(guān)鍵詞:丹酚酸B;1,12二苯基222苦肼基自由基;

3、清除;抗氧化中圖分類號:R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:100820805(20061222406202Study on the Scaveng i n g Acti v ity and I nfluence Factors of Sa lv i a noli c Ac i d B to D PPH Free Rad i ca lsL I U Y an,L IL ei 3,ZHAO H ong 2yan (College of Public Health of N anjing M edica l U niversity,N an jing 210029,China Abstract:O

4、 bjecti ve To study on the scavenging activity and influence fact ors of salvianolic acid B t o 1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl (DPPH free radicals .M ethods Free radical model was e mp l oyed t o investigate the scavenging activity t o DPPH,and the BHT and ascorbic acid (A s A were deter m ined

5、in parallel experi m ents .The effects of te mperature and pH value on the content of salvianolic acid B and its activity was studied by H igh Perfer mance L iquid Chr omat ography (HP LC .Results Salvianolic acid B had the effective scavenging activity under the DPPH free radical -scavenging syste

6、m s,compared with the BHT and A s A.Great significance was observed under the different heating te mperature and pH value .The good activity of anti oxidant potentials was gained under pH 3.Conclusi on Salvianolic acid B has a str ong anti oxidant activity,and anti oxidant activity of salvianolic ac

7、id B is affected significantly by heating ,and stable under acidic conditi ons .Key words:Salvianolicacid B;1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl;Scavenger;Anti oxidant activity自由基參與機(jī)體多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程,是血管損傷、細(xì)胞癌變的原始引發(fā)機(jī)制之一。清除自由基、提高機(jī)體抗氧化能力,是許多藥物防治慢性疾病的重要機(jī)理1。作為我國防治心腦血管病的傳統(tǒng)藥物,丹參Salvia m iltiorrhiza Bunge 具有祛淤止痛

8、、活血通經(jīng)、清心除煩的功效,對冠心病、高血壓病、糖尿病腎病及癌癥等療效確切2。近20多年來的研究表明35,丹酚酸是丹參活血化淤作用的主要功能成分。丹酚酸對多種原因產(chǎn)生的氧自由基、羥自由基等表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除作用,可能是丹參具有多種藥理作用的機(jī)理之一。丹酚酸的種類多,在丹參中的組成和含量不同。其中,丹酚酸B (salvianolicacid B,Sal B,圖1含量最多,功效顯著5。2005版中國藥典已將其列為丹參及丹參中成藥的藥效指標(biāo)成分2。由于Sal B 結(jié)構(gòu)中含有鄰苯二羥基,性質(zhì)較不穩(wěn)定。在水溶液中鄰二酚羥基的電荷密度增大,易解離形成氧負(fù)離子,發(fā)生自動氧化生成有色醌類物質(zhì)6。同時由于處理條件

9、不同,Sal B的結(jié)構(gòu)也可能發(fā)生變化,從而影響其生物活性7。本文利用自由基反應(yīng)模型觀察丹酚酸B 對1,12二苯基222苦肼基自由基(1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl,DPPH 自由基的淬滅效應(yīng),并結(jié)合高效液相色譜(HP LC 技術(shù)分別研究溫度和pH 值對丹酚酸B 清除DPPH 能力的影響。以探討Sal B 抗氧化能力的另一作用途徑及其影響因素。為以丹酚酸B 為功效指標(biāo)的新藥創(chuàng)制及藥效機(jī)理研究提供依據(jù)。1材料與方法1.1儀器及色譜條件島津LC 210A 高效液相色譜儀;BACK 2MAN DU600紫外2可見分光光度計;北京長風(fēng)8002型電熱恒溫水箱;LDZ5

