大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的誘變和篩選鑒定

1、大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的誘變和篩選鑒定關(guān)于菌株的幾個(gè)概念 ：野生型菌株 ：從自然界分離到的微生物在其發(fā)生突變前的原始狀態(tài)。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 ：野生型菌株經(jīng)過(guò)人工誘變或自然突變失去合成某種營(yíng)養(yǎng) 的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充所缺乏的營(yíng)養(yǎng)因子才能生長(zhǎng)。原養(yǎng)型 ：營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株， 其營(yíng)養(yǎng)要 求在表型上和野生型相同關(guān)于培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基 ( minimal medium，MM)：僅能滿足微生物 野生型 菌株生 長(zhǎng)需要的培養(yǎng)基，用 來(lái)表示。完全培養(yǎng)基 (complete medium ，CM)：凡可滿足 一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌 株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基。用 來(lái)表示。補(bǔ)充培養(yǎng)基 (

2、 supplemental medium ，SM)：凡只能滿足 相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng) 缺陷型生長(zhǎng)需要的組全培養(yǎng)基， 它是在基本培養(yǎng)基中加入該菌株不能 合成的營(yíng)養(yǎng)因子而組成。摘要：本實(shí)驗(yàn)選用 紫外線 為誘變劑，來(lái)誘發(fā)大腸桿菌突變，并用 青霉 素法 淘汰野生型，逐個(gè)測(cè)定法檢出缺陷型，獲得 100#大腸桿菌菌株， 最后經(jīng)生長(zhǎng)譜法鑒定出該菌株為 xxx 缺陷型。關(guān)鍵詞 ：大腸桿菌 紫外線 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 青霉素 逐個(gè)測(cè)定法 生長(zhǎng)譜法一、目的1、了解營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株選育的原理。2、學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘變、篩選與鑒定方法。二、原理篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株一般具有四個(gè)環(huán)節(jié)： 誘變處理、 營(yíng)養(yǎng)缺陷性 的濃縮、檢出、

3、鑒定缺陷型。本實(shí)驗(yàn)選用 紫外線為誘變劑，來(lái)誘發(fā)突變， 并用青霉素法 淘汰野 生型，逐個(gè)測(cè)定法 檢出缺陷型， 最后經(jīng)生長(zhǎng)譜法 鑒定細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷 型。三、器材離心機(jī)，紫外線照射箱， 冰箱，恒溫箱，高壓滅菌鍋； 三角燒瓶， 試管，離心管，移液管，培養(yǎng)皿，接種針?biāo)摹⒉牧希ㄒ唬┚N E.coli（二）培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)液（Luria-Bertani 培養(yǎng)基,這 個(gè)名字來(lái)源于英語(yǔ) 的1lysogeny broth，即溶菌肉湯。 基，用于培養(yǎng)大腸桿菌等細(xì)菌， 的固態(tài)培養(yǎng)基。加入抗生素的 菌為宿主的克隆。 ）：酵母膏，是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的培養(yǎng) 分為液態(tài)培養(yǎng)基和加入瓊脂制成 LB 培養(yǎng)基可用于篩選以大腸桿

4、 0.5g；蛋白胨， 1g；NaCl ，0.5g；水， 100ml，pH7.2 121滅菌 15min2 2× LB 培養(yǎng)液：其它不變，水， 50ml。3 基本培養(yǎng)基： 葡萄糖 0.5 g，（NH4） 2SO4 0.1 g，檸檬酸鈉 0.1 g， MgSO4·7H2O 0.02 g，K 2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水 100 mL，pH 7.2，110滅菌 20 min。 配固體培養(yǎng)基時(shí)需加 2%洗 滌處理過(guò)的瓊脂。全部藥品需用分析純，使用的器皿 需用蒸餾 水或重蒸水沖洗 23 次。4 無(wú)N 基本液體培養(yǎng)基：K2HPO4,0.7g ； KH 2PO

5、4,0.3g; 檸 檬 酸 鈉 3H2O,0.5g ； MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖 2g；水 100ml，pH7.0 110滅菌 20min5 2N 基本培養(yǎng)基：K 2HPO4,0.7g；KH 2PO4,0.3g; 檸檬酸鈉 3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖 2g；水 100ml，pH7.0 110滅菌 20min6 完全培養(yǎng)基同 LB 培養(yǎng)基，配置固體培養(yǎng)基，需加 2%的瓊脂。7 混合氨基酸和混合維生素五、步驟1 菌懸液制備1) 取 E.coli K12 一環(huán)加入到 10ml LB 培養(yǎng)液中在 37下過(guò)夜培 養(yǎng)；2)

