三聚氰胺誘發(fā)SD大鼠尿結石初步觀察

1、三聚氰胺誘發(fā)SD大鼠尿結石初步觀察                           作者：鄒移海,張薇,張鐘廣,符路娣,郭學軍             黃武當,伍軍軍 黃海定,陳劍波,謝玲玲,何國振,陳小霞,桑傳蘭【

2、摘要】  【目的】 觀察三聚氰胺連續(xù)給藥20d誘發(fā)SD大鼠尿結石的情況。【方法】 60日齡SPF級SD大鼠190只共分為6組，5組給藥組每組各34只，分別給予三聚氰胺2?5、2?0、1?5、1?0、0?5g/kg連續(xù)灌胃；空白對照組20只，每天灌胃10g/L甲基纖維素溶液。采用肉眼和體視顯微鏡觀察大鼠腎臟、輸尿管和膀胱形態(tài)改變，比較各組腎臟、膀胱的質(zhì)量和臟器指數(shù)，觀察大鼠血肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、鈣、磷、鎂的含量變化?！窘Y果】 給藥10d各組大鼠膀胱結石發(fā)生率為9%（4/47），給藥20d各組大鼠膀胱結石發(fā)生率為37%（11/30），輸尿管結石發(fā)生率為93%

3、（28/30）。給藥10d和20d各組大鼠腎臟均腫大呈灰黃色，腎內(nèi)均出現(xiàn)條索狀黃色沉淀物，部分腎臟有點狀或片狀出血灶。給藥20d各組腎內(nèi)黃色沉淀物開始融合成片狀或顆粒狀，并在皮質(zhì)和髓質(zhì)之間形成黃色弧形光環(huán)。給藥10d和20d各組腎臟質(zhì)量和臟器指數(shù)均顯著性升高，給藥20d血CREA、BUN、磷、鎂含量升高（?保埃保??！窘Y論】使用0?52?5g/kg三聚氰胺連續(xù)給藥20d，可誘發(fā)部分SD大鼠產(chǎn)生膀胱結石和輸尿管結石，腎臟出現(xiàn)黃色片狀或顆粒狀沉淀物。 【關鍵詞】  三聚氰胺/毒性；結石；疾病模型，動物；大鼠2008年9月，我國爆發(fā)三鹿牌嬰幼兒奶粉受污染事件，導致食用受污染奶粉的嬰幼兒產(chǎn)生

4、尿結石，其原因是奶粉中摻雜了三聚氰胺。據(jù)衛(wèi)生部通報，截至2008年11月27日8時，全國因三鹿牌嬰幼兒奶粉事件累計篩查嬰幼兒2 238萬余人次，泌尿系統(tǒng)出現(xiàn)異常的患兒共29萬余人，累計住院治療的共5萬余人，目前仍在住院的有800余人。本實驗采用三聚氰胺連續(xù)灌胃給藥方法，建立SD大鼠尿結石動物模型，初步觀察結果如下。1材料與方法    1?1動物60日齡SPF級SD大鼠190只，雌雄各半，體質(zhì)量（213±14）g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：粵監(jiān)證字2008A002。    1?2藥物三聚氰胺由河南駿化發(fā)展股份

5、有限公司生產(chǎn)，經(jīng)廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心食品實驗室檢測，證實送檢樣品為三聚氰胺,純度88%,檢測報告證書編號：4400/0805004。將三聚氰胺用蒸餾水配制成250g/L的濃度，并加入10g/L的甲基纖維素。每次給藥前將藥物攪拌均勻后吸取。配制10g/L甲基纖維素蒸餾水溶液供空白對照組使用。    1?3分組與造模按隨機區(qū)組法將大鼠分成6組,5個給藥組每組各34只，空白對照組20只，各組大鼠均為雌雄各半。給藥組分別按2?5、2?0、1?5、1?0、0?5g/kg劑量三聚氰胺連續(xù)灌胃，空白對照組每天灌胃10g/L 甲基纖維素溶液2mL/只。 

