基于生物信息學(xué)與生物技術(shù)開發(fā)植物分子標(biāo)記的研究進(jìn)展

1、分子植物育種，2009年，第7卷，第1期，第130136頁Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.1, 130136專題介紹Review基于生物信息學(xué)與生物技術(shù)開發(fā)植物分子標(biāo)記的研究進(jìn)展張征鋒1肖本澤2*1華中師范大學(xué)遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實驗室, 武漢, 430079; 2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 武漢, 430070*通訊作者, benzexiao摘要各種序列數(shù)據(jù)庫的迅猛增長與生物信息軟件的不斷開發(fā)使基于序列資源的標(biāo)記開發(fā)更加便捷，各類分子生物學(xué)技術(shù)的涌現(xiàn)及高通量檢測平臺的建設(shè)為實驗室開發(fā)分子標(biāo)記提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。本文從生物

2、信息學(xué)角度概述了SNP 、SSR 等分子標(biāo)記開發(fā)的方法、特點(diǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀，并介紹了利用分子生物技術(shù)開發(fā)SSR 、SRAP 、TRAP 標(biāo)記的手段及從RAPD 、AFLP 等標(biāo)記向單位點(diǎn)特異性PCR 標(biāo)記(如SCAR 、CAPS 、dCAPS 等 轉(zhuǎn)化的進(jìn)展。最后，對不同植物標(biāo)記開發(fā)策略的選擇及以上各種技術(shù)在功能標(biāo)記開發(fā)中的應(yīng)用前景作了展望。關(guān)鍵詞標(biāo)記開發(fā), 生物信息學(xué), 生物技術(shù), 功能標(biāo)記The Progress of Development for Plant Molecular Markers Based on Bioin-formatics and BiotechnologyZhang

3、Zhengfeng 1Xiao Benze 2*1Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, Central China Normal University, Wuhan, 430079; 2College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070*Corresponding author, benzexiaoAbstract The genome sequencing and exp

4、ressed sequenced tag (ESTprojects generated a vast amount of se-quences data. Simultaneously, the increasing bioinformatics software facilitates the development of molecular mark-ers. Additionally, to develop molecular markers in laboratory will benefit from the advanced biotechnology and con-struct

5、ion of batch of operation systems. The methods, characteristics and corresponding application of developing SNP and SSR based on bioinformatics and developing SSR, STAP, TRAP on biotechnology were reviewed. The progress of conversion of RAPD and AFLP to single-locus specific PCR markers were also pr

6、esented. Finally, how to select suitable technique for different plants and develop functional markers are elucidated. Keywords Marker-developing, Bioinformatics, Biotechnology, Functional marker基金項目：本項目由國家自然科學(xué)基金(30800680資助分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種新的遺傳標(biāo)記形式。自從1980年Botstein 等首次提出用RFLP 作為遺傳標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖

7、圖譜以來，分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用研究日新月異，相繼出現(xiàn)了二十多種DNA 分子標(biāo)記方法，構(gòu)成了分別以RFLP 、SSR 及SNP 為代表的三代分子標(biāo)記。按其技術(shù)原理，可分為三大類：第一類是以分子雜交為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，主要是RFLP 。第二類是以PCR 反應(yīng)為基礎(chǔ)的一系列分子標(biāo)記技術(shù)，如RAPD 、SCAR 、STS 和SSR 等。第三類是以酶切和PCR 為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，主要有AFLP 和CAPS 等(表1 。近20年來分子標(biāo)記對植物遺傳和育種研究的發(fā)展起到了革命性的作用，其應(yīng)用涉及到重要性狀基因或QTL 的定位、遺傳圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)資源遺傳關(guān)系的確定、雜種優(yōu)勢群的劃分、比較圖譜分析、分子標(biāo)記

8、輔助選擇及圖位克隆等多個領(lǐng)域。本文重點(diǎn)介紹利用生物信息學(xué)及分子生物學(xué)手段開發(fā)分子標(biāo)記的研究進(jìn)展。1利用數(shù)據(jù)庫序列信息和生物信息學(xué)手段開發(fā)新的分子標(biāo)記隨著表達(dá)序列標(biāo)簽EST 計劃的實施及水稻等模式作物中基因及全長cDNA 的克隆，大量的DNA 序列信息被儲存在公共數(shù)據(jù)庫。另外擬南芥、水稻等基因組測序工作的完成及其它一些重要生物基因組測序工作的相繼開展(Meinkeet al., 1998; Goff et al., 2002; Yu et al., 2002; Timmermans et al., 2004 ，為利用生物信息學(xué)手段開發(fā)分子標(biāo)記提供了大量有益的信息。通過利用計算機(jī)程序，可以從Gen