10、22低速自動平衡離心機(jī);上海亞榮生化儀器廠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE 252AA 。圖1丹酚酸B 的結(jié)構(gòu)(分子量718A llti m a C 18(150mm ×4.6mm,5m 色譜柱,流動相為水(0.5%冰醋酸(A 2乙腈(B (7525,v /v ,流速1.0m l/m in,柱溫為室溫,檢測波長290n m,進(jìn)樣量20l 。1.2材料及試劑丹參由四川中江丹參基地提供;丹酚酸B 對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號1115622200403,二苯代苦味酰肼自由基(DPPH 、抗壞血酸(A s A 購自Sig ma 公司;二丁基羥基甲苯(BHT 購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司(化學(xué)純;大孔吸

11、附樹脂D101;乙腈購自漢邦公司,為色譜純;實驗用水為超純水(18.2M,其余試劑為分析純。1.3Sal B 的提取和純化Sal B 的純化方法在參照文獻(xiàn)8的基礎(chǔ)上進(jìn)行。將丹參切片100g,加8倍量水于90水浴加熱條件下提取兩次,1h /次,合并提取液,高速離心,上清液減壓濃縮,定容至100m l 。醋酸乙酯萃取兩次,合并萃取液減壓蒸干,用適量水溶解后,以4m l/m in 的流速上D101大孔吸附樹脂柱,靜止吸附2h 。分別用水和20%乙醇洗除去上樣液中未吸附成分后,用50%乙醇洗脫,洗脫液減壓濃縮除去乙醇,冷凍干燥得Sal B 。1.4DPPH 自由基清除法測定方法基本參照文獻(xiàn)9的方法操6

12、042時珍國醫(yī)國藥2006年第17卷第12期L I SH I ZHEN MED I C I N E AND MATER I A MED I CA RESEARCH 2006VOL.17NO.12作,稍作修改。反應(yīng)體積為3m l,加入0.5m l 不同濃度的樣品于6×1025mol/L 的DPPH 乙醇溶液中,用力搖勻,室溫下測定DP 2PH 反應(yīng)液在517n m 處的吸光度。樣品對DPPH 的清除率(%=(A 0-A 樣/A 0×100。以無水乙醇做空白對照,A 0為DPPH 對照在時間t =0時的吸光值,A 樣為加有樣品的DPPH t=30m in 時的吸光值。每次測定重

13、復(fù)3次。BHT,A s A 分別以無水乙醇配制成不同濃度的溶液,同法測定BHT,A s A 作對照比較。1.5供試樣品的配制將Sal B 配制成20mg/m l 的水溶液。所得Sal B 水溶液分別置于60,80,90水浴中加熱120m in,取出后迅速以冰水浴冷卻,混勻。另將1份Sal B 水溶液以醋酸調(diào)pH3,置于90水浴中加熱120m in 。每次測定均設(shè)3 份平行樣。1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備用HP LC 測定Sal B 標(biāo)準(zhǔn)溶液。以濃度和對應(yīng)的峰面積建立線性回歸方程為Y =14152X -1009.8(r =0.9999。標(biāo)樣濃度和對應(yīng)的峰面積在824mg/m l 范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。

14、精密度實驗RSD =0.65%;重復(fù)性實驗RSD =1.2%;加樣回收實驗的平均回收率為99.2%,RSD =2.8%。SalB 提取物中Sal B 含量由上述回歸方程計算而得。1. 7統(tǒng)計分析實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)用SPSS 統(tǒng)計軟件處理,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。方差分析比較用t 檢驗,P <0.05時為顯著性差異。2結(jié)果與討論2.1提取物中Sal B 含量的測定將Sal B 提取物配制成20mg/m l 的溶液,按設(shè)定的色譜條件,進(jìn)樣20m l,測得樣品液中Sal B的峰面積。按峰面積值用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算其含量(圖2。所得提取物中Sal B 的純度為90.5%。a 2對照品b 2