6、   1?4實驗環(huán)境與飲食動物實驗在廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心屏障環(huán)境動物實驗設施中進行（合格證號：粵監(jiān)證字2008C063），實驗期間動物自由采食和飲水。    1?5觀察指標每天觀察記錄大鼠的一般情況，如毛發(fā)、飲食、活動、精神狀態(tài)和死亡情況。在連續(xù)給藥第10天和第20天，給藥每組各取10只大鼠，第20天取空白對照組10只大鼠，乙醚麻醉后切開頸部血管放血，解剖觀察和取材，稱量腎臟和膀胱質(zhì)量，計算臟器指數(shù)。取雙腎做冠狀剖面，剖開膀胱，使用日本Olympus體視顯微鏡系統(tǒng)（型號：SZ61），對腎臟、輸尿管、膀胱進行觀察，拍攝照片直接在電腦中顯示和

7、儲存。給藥第20天各組大鼠禁食12h，乙醚麻醉后實施眼眶靜脈叢采血，檢測肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、鈣、磷、鎂含量。    1?6統(tǒng)計學方法采用SPSS10?0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。2結果    2?1大鼠死亡及一般情況170只給藥大鼠在第69天死亡61只（給藥2?5、2?0、1?5、1?0g/kg組分別死亡27、24、8、2只），給藥第10天取材47只（給藥2?5g/kg組只剩7只，2?0、1?5、1?0、0?5g/kg組各10只）后，剩余62只（給藥2?5、2?0g/kg組全部死亡）。給藥第1119天大鼠死

8、亡5只（給藥1?5g/kg組3只，0?5g/kg組 2只），第20天給藥1?5、1?0g、0?5g/kg組共取材30只，余下27只（給藥1?5、1?0、0?5g/kg組分別為3、12、12只）繼續(xù)給藥觀察。另外空白對照組大鼠20只，在實驗第20天取材10只，留10只作進一步觀察。給藥大鼠的癥狀表現(xiàn)為活動度差、進食少、毛松和豎毛，部分大鼠出現(xiàn)多尿和尿血，個別動物死亡前出現(xiàn)抽搐、單側(cè)或雙側(cè)后肢癱瘓。    2?2各組大鼠體質(zhì)量，左腎、右腎質(zhì)量及臟器指數(shù)比較6組共190只SPF級SD大鼠平均體質(zhì)量（213±14）g，各組體質(zhì)量比較無顯著性差異（P0?05）。表

9、1、表2結果表明，給藥10d及20d 的各組大鼠左腎和右腎質(zhì)量明顯增加，是空白對照組腎臟質(zhì)量的23倍，差異均有顯著性意義（P0?01），其中給藥10d 0?5g/kg組左腎和右腎質(zhì)量增加最為明顯，與給藥10d的2?5、2?0、1?5g/kg組比較，差異有非常顯著性意義（P0?01）。給藥20d的0?5g/kg組左腎和右腎質(zhì)量雖然也明顯增加,但與1?5、1?0g/kg組比較差異無顯著性意義（P0?05）。給藥10d及20d 的各組大鼠左腎和右腎臟器指數(shù)均高于空白對照組，差異具有非常顯著性意義（P0?01），結果與腎臟質(zhì)量增加的改變一致。給藥10d的0?5g/kg組左腎和右腎臟器指數(shù)的數(shù)值最高，與

10、給藥10d 1?5、1?0g/kg組比較，差異均有非常顯著性意義（P0?01），與給藥0?5g/kg組腎臟質(zhì)量改變的結果比較接近。給藥10d、20d相同組別左腎和右腎質(zhì)量及臟器指數(shù)的比較，只有左腎和右腎1?0g/kg組臟器指數(shù)的比較差異有顯著性意義（P0?01）。百事通    2?3各組大鼠膀胱質(zhì)量及臟器指數(shù)比較表3結果顯示，給藥10d的2?5、2?0、1?5、1?0、0?5g/kg組，給藥20d的1?5、1?0、0?5g/kg組膀胱質(zhì)量分別與空白對照組比較，差異均有非常顯著性意義（P0?01）。給藥10d 2?5、2?0、0?5g/kg組，給藥20d 1?5、1