9、Bank 等數(shù)據(jù)庫中將這些序列下載并識別出其中的SSR 、SNP 等潛在的多態(tài)性位點(diǎn)。1.1SNP 的生物信息學(xué)開發(fā)SNP 是指基因組內(nèi)DNA 中某一特定核苷酸位置上存在轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失等變化(Lander,1996 。在遺傳學(xué)分析中，SNP 作為一種遺傳標(biāo)記得以廣泛應(yīng)用，主要源于這幾個特點(diǎn)：(1密度高；(2遺傳穩(wěn)定性高；(3易于實現(xiàn)分析的自動化。目前SNP 的檢測技術(shù)有多種，DNA 芯片由于具有高度集成化、并行化、多樣化、微型化等優(yōu)點(diǎn)而成為最理想的SNP 檢測技術(shù)(Ngand Liu, 2006 。生物信息學(xué)的SNP 挖掘方法主要是基于“冗余”數(shù)據(jù)庫。國際主要的核酸數(shù)據(jù)庫允許不同的機(jī)構(gòu)

10、在任意時間向數(shù)據(jù)庫中提交各種序列，由此造成某一特定區(qū)段的序列在數(shù)據(jù)庫中存在多個拷貝，它們可能來源于同一物種不同品系、同種材料不同組織發(fā)育時期等，之間存在多態(tài)性。為SNP 的開發(fā)提供了豐富的資源。目前應(yīng)用EST 數(shù)據(jù)庫已在人類(Garget al., 1999; Picoult-Newberg et al., 1999; Brumfield et al., 2003 ，擬南芥(Schmidet al., 2003 、玉米(Usecheet al., 2001; Batley et al., 2003 等許多生物中進(jìn)行SNP 的開發(fā)，在如內(nèi)含子區(qū)、3' 非翻譯區(qū)、BAC 末端序列等非編碼區(qū)

11、的序列是發(fā)掘SNP 的很好的資源而且其多態(tài)性的檢測頻率是編碼區(qū)的表1幾種常用標(biāo)記系統(tǒng)Table 1Some universal systems of molecular markers 標(biāo)記類型Types of markersSinge Nucleotide Polymorphism Coding SNP, non-coding SNPSimple Sequence Repeat, Microsatellite EST-SSRsRestriction Fragment Length Polymorphism Random Amplified Polymorphic DNA Amplified

12、Fragment Length Polymorphism Sequence Characterized Amplified Regions Cleaved Amplified Polymorphic SequenceDerived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence Inter-simple sequence repeatSequence-Related Amplified Polymorphism Target Region Amplified Polymorphism簡寫Abbreviations SNPcSNP, ncSNP SSR cSSR R

13、FLP RAPD AFLP SCAR CAPS dCAPS ISSR SRAP TRAP參考文獻(xiàn)ReferencesLander, 1996Lopez et al., 2005Tautz, 1989Varshney et al., 2005Botstein et al., 1980Williams et al., 1990Vos et al., 1995Paran and Michelmore, 1993Konieczny and Ausubel, 1993Neff et al., 1998Zietkiewicz et al., 1994Li and Quiros, 2001Hu and Vi

14、ck, 20033倍(Zhuet al., 2003 。Lopez 等(2005對木薯分別利用生物信息學(xué)方法對EST 序列數(shù)據(jù)庫及PCR 方法對非編碼區(qū)序列在5個栽培種中進(jìn)行SNP 分析，結(jié)果表明：EST 序列中509bp 一個SNP ；而在3'EST 和BAC 末端序列中62bp 出現(xiàn)一個SNP 。Liu 等(2007通過對秈稻品種廣來10096個全長cDNA 的測序并與基因組數(shù)據(jù)庫粳稻的序列比對發(fā)現(xiàn)，由于SNP 、插入缺失等序列多態(tài)性而引起45.8%的氨基酸水平替換。由于SNP 的特點(diǎn)，利用它可以構(gòu)建出非常精細(xì)的遺傳圖譜；在GenBank (