15、提取物1.丹酚酸B 圖2丹酚酸B 的HP LC 色譜圖2.2DPPH 濃度-吸光度響應(yīng)曲線DPPH 自由基清除模型是一種篩選自由基清除劑的簡便快速的分析法。DPPH 在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,由于其具有單電子而在517n m 處有一強(qiáng)吸收。正常情況下,DPPH 乙醇溶液呈深紫色。當(dāng)有自由基清除劑存在時,DPPH 的單電子被配對而使其吸收逐漸消失,其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系,因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析。DPPH +AH =A +DPPH 由圖3可知,在560mmol/L 范圍內(nèi)DPPH 濃度(X 與517n m 下的吸光度(Y 有良好線性關(guān)系,Y =0.0104X +0.0

16、051(r =0.9999。因此,當(dāng)抗氧化劑存在時,可通過測定DPPH 自由基和其反應(yīng)后吸光度減弱的程度,來反映試樣對自由基的清除情況,從而評價試樣的抗氧化能力。圖3DPPH 吸光度(517nm 與濃度的關(guān)系2.3Sal B 對DPPH 自由基的清除能力不同濃度的Sal B 提取物對DPPH 自由基均有顯著的清除作用,5g/m l 的Sal B 對DP 2PH 自由基的清除率為26.3%(表1。隨著濃度的增大,清除能力與濃度在一定范圍內(nèi)呈量2效關(guān)系。當(dāng)Sal B 濃度增加到一定程度(大于50g/m l ,其清除能力的增加速度漸緩。在濃度從5g/m l 到200g/m l 的范圍內(nèi),SalB 提

17、取物對DPPH 的清除能力均高于同濃度下人工抗氧化劑BHT 和A s A 。當(dāng)Sal B 提取物濃度在100g/m l 以上時,其清除能力與A s A 相接近。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看,Sal B 是一種縮酚酸類化合物,由兩分子咖啡酸與兩分子3,42二羥基苯基乳酸(即丹參素縮合而成。由于Sal B 含有多個游離酚羥基,因此具有很強(qiáng)的提供氫質(zhì)子的能力,使具有高度氧化性的自由基還原,終止自由基鏈鎖反應(yīng),從而達(dá)到清除自由基的目的。表1Sal B 提取物清除DPPH 自由基的能力%樣品DPPH 清除率5g m l 2120g m l 2150g m l 21100g m l 21200g m l 21Sal B

18、 提取物26.3±0.366.7±0.677.2±0.480.8±0.487.3±0.3A s A 13.2±0.558.1±0.969.5±0.278.3±0.186.3±0.3BHT 10.4±0.528.2±0.345.0±1.655.9±0.264.7±0.1表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,n =3圖4是利用Sal B 標(biāo)準(zhǔn)品(純度是99.3%配制成的溶液所做的清除DPPH 自由基研究結(jié)果。與上述Sal B 提取物(純度90.5%的

19、研究結(jié)果(66.7%有所不同,在相同濃度(20g /m l 時Sal B 對DPPH 的清除率為79.5%?？梢?Sal B 的純度越高,其清除能力越強(qiáng)。圖4也同時進(jìn)一步證明了上述隨著Sal B 濃度的升高,其清除能力增強(qiáng)的結(jié)論。圖4Sal B (純度99.3%濃度與DPPH 自由基清除率的關(guān)系2.4加熱溫度對Sal B 含量和DPPH 自由基清除作用的影響Sal B 提取物的水溶液在高于80溫度下加熱120m in 后,Sal B 的含量有不同程度的下降,所對應(yīng)的對DPPH 的清除率也有所降低(表2,尤其是在90下加熱,Sal B 的含量和清除能力均有較大幅度地下降(P <0.05。而

20、在80加熱120m in 后,雖然Sal B 含量有明顯下降(P <0.05,但其清除率只有輕微下降,分析原因可能是Sal B 在高溫下發(fā)生酯鍵水解,分解轉(zhuǎn)化為其他酚酸類成分6,7,這些酚酸也參與了對DPPH 自由基的清除,從而使總體抗氧化能力下降不明顯。上述結(jié)果表明:Sal B 對溫度和受熱時間敏感。溫度越高,Sal B 的含量和抗氧化能力下降越明顯。雖然Sal B 對熱不穩(wěn)定,但在90加熱120m in 后,其清除率仍有44.4%,顯示了SalB 的抗氧化潛力。表2不同加熱溫度對Sal B 含量和自由基清除能力的影響溫度T /加熱t(yī) /m in Sal B 含量C /mg m l 2