11、?0、0?5g/kg組膀胱臟器指數(shù)分別與空白對照組比較，差異均有非常顯著性意義（P0?01）。給藥20d 1?5、1?0、0?5g/kg組膀胱臟器指數(shù)分別與給藥10d相同組別比較，差異均有非常顯著性意義（P0?01）。    2?4連續(xù)給藥20d大鼠CREA、BUN、UA、鈣、磷、鎂含量比較表4、表5結果顯示，連續(xù)給藥20d大鼠血清CREA、BUN、磷、鎂含量顯著升高，與空白對照組比較，差異有非常顯著性意義（P0?01）。1?0、0?5g/kg組的大鼠血清UA含量降低，與空白對照組比較，差異有非常顯著性意義（P0?01）。給藥1?5、1?0g/kg組大鼠的血清鈣含

12、量與空白對照組比較，差異有顯著性意義（P0?05或P0?01）。表1各組大鼠左腎質(zhì)量及臟器指數(shù)比較表2各組大鼠右腎質(zhì)量及臟器指數(shù)比較 表3各組大鼠膀胱質(zhì)量及臟器指數(shù)比較表4各組大鼠血清CREA、BUN、UA含量比較表5各組大鼠血清鈣、磷和鎂含量比較    2?5腎臟、輸尿管和膀胱體視顯微鏡觀察結果結果可見，空白對照組大鼠腎臟表面鮮紅色,腎皮質(zhì)剖面呈紅褐色,腎髓質(zhì)呈淺紅色,腎門處可見腎乳頭或腎盞、腎盂（圖1-a，c）。給藥后，各組大鼠腎臟明顯腫大，外觀呈灰黃色，我們稱之為“灰黃腎”，腎內(nèi)布滿淡黃色斑點（圖1-b）。給藥10d的2?5、2?0、1?5、1?0、0?5g

13、/kg組腎臟剖面于體視鏡下觀察，均出現(xiàn)沿髓放射狀排列的黃色條索狀沉淀物，沉積在髓質(zhì)及靠近髓質(zhì)的皮質(zhì)，部分腎皮、髓質(zhì)交界處有點狀或片狀充血出血灶（圖1-d,e,f,g,h）。給藥20d的1?5、1?0、0?5g/kg組腎臟剖面發(fā)現(xiàn)，黃色條索狀沉淀物明顯增多，分布在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)，部分沉淀物已聚集成片狀或顆粒狀，并在腎皮質(zhì)與髓質(zhì)之間積聚成黃色弧形光環(huán)，少數(shù)腎皮、髓質(zhì)交界處有點狀或片狀充血出血灶（圖1-i,j,k），腎乳頭和腎實質(zhì)內(nèi)形成黃色細小結石（圖1-l,m,n）?？瞻讓φ战M輸尿管壁呈粉紅色，腔內(nèi)無結石存在（圖2-a）。給藥20d的1?5、1?0、0?5g/kg組輸尿管均發(fā)現(xiàn)結石，其發(fā)生率為93%

14、（28/30，圖2-b，c，d），另外2例輸尿管出現(xiàn)黃色沉淀物?？瞻讓φ战M膀胱剖面見黏膜呈淡紅色，無結石存在（圖3-a）。給藥10d的2?5、2?0、1?5、1?0、0?5g/kg組膀胱結石發(fā)生率為9%（4/47），2?5、2?0g/kg組各占2例，結石單發(fā)或多發(fā)，呈黃白色結晶狀（圖3-b,c,d,e），膀胱出現(xiàn)黃色沉淀物幾率為53%（25/47），部分膀胱有充血表現(xiàn)。給藥20d的1?5、1?0、0?5g/kg組膀胱結石發(fā)生率為37%（11/30），其中1?5g/kg組2例（圖3-f），形成的結石顆粒較小，1?0g/kg組3例（圖3-g,h,i），0?5g/kg組6例（圖3-j,k,l,m,n