15、的SNP 數(shù)據(jù)庫中，400萬的水稻SNP 已被定位到水稻基因組(Lianget al., 2008 。1.2微衛(wèi)星標(biāo)記的生物信息學(xué)開發(fā)SSR 標(biāo)記因其重現(xiàn)性好、可檢測位點(diǎn)多、共顯性且均勻覆蓋整個基因組等優(yōu)點(diǎn)成為育種家和遺傳學(xué)家研究的有效工具。由序列信息開發(fā)SSR 主要從BAC 末端、基因間序列等非編碼序列及從EST 等編碼序列中開發(fā)，前者稱為基因組SSR ，具有更高的多態(tài)性而在區(qū)分關(guān)系相近的基因型時更加有效；后者稱為EST-SSRs ，來自轉(zhuǎn)錄本的特性賦予了其更高的價值：通過同源性檢索可以推斷其功能；可用于對自然群體和種質(zhì)收集的功能多樣性分析；高水平的可轉(zhuǎn)移性使之在比較定位和進(jìn)化研究中可作為錨

16、定標(biāo)記。1.2.1EST-SSRs 的識別、頻率及分布Morgante 與Olivieri 早在1993年就開發(fā)對植物EST-SSRs 進(jìn)行鑒定。然而當(dāng)時可利用的公共序列數(shù)據(jù)非常有限(<5000kb 。在單子葉植物及雙子葉植物中鑒定率分別只達(dá)到64.6kb 和21.2kb 一個EST-SSRs 。隨后，EST 計劃的實施產(chǎn)生了大量序列基于生物信息學(xué)與生物技術(shù)開發(fā)植物分子標(biāo)記的研究進(jìn)展The Progress of Development for Plant Molecular Markers Based on Bioinformatics and Biotechnology131分子植物

17、育種Molecular Plant B推動了基因內(nèi)SSRs 的識別。Varshney 等(2005估計了大麥75.2Mb 、玉米54.7Mb 、水稻43.9Mb 、黑麥3.7Mb 、高粱41.6Mb 和小麥37.5Mb 的表達(dá)區(qū)域SSR 密度，平均覆蓋率為6.0kb 一個SSR 。然而，Morgante 等(2002在水稻、玉米和小麥中報道了分別為2.1kb 、1.1kb 、1.3kb 的更高的SSRs 頻率。值得注意的是由于在識別SSRs 的標(biāo)準(zhǔn)上的差異導(dǎo)致SSRs 的頻率及不同長度、不同重復(fù)單位的出現(xiàn)頻率在不同研究中差異較大。最常見的

18、為3個核苷形成的重復(fù)(trinucleotiderepeats, TNRs ，其次是2個核苷(dinucleotiderepeats, DNRs 或4個核苷形成的重復(fù)(tetranucleotiderepeats, TTNRs 。Varshney 等(2005研究發(fā)現(xiàn)在禾本科作物EST 數(shù)據(jù)庫中TNR 出現(xiàn)頻率最高，為54%78%；DNR 和TTNR 則分別為17.1%40.4%和3%6%。不同重復(fù)模體的頻率和分布在不同研究中均有差異：小麥中TNRs 變化為49%83%，DNRs 與TTNRs 的出現(xiàn)頻率在不同研究中則變化不大(Kantetyet al., 2002; Morgante et

19、al., 2002 。1.2.2多態(tài)性水平由于轉(zhuǎn)錄區(qū)的DNA 序列保守性較強(qiáng)，EST-SSRs 的多態(tài)性一般低于基因組SSR 。然而最近在對獼猴桃EST-SSRs 進(jìn)行發(fā)掘并定位時發(fā)現(xiàn)，其中93.5%具有多態(tài)性而且在種內(nèi)雜交產(chǎn)生的群體中有分離。另外，3' 非翻譯區(qū)EST-SSRs 的多態(tài)生檢測率高于5' 非翻譯區(qū)。Scott 等(2000發(fā)現(xiàn)來自不同區(qū)域的EST-SSRs 的其多態(tài)性有所差異，3'UTR 的EST-SSRs 在栽培種間具有最高的多態(tài)性；5'UTR 的EST-SSRs 在不同的種間具有最高的多態(tài)性；而編碼區(qū)的EST-SSRs 在不同的屬間具有最高的