21、1DPPH 清除率(%018.1±0.166.7±0.66012017.9±0.466.4±0.88012014.8±0.465.4±0.99012010.8±0.244.4±2.0表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,n =62.5酸性條件下熱處理對Sal B 含量和DPPH 自由基清除作用的影響在pH 3的條件下,Sal B 水溶液對熱較為穩(wěn)定(表3。與表2相比較分析,未調(diào)pH 值的SalB 樣品溶液在90加熱120m in 后,Sal B 的含量由18.1mg/m l 下降到10.8mg/m l,對應(yīng)的抗氧化

22、活性也降為加熱前的66.6%。但在pH 3的環(huán)境下,同樣的加熱溫度和時間處理后,Sal B 含量的DPPH 自由基清除活性無明顯改變。說明酸性有利于Sal B 的熱穩(wěn)定性及其抗氧化活性的發(fā)揮。研究表明,pH 值對DPPH 分析體系的影響較大,在pH210范圍內(nèi)物質(zhì)的抗氧化活性隨pH 值的升高而降低9。本實7042L I S H I ZHEN MED I C I N E AND MATER I A MED I CA RESEARCH 2006VOL.17NO.12時珍國醫(yī)國藥2006年第17卷第12期驗中,pH 3時Sal B 的抗氧化能力在加熱前后都明顯高于未加酸時的Sal B 水溶液,分析原

23、因可能是反應(yīng)體系中用于調(diào)節(jié)pH 值的醋酸提供了氫質(zhì)子,參與了DPPH 的反應(yīng)體系,使Sal B 的表面清除能力可能增加,有待進(jìn)一步探討。表3酸性條件下熱處理對Sal B 含量和抗氧化活性的影響( s ±s 加熱t(yī) /m in Sal B 含量C /mg m l 21DPPH 清除率(%015.5±0.286.2±0.712014.4±0.487.5±0.1n =6;pH =3,加熱溫度為903結(jié)論本文實驗表明Sal B 具有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基的能力。在相同濃度下其清除能力均高于BHT 和A s A,顯示了其作為天然抗氧化劑的潛力,但Sa

24、l B 性質(zhì)較不穩(wěn)定,長時間的高溫對其含量和抗氧化能力有明顯的負(fù)面影響。酸性條件有利于丹酚酸B 的穩(wěn)定性和增加其抗氧化能力。已有實驗證實10,11Sal B 在其它不同的自由基生成系統(tǒng)中也有不同程度的抗氧化能力。本文通過Sal B 清除DPPH 有機(jī)自由基能力的變化考察了體外環(huán)境下溫度和pH 值對Sal B 抗氧化能力的影響,對Sal B 在體內(nèi)生理環(huán)境下的穩(wěn)定性以及對抗氧化作用的影響還有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn):1凌關(guān)庭.抗氧化食品與健康M .北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:2.2國家藥典委員會.中國藥典,部S .北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:52.3杜冠華,張均田.丹參現(xiàn)代研究概況與進(jìn)展(

25、續(xù)一J .醫(yī)藥導(dǎo)報,2004,23(6:355.4杜冠華,張均田.丹參水溶性有效成分-丹酚酸研究進(jìn)展J .基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2000,20(5:210.5彭宗根,陳鴻珊.紫草酸B 的藥理作用研究進(jìn)展J .中國藥學(xué)雜志,2003,38(10:744.6毛聲俊,侯世祥,唐昌炯,等.丹參素在加溫加速條件下的含量變化規(guī)律研究J .中國中藥雜志,2003,28(3:220.7張軍,王鳳云,詹麗玲,等.丹參藥材提取液中丹酚酸B 穩(wěn)定性影響因素的考察J .中國中藥雜志,2005,30(10:789.8王鳳美,陳軍輝,李磊,等.高純度丹酚酸B 的制備工藝研究J .時珍國醫(yī)國藥,2005,16(6:476.9許申