15、,o）；結石有白色和黃色兩種，其中最典型1例的結石數(shù)量多達數(shù)10粒，分別呈黃色和白色（圖3-j），膀胱發(fā)現(xiàn)黃色沉淀物的幾率是47%（14/30），部分膀胱有充血表現(xiàn)。（注：圖、彩圖見第頁）3討論尿結石是泌尿外科的常見多發(fā)病,進行尿結石防治的基礎研究離不開動物實驗和尿結石動物模型，尿結石動物模型的造模方法已有：草酸鈣結石法、磷酸鈣結石法、磷酸鎂結石法、尿酸結石法、胱氨酸結石法、對苯二甲酸結石法1，以及溶脲脲原體感染法2和植入異物法等。使用頻率最高的是草酸鈣結石模型3，該模型常以服用乙二醇和氯化胺誘發(fā)，使用的實驗動物多為大鼠。受三鹿牌嬰幼兒奶粉事件導致嬰幼兒發(fā)生尿結石的啟發(fā)，我們設計了本實驗，擬通

16、過研制三聚氰胺誘發(fā)大鼠尿結石，為防治上述嬰幼兒尿結石疾病提供動物模型。三聚氰胺（Melamine）是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，為純白色單斜棱晶體，無味，呈弱堿性，與鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺鹽。溶于熱水，微溶于冷水和熱乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等。三聚氰胺是一種用途廣泛的基本有機化工中間產(chǎn)品，最主要的用途是作為生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂的原料，廣泛運用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫(yī)藥等行業(yè)，常用于制造裝飾面板、涂料、防火材料、塑料制品、PVC管材和型材等。三聚氰胺甲醛樹酯與其他原料混配，還可以生產(chǎn)出織物整理劑、皮

17、革鞣潤劑、上光劑和抗水劑、橡膠粘合劑、助燃劑、高效水泥減水劑、鋼材淡化劑等4-5。動物長期服食三聚氰胺可以誘發(fā)泌尿系統(tǒng)腫瘤和結石，有報道在飼料中加入30g/L的三聚氰胺喂飼F344/DuCrj大鼠36周，膀胱癌或乳頭狀瘤的發(fā)生率高達55%、90%6。有研究者觀察了胸腺嘧啶和三聚氰胺對膀胱腫瘤發(fā)生率的影響，將3mg/L胸腺嘧啶和10g/L三聚氰胺加入飼料為1組，30g/L三聚氰胺加入飼料為另1組，喂飼6周齡的F344大鼠36周，再正常喂養(yǎng)4周，2組的膀胱結石發(fā)生率為70%和100%，膀胱癌發(fā)生率分別為5%和79%7，結果提示胸腺嘧啶有降低膀胱癌發(fā)生率的作用。三聚氰胺誘發(fā)的尿結石成分主要是三聚氰胺

18、和尿酸。三聚氰胺的毒性研究方面，目前認為三聚氰胺在機體內(nèi)不會發(fā)生任何類型的代謝變化，單胃動物以原體形式排出三聚氰胺，受害動物出現(xiàn)腎遠曲小管損傷并在遠曲小管或者集合管呈現(xiàn)條紋狀的特異性結晶，有報道在飼料中按照2?4g/kg添加三聚氰胺，連續(xù)30d飼喂貓，腎臟病檢可見，腎小管中出現(xiàn)晶體，腎臟可見淋巴細胞浸潤。三聚氰胺中毒的機制是腎衰，但腎衰與腎臟結晶之間的關系仍不清楚。1994年國際化學品安全規(guī)劃署和歐洲聯(lián)盟委員會合編的國際化學品安全手冊第卷指出，長期或反復大量攝入三聚氰胺可能對腎與膀胱產(chǎn)生影響，導致產(chǎn)生結石。三聚氰胺對不同動物種屬毒性具有選擇性，大鼠經(jīng)口半數(shù)致死量（LD50）為3?16g/kg8

19、。小鼠經(jīng)口給藥的全部不死最大劑量為5?00g/kg9。在參考上述文獻資料的前提下，我們開展了預實驗，將17只7080日齡SPF級SD大鼠平均體質(zhì)量(269 ±41)g隨機分為7g/kg、5g/kg、3g/kg、1?0g/kg三聚氰胺連續(xù)灌胃，三聚氰胺是河南駿化發(fā)展股份有限公司生產(chǎn)的工業(yè)原料。結果三聚氰胺7、5、3g/kg連續(xù)給藥的大鼠全部死亡（除3g/kg劑量組1只動物在第10天死亡外，各組動物均在給藥第27天死亡，且劑量越大死亡時間越短）。1?0g/kg組動物在連續(xù)給藥20d后仍然全部存活。據(jù)此我們將正式實驗的三聚氰胺連續(xù)給藥劑量下調(diào)到2?5g/kg0?5g/kg之間。預實驗各組大