20、多態(tài)性。胥猛和李火根(2008通過對6520條鵝掌楸EST 序列進(jìn)行檢索，在364條ESTs 中發(fā)現(xiàn)394個SSRs ，鵝掌楸EST-SSRs 平均密度為每8.5kb 含有1個SSR ；其中二核苷酸重復(fù)單元的SSRs 類型最多，占總數(shù)的61.9%。利用SSR-ESTs 序列共設(shè)計176對EST-SSR 引物，擴(kuò)增后多態(tài)性引物占36.9%。這批EST-SSR 引物具有較高通用性，85%在中國馬褂木中有擴(kuò)增，54%在白玉蘭中有擴(kuò)增。EST-SSRs 的開發(fā)對于比較作圖來講非常重要。一個可以在不同的物種中擴(kuò)增出同源位點(diǎn)的EST-SSRs 引物數(shù)據(jù)庫對育種家和遺傳學(xué)家來講非常有用，尤其是對小而資金不足

21、的作物更是如此，因為它們位于基因編碼區(qū)，具有很強(qiáng)的保守性。2利用分子生物學(xué)實驗技術(shù)開發(fā)新的分子標(biāo)記從實驗室開發(fā)新的分子標(biāo)記方式來講可將其分為3類：第一種包括RAPD 、SSR 、AFLP 、SRAP 等，因其具有共同點(diǎn)，即不需要預(yù)知DNA 序列信息、檢測位點(diǎn)隨機(jī)性強(qiáng)而將其稱為非特異性標(biāo)記；第二種主要包括FLP 、SSR 、SCAR 、CAPS 等，其特點(diǎn)是預(yù)先需了解DNA 序列信息以制備探針或設(shè)計引物、檢測位點(diǎn)特異性高，在此將其稱為特異性標(biāo)記，它們的開發(fā)主要從感興趣的非特異性標(biāo)記轉(zhuǎn)換而來；另一種則是根據(jù)已知序列設(shè)計特異的單側(cè)引物與另一側(cè)用非特異性引物組合擴(kuò)增，特將此類標(biāo)記稱為中間型標(biāo)記，如TR

22、AP 標(biāo)記。2.1新型非特異標(biāo)記SRAP 的研究相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-relatedamplified polymorphism, SRAP 由美國加州大學(xué)Li 與Quiros 博士于2001年提出。引物設(shè)計是SRAP 分析的核心。SRAP 標(biāo)記分析共有兩套引物。在一組正向SRAP 引物中使用“CCGG ”序列，其目的是使之特異結(jié)合ORFs 區(qū)域中的外顯子；反向引物的3' 端含有核心AATT ，其目的是為了提高多態(tài)性。研究表明外顯子一般處于富含GC 區(qū)域，如擬南芥2和4號染色體的全序列中，外顯子CG 比例分別為46.5%和44.08%，而內(nèi)含子中則為32.1%和33.0

23、8%(Linet al., 1999 。由于內(nèi)含子、啟動子和間隔序列在不同物種甚至不同個體間變異很大，富含AT 的區(qū)域序列通常見于啟動子和內(nèi)含子(Liand Quiros, 2001 ，這就使得有可能擴(kuò)增出基于內(nèi)含子與外顯子的SRAP 多態(tài)性標(biāo)記。Li 和Quiros (2001利用同一引物組合，從甘藍(lán)類不同作物中(包括花椰菜、表花菜等 可獲得多個SRAP 標(biāo)記，且在不同實驗中多態(tài)性條帶重復(fù)性極好；同時，在花椰菜DH 植株與青花菜雜交產(chǎn)生的F 2群體cDNA 中檢測到281個多態(tài)性SRAP 標(biāo)記，構(gòu)建了由cDNA-SRAP 標(biāo)記組成的轉(zhuǎn)錄圖譜。2.2新型中間型標(biāo)記TRAP 的研究靶位區(qū)域擴(kuò)增多