26、鴻,杭瑚.溶劑及pH 值對1,12二苯基222苦肼基自由基分析法的影響J .分析測試學(xué)報,2000,19(3:50.10D ing -You L i,L i -Na Xu,Xiao -Guang L iu .Effects of W ater -s olu 2ble Components Is olated fr om Salvia m ilti orrhiza on Oxygen Free Radi 2cal Generati on and L i p id Per oxidati on J .Journal of Chinese Phar ma 2ceutical Sciences .19

27、95,4(2:106.11Yokoza wa T,Chung HY,Dong E,Oura H.Confir mati on thatmagnesi 2um lithos per mate B has a hydr oxyl radicalscavenging acti onJ .Experi 2mental Toxicol ogy and Pathol ogy .1995,47:341.收稿日期:2006201211;修訂日期:2006206225基金項目:廣東省中醫(yī)藥管理局科研課題(No .2040020作者簡介:黃志海(19732,男(漢族,廣東梅縣人,現(xiàn)任廣東省中醫(yī)醫(yī)院副主任藥師,學(xué)士

28、學(xué)位,主要從事中藥藥劑工作.3通訊作者簡介:蔡宇(19722,男(滿族,遼寧沈陽人,現(xiàn)任暨南大學(xué)藥學(xué)院副教授,博士學(xué)位,主要從事中藥藥理工作.何首烏水煎液膜分離不同藥效部位對造血系統(tǒng)影響的研究黃志海1,蔡宇23,余紹蕾2(1.廣東省中醫(yī)醫(yī)院,廣東廣州510120;2.暨南大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州510632摘要:目的分離何首烏水提液的不同藥效部位,評價其對造血功能的影響。方法用陶瓷微濾膜分離何首烏水煎液藥效部位,取膜分離所得上清液作受試液A,何首烏水煎液(受試液B 作陽性對照;采用環(huán)磷酰胺誘發(fā)造血功能障礙動物模型,將動物分為6組,即空白對照組、模型對照組、受試液A 高(250mg/kg 、中(12

29、5mg/kg 、低(65mg/kg 劑量組和受試液B (125mg/kg 組,從外周血象變化、紅系祖細(xì)胞(BF U -E 和粒單細(xì)胞集落形成細(xì)胞(CF U -G M 角度評價其對造血功能的影響。結(jié)果何首烏水煎液和膜分離所得上清液對造血障礙動物外周血象、紅系祖細(xì)胞(BF U -E 均有不同程度的改善。結(jié)論何首烏膜分離所得上清液有改善動物造血功能障礙的作用,其改善造血功能的作用優(yōu)于水煎液。關(guān)鍵詞:何首烏;膜分離;造血中圖分類號:R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:100820805(20061222408202Study of D i fferen t Effecti ve Porti on o

30、f Ceram i c M em brane -separa ted W a ter -extract of R ad ix Po lygon i M u ltiflo ri and its Acti on on Hema topo i eti c SystemHUANG Z hi 2hai 1,CA I Y u 23,Y U S hao -lei 2(1.Guangdong Hospital of Trad itiona l ChineseM edicine,510120,China;2.College of Phar m acy,J inan U niver 2sity,Guangzhou

31、 510632,China Abstract O bjecti ve To separate different effective porti on fr om water -extract of Radix Polygoni M ultiflori and study its effect on he mat opoiesis .M ethods U se cera m ic me mbrane t o separate effective porti on fr om water -extract of Radix PolygoniM ultiflori .U se above clear liquid obtained by cera m ic me mbrane -separated as A and water -extract of Radix PolygoniM ultiflor i (B as a contr o