6、 取 0.3l 菌液轉(zhuǎn)接到 10ml LB 培養(yǎng)液中，在37搖床上振蕩培 養(yǎng) 4 6 小時(shí)，使細(xì)胞 處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；3) 取適量菌液加入到 5ml 離心管中， 7000rpm離心 3到 4 min，離 心 2 次，棄上清液， 打勻沉淀，各加入 4ml 無(wú)菌生理鹽水，充分振 蕩混勻。2 誘變處理1）取 3ml 菌懸液，加入到 7cm 小皿內(nèi)，輕輕震蕩使其均勻在皿 底形成一薄層。平放在 滅菌的超凈工作臺(tái)上，蓋蓋滅菌 1min ，然后 打開(kāi)皿蓋照射 2min（15W） 。2）誘變后處理取 3ml 誘變后菌液加入到離心管中， 7000rpm 離心 3 到 4 分鐘， 棄上清，加入 4ml 生理鹽水離心

7、洗滌 2 次，重懸于 3ml 生理鹽水中， 取 0.2 l 加入到 5ml 2LB 基本培養(yǎng)基內(nèi) ,37培養(yǎng)過(guò)夜（ 后培養(yǎng) ）。3 檢出缺陷性菌株1）初篩：從培養(yǎng) 12、16、24h 的菌液中，各自取 100l，分別 在 LB 完全培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基 上涂布 2 個(gè)平板，做好標(biāo)記，在 37 下培養(yǎng) 36h。2）復(fù)篩：簽挑取完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落 200 個(gè)，分別點(diǎn)種在 基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上， 37過(guò)夜培養(yǎng)。4 復(fù)證 挑取 LB 完全培養(yǎng)基上有而基本培養(yǎng)基上沒(méi)有的菌落， 在基本培養(yǎng)基上劃線復(fù)證， 并在完全培養(yǎng)基上保留備份， 37過(guò)夜培 養(yǎng)。24 小時(shí)后仍不長(zhǎng)的為缺陷型。5 生長(zhǎng)譜鑒定1） 營(yíng)

8、養(yǎng)缺陷型濃縮（淘汰野生型）3th day，延遲處理：吸菌液 5ml 于離心管中，3500rpm 離心 10min， 棄上清。離心洗滌兩次（加生理鹽水至原體積，打勻沉淀，離心，棄 上清，重復(fù)一次），最后加生理鹽水制成 5ml 菌懸液。取 0.1ml 菌液于 5ml 無(wú) N 培養(yǎng)基中， 37培養(yǎng) 12h。（ 消耗體內(nèi)的 N 素，使停止生長(zhǎng)，避免缺陷型被以后加入的青霉素殺死 ）4th day，按 1:1 比例加入 2N 基本培養(yǎng)液 5ml，加 5 萬(wàn) U/ml 青霉 素鈉鹽溶液 100ul，使青霉素在溶液中的最終濃度約為 500U/ml ，再 放入 37培養(yǎng)。（野生型利用氮大量生長(zhǎng)，細(xì)胞壁不能完整合

9、成而死 亡，缺陷型因不長(zhǎng)避免被殺死 ）。5th day，從培養(yǎng) 12、14、16、24 小時(shí)（根據(jù)實(shí)際情況，選擇 2-3 個(gè)時(shí)間段） 的菌液中分別取 0.1ml 菌液到基本及完全培養(yǎng)基兩個(gè)培養(yǎng) 皿中，涂布， 37培養(yǎng)。2） 營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢出7th day，檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型。上述平板培養(yǎng) 3648h 后，進(jìn)行菌 落計(jì)數(shù)。 選取完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)的菌落數(shù)大大超過(guò)基本培養(yǎng)基的那一 組，用滅菌牙簽挑取完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的 菌落 100 個(gè)分別點(diǎn)種于基 本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上（先基本，后完全） ， 37培養(yǎng)。9th day，選在基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng)，完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落在 基本培養(yǎng)基上劃線， 37培養(yǎng) 24h，仍不

10、長(zhǎng)的是營(yíng)養(yǎng)缺陷型。3）營(yíng)養(yǎng)缺陷型鑒定 在同一平皿上測(cè)定一種缺陷型菌株對(duì)許多種生長(zhǎng)因子的需求情況為 生長(zhǎng)譜法 。單一生長(zhǎng)因子： 鑒定氨基酸或維生素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型， 較為簡(jiǎn)便的方法 是分組測(cè)定法。 將21種氨基酸，組合 6組，每6種不同氨基酸歸為 一組。如果以 15 種維生素進(jìn)行測(cè)定，則把 5 種維生素歸為一組，共5 個(gè)組合組別 氨基酸組合組1賴氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸異亮氨酸2纈氨酸精氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸組氨酸3蘇氨酸蛋氨酸苯丙氨酸谷氨酸脯氨酸天冬氨酸4丙氨酸胱氨酸酪氨酸谷氨酸甘氨酸絲氨酸5鳥(niǎo)氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸谷氨酰胺6胍氨酸異亮氨酸組氨酸天冬氨酸絲氨酸谷氨酰胺1維生素 A維生素