20、鼠腎臟均明顯腫大、充血，腎臟剖面在體視顯微鏡下可見，腎臟布滿黃色條索狀沉淀物，沿髓放線呈放射狀排列。有2只大鼠發(fā)現(xiàn)黃色膀胱結石。將腎臟布滿黃色條索狀沉淀物的4個大鼠腎臟拍攝X線片，未見陽性結石陰影。預實驗為藥物配制和解剖鏡檢提供了依據(jù)。研制三聚氰胺尿結石動物模型應重點考慮給藥劑量、成模時間和藥物毒性等問題。正式實驗中，三聚氰胺按2?5、2?0g/kg連續(xù)給藥大鼠均在給藥后10d內(nèi)全部死亡，1?5g/kg連續(xù)給藥大鼠在10d內(nèi)死亡超過20%（7/34），提示1?5g/kg2?5g/kg各組動物給藥劑量太大，可能不適合造模。1?0g/kg給藥劑量動物在10d內(nèi)死亡2只，0?5g/kg在1020d死

21、亡2只。依據(jù)本實驗結果，1?0g/kg和0?5g/kg給藥劑量較適合造模。與大鼠經(jīng)口單次給藥LD50為3?16g/kg8的結果比較，連續(xù)給藥的毒性增加，導致動物死亡的劑量降低。結果表明，給藥10d大鼠膀胱結石發(fā)生率為9%，成模率較低；各劑量組大鼠腎臟均出現(xiàn)條索狀黃色沉淀物。連續(xù)給藥20d，1?5、1?0、0?5g/kg組大鼠膀胱結石發(fā)生率為37%，輸尿管結石發(fā)生率達到93%，成模率較高；腎臟內(nèi)黃色沉淀物融合成片狀或顆粒狀，個別已在腎乳頭和腎實質(zhì)形成細小結石，解剖腎臟時刀片有接觸到沙子的感覺，表明腎臟已經(jīng)開始形成結石雛形。因此造模20d以上可以導致動物出現(xiàn)尿結石。本研究通過對腎臟和膀胱的大體解剖

22、和體視顯微鏡觀察，比較臟器質(zhì)量和臟器指數(shù)，檢測血生化指標，觀察三聚氰胺連續(xù)給藥產(chǎn)生的毒性。結果表明，給藥動物腎臟明顯腫大，顏色變灰黃色，左、右腎臟質(zhì)量和臟器指數(shù)均是正常腎臟的23倍，膀胱質(zhì)量和臟器指數(shù)也比正常動物高。體視鏡下觀察，部分動物腎皮、髓質(zhì)交界處出現(xiàn)點狀或片狀充血出血灶。連續(xù)給藥1?5、1?0、0?5g/kg三聚氰胺20d，大鼠血CREA、BUN含量均高于空白對照組，說明三聚氰胺已使大鼠腎臟出現(xiàn)一定程度的損害，結合體視顯微鏡所見的尿結石情況，推測腎臟受損原因可能與三聚氰胺在腎臟的沉積及尿結石導致尿路堵塞等因素有關。結果提示三聚氰胺連續(xù)給藥對腎臟存在一定的毒性,故應考慮使用小于0?5g/kg劑量造模，以降低三聚氰胺的毒性。急性腎功能衰竭可出現(xiàn)血鈣、磷、鎂數(shù)值改變，本研究結果鈣、磷、鎂均升高，可能與腎小球排泄功能下降有關。三聚氰胺1?0、0?5g/kg連續(xù)給藥組的尿酸含量低于空白對照組，其原因有待進一步觀察。由于三聚氰胺溶于甲醛，預實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)甲醛固定后，腎臟內(nèi)的黃色沉淀物似有溶解現(xiàn)象，故未能完成腎臟和膀胱的病理切片