5-3血紅蛋白的提取和分離教學(xué)設(shè)計

1、 5.3血紅蛋白的提取和分離教學(xué)目標知識與技能1嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理驟情感、態(tài)度與價值觀初步形成科學(xué)的思維方式戟層斛沖云誹# 人乂清紳教學(xué)難點：樣品的預(yù)處理教學(xué)時數(shù)：2課時教學(xué)過程：教學(xué) 內(nèi)容教師活動學(xué)生活動教學(xué)意圖導(dǎo)入蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔(dān)者是細胞內(nèi)含量最咼的有機化和物。對蛋白質(zhì)的研究有助于 人們對生命過程的認識和理解。所以需要從細 胞中提取蛋白質(zhì)進行研究。怎樣提取蛋白質(zhì)呢傾聽、回顧回顧舊知 識凝膠 色譜法(分 配色譜法)蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和上少、溶解度、吸附件質(zhì)、親和力等T嗟萬別.山此捉取和分離各種蛋口質(zhì)。

2、(1) 原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量 小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。(2) 凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。(3) 分離過程：混合物上柱T洗脫T大分子流動快、小分子流動慢T收集大分子T收集小分子*洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。1.2緩沖溶液(1)原理：由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成(如H2CQNaHCO NaH2PO4/N&HPQ等)，調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不冋PH的緩沖液。(2)緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。1.3凝膠電泳法：(1) 原理：不同蛋白質(zhì)的帶電

3、性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作 用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。(2) 分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經(jīng)膠電泳等。(3) 分離過程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的SDS形成“蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。實驗2.1蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟？樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。思考：是否所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的？為什么？ 不是。因為蛋白質(zhì)的來源和性質(zhì)不同，分離方法差別很大。2.2選擇實驗材料（1）你認為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？

4、為什么？ 哺乳動物血液。因為該細胞中沒有細胞核，血紅蛋白含量高。（2） 請閱讀教材，認識哺乳動物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。 并思考回答下列問題： 血液由_和_兩部分組成。血細胞中 _ 細胞數(shù)量最多，細胞的含量最高的化合。2.3從紅細胞中分離出血紅蛋白的過程為：洗滌紅細胞、釋放血紅蛋白、分離血紅 蛋白、透析。洗滌紅細胞的目的是什么？除去血漿蛋白的雜蛋白，有利于后續(xù)步驟的分離純化。紅細胞的洗滌過程為：血液+檸檬酸鈉T低速短時離心T吸出上層血漿T紅細胞+5倍體積生理鹽水 -緩慢攪拌10minT低速短時離心T吸出上清液T反復(fù)洗滌直至上清液無黃色思考：加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要

5、緩慢攪拌？防止血液凝固；防止白細胞沉淀；防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。思考：你有什么方法將紅細胞中的血紅蛋白釋放出來？加入蒸餾水，用玻璃棒快速攪拌一段時間。補充：加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。 此時，紅細胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白，而且還含有細胞破碎物、脂質(zhì)、甲苯有機溶劑等。怎樣除去這些雜質(zhì)呢？由于它們的密度不同，科學(xué)家采取了離心分離的方法： 紅細胞破碎混合液T中速長時離心（2000c/minx10min）T濾紙過濾除去脂質(zhì)T分液漏斗分離出血紅蛋白2.4如何除無機鹽離子和小分子有機物質(zhì)呢？。透析。半透膜的選擇透過性，大分

6、子物質(zhì)不能通過半透膜，離子和小分子能夠通過半透膜。在透析過程中，血紅蛋白溶液中離子和小分子不斷通過半透膜擴散進入到pH=7的磷酸緩沖液中。思考：為何使用pH=7的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠多于血紅蛋白溶液量？ 維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴散?？偨Y(jié)：通過以上四個基本過程， 紅細胞中的血紅蛋白就被提取出來。但其中還含有其他種類的蛋白質(zhì)分子（如呼吸酶等）。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開來呢？我們來研究蛋白質(zhì)提取和分離的第二個步驟一一粗分離（凝膠色譜操作）。2.5凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括：制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。 根據(jù)教材圖5-19,說出制作色譜柱需要的材料。橡皮塞

7、2個、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。 色譜柱的制作過程：準備材料T加工橡皮塞T安裝色譜柱下面進行第二步- 凝膠色譜柱的裝填。請閱讀教材:色譜柱的裝填過程。步驟操作要求操作要求色譜柱垂直固定在支架上計算稱量凝膠根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量配制懸浮液凝膠顆粒+蒸餾水T充分溶脹凝膠顆粒+洗脫液T沸水浴裝填懸浮液一次性緩慢倒入；輕輕敲打緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h樣品加入和洗脫。其基本過程是：調(diào)節(jié)緩沖液面T加入蛋白質(zhì)樣品T調(diào)節(jié)緩沖液面T洗脫T收集分裝蛋白質(zhì) 至此，血紅蛋白即可得到粗分離。在整個操作過程中，應(yīng)當(dāng)注意以下事項：(1) 紅細胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少；

8、低速、短時離心。(2)凝膠的預(yù)處理： 沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡(3) 色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。(4) 色譜柱成功標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。略 作業(yè)：見優(yōu)化 板書設(shè)計:課后反思:凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝 膠實際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部 有許多貫穿的通道，當(dāng)一個含有各種分子小結(jié)的樣品溶液緩慢流經(jīng)時，各分子在色譜柱內(nèi)進行 兩種不同的運動，即垂直向下的運動和無規(guī)則的擴散運動，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分 子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對 分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。 因此，樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)