11、 B1 維生素 B2 維生素 B6 維生素 B122維生素 C維生素 B1 維生素 D2維生素 E煙酰胺3葉酸維生素 B2 維生素 D2膽堿泛酸鈣4對(duì)氨基苯甲酸維生素 B6 維生素 E膽堿肌醇5生物素維生素 B12 煙酰胺泛酸鈣肌醇維生素組合組組別10th day，生長(zhǎng)譜的測(cè)定：將檢出的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌落接種于5mlLB 液試管中， 37培養(yǎng) 14 16h。11th day，培養(yǎng) 16h的菌液離心。 3500rpm，10min，棄上清，加 生理鹽水，打勻沉淀，再次離心。加 5ml 生理鹽水制成菌懸液。取其 1ml 于培養(yǎng)皿中，加入融化后冷卻到 40 50的基本培養(yǎng)基，混勻，平放，共二皿。（平板表面

12、分別沾上沾有混合氨基酸 （或酪素水解液 ） 的濾紙片， 30培養(yǎng) 24h，經(jīng)培養(yǎng)后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)周圍有生長(zhǎng)圈，即表明 為氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株） 。將皿底分成分格用接種環(huán)依次放入少 許混合氨基酸等， 37培養(yǎng) 24h，觀察生長(zhǎng)情況，確定是哪種氨基酸 營(yíng)養(yǎng)缺陷型。生長(zhǎng)譜鑒定點(diǎn)樣圖示右圖中 1、 2、3、4、5 均為氨基酸 組合六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1、營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢出點(diǎn)植對(duì)照時(shí)每平皿點(diǎn) 30 株菌，最后在基本培養(yǎng)基上沒(méi)有長(zhǎng)出的菌 株，而在是完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落的，即為篩選出的營(yíng)養(yǎng)缺陷型 菌株。2、營(yíng)養(yǎng)缺陷型鑒定通過(guò)如圖 1 生長(zhǎng)譜鑒定，得到如圖 2結(jié)果：生長(zhǎng)譜鑒定結(jié)果圖圖2分析：如圖中， 1,2,3,4,5

13、任意區(qū)域有生長(zhǎng)圈生成即對(duì)應(yīng)為相應(yīng)氨基酸 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。七、結(jié)論與討論結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)選用紫外線為誘變劑，來(lái)誘發(fā)大腸桿菌突變，并用 青霉素法淘汰野生型， 逐個(gè)測(cè)定法檢出缺陷型， 獲得 100# 大腸桿菌菌株，最后經(jīng)生長(zhǎng)譜法鑒定出該菌株為 XXX 缺 陷型。討論： 1、注意事項(xiàng)：紫外線對(duì)皮膚和眼睛有很大傷害，實(shí)驗(yàn)中 應(yīng)避免人體暴露在紫外線中。各種器具、培養(yǎng)基及需 加入培養(yǎng)基中的試劑均需滅菌。2、本實(shí)驗(yàn)中的突變型是氨基酸缺陷型， 我們是可以檢測(cè)的，如果是與 N 元素代謝有關(guān)的其他缺陷型， 我們無(wú)法通過(guò) 這個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。3、本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)紫外線照射后，誘變率較低，可能是因?yàn)?照射時(shí)間短，誘變劑量小，或者是黑暗

14、培養(yǎng)不完善導(dǎo) 致光復(fù)活作用，可將誘變后的菌體進(jìn)行 后培養(yǎng) 。八 . 注意事項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要嚴(yán)格控制無(wú)菌，在菌落的選取、劃線培養(yǎng)、菌懸 液的吸取、接種等環(huán)節(jié) 都要進(jìn)行嚴(yán)格的 無(wú)菌操作 ，任何一部的雜菌 污染都會(huì)對(duì)最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成嚴(yán)重影響。在用牙簽篩選點(diǎn)種的時(shí)候要注意牙簽 不能將培養(yǎng)基戳破 ，這樣不 利于菌落的生長(zhǎng)，也 不利于觀察，另外還要注意點(diǎn)樣的順序是 先基 本培養(yǎng)基后完全培養(yǎng)基 。在基本培養(yǎng)基上的點(diǎn)接量一定要少， 以防止 細(xì)胞過(guò)多及細(xì)胞老化而導(dǎo)致自溶現(xiàn)象的發(fā)生， 從而引起缺陷型突變體 也可以在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的現(xiàn)象。在傾注平板時(shí)培養(yǎng)皿必須在使用之前嚴(yán)格的無(wú)菌， 培養(yǎng)基的溫度 要嚴(yán)格控制 ，否則容 易燙死加入的細(xì)菌或者由于凝固而使混勻失敗。在最后一步鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型時(shí)要注意氨基酸的點(diǎn)樣不能過(guò)多， 要 用牙簽蘸取氨基酸后 輕輕抖動(dòng)即可。如果點(diǎn)樣過(guò)多會(huì)造成 氨基酸在 培養(yǎng)基中的擴(kuò)散 ，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。拓展討論 傾注培養(yǎng)法進(jìn)行生長(zhǎng)譜的鑒定有其優(yōu)點(diǎn) 。由于氨基酸 沒(méi)有經(jīng)過(guò)滅菌處理，而且在氨基酸點(diǎn)樣過(guò)程中很容易發(fā)生受雜菌污 染，這樣就很有可能導(dǎo)致培養(yǎng)基的表面有雜菌菌落產(chǎn)生。 比如這時(shí)候 采用涂布法，那