24、態(tài)性(targetregion amplified poly-morphism, TRAP 標(biāo)記由美國農(nóng)業(yè)部北方作物科學(xué)實驗室Hu 與Vick 于2003年提出。SRAP 使用兩個任意引物；而TRAP 是使用任意引物與長度為1620個核甘酸的固定引物，任意引物與SRAP 所用的一樣，為一段以富含AT 或GC 為核心、可與內(nèi)含子或外顯子區(qū)配對的隨機(jī)序列；固定引物以公用數(shù)據(jù)庫中的靶EST 序列設(shè)計而來。Hu 與Vick (2003設(shè)計了與向日葵EST 數(shù)據(jù)庫中編碼富含亮氨酸重復(fù)(LRR類似蛋白序列配對的固定引物，利用TRAP 標(biāo)記分析，對向日葵屬16個野生種及2個雜交種的遺傳變異性進(jìn)行評估。結(jié)果1

25、32基于生物信息學(xué)與生物技術(shù)開發(fā)植物分子標(biāo)記的研究進(jìn)展The Progress of Development for Plant Molecular Markers Based on Bioinformatics and Biotechnology表明TRAP 標(biāo)記可用于評估向日葵的遺傳多樣性分析，聚類結(jié)果與經(jīng)典分類相一致；其中一個TRAP 引物結(jié)合到與抗病性有關(guān)的基因序列。張麗等(2008利用24對TRAP 引物對16個玉米自交系進(jìn)行了遺傳多樣性分析, 共擴(kuò)增出475條具多態(tài)性的譜帶，平均多態(tài)性信息量為0.9044，平均多態(tài)性比率為84.8%。對16個自交系類群劃分結(jié)果與系譜分析結(jié)果基本一致

26、。表明TRAP 技術(shù)在遺傳多樣性分析別和重要目的農(nóng)藝性狀的基因定位方面存在廣泛的應(yīng)用前景。3特異性分子標(biāo)記的研究3.1SSR 分子標(biāo)記的開發(fā)策略傳統(tǒng)的SSR 分子標(biāo)記開發(fā)需先制備基因組DNA 片段，篩選較小DNA 片段，連接載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建基因組文庫。用人工合成帶放射性同位素或非放射性標(biāo)記的SSR 探針進(jìn)行文庫篩選。對陽性克隆進(jìn)行測序，根據(jù)SSR 重復(fù)的側(cè)翼序列信息設(shè)計引物。這種方法工作量大，近年來有些學(xué)者相繼提出一系列高效的SSR 標(biāo)記開發(fā)策略。3.1.1基于RAPD 富集SSR為避免基因組文庫構(gòu)建和篩選陽性克隆，Cifarelli 等(1995提出利用SSR 與隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的開

27、發(fā)策略，并在糖用甜菜、橄欖、向日葵上成功分離出SSR 。其主要程序是：先進(jìn)行RAPD 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增條帶。再將RAPD 擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，并用地高辛標(biāo)記的特異SSR 探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交。對陽性條帶進(jìn)行回收、克隆、測序。序列分析表明，兩端為RAPD 引物，內(nèi)部包含SSR 序列。3.1.2基于ISSR-PCR 的SSR 分離ISSR 標(biāo)記是與基于RAPD 的分離策略相比，ISSR-PCR 基礎(chǔ)上的分離方法同樣避免了文庫的構(gòu)建與篩選，而且避免了SSR 富集的隨機(jī)性，從而大大縮短了時間，降低了研究費(fèi)用。Fisher 等(1996年設(shè)計5' KKVRVRV(CT63&#

28、39; 為簡并引物對基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。對簡并引物多基因座PCR 產(chǎn)物克隆，隨機(jī)選取8個克隆測序，結(jié)果表明，各SSR 相異，且序列兩側(cè)均有SSR 存在，重復(fù)數(shù)612不等。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于不僅可方便快捷建立SSR 富集文庫，而且只需設(shè)計合成SSR 一側(cè)引物序列，就可與原簡并引物配合使用，省去了設(shè)計合成SSR 另一側(cè)引物的費(fèi)用。3.1.3建立序列標(biāo)簽文庫獲得SSR 引物序列Hayden 和Sharp (2001通過建立序列標(biāo)簽文庫富集SSR 。該方法結(jié)合ISSR-PCR 擴(kuò)增、選擇性雜交、酶切、連接等技術(shù)，將從基因組中篩選捕獲的多個含SSR 一側(cè)保守序列的片段連接后克隆到質(zhì)粒載體中，建

29、成序列標(biāo)簽庫。該序列標(biāo)簽庫中每個克隆都含有多個SSR 一側(cè)保守序列，可用于設(shè)計SSR 引物，大大提高了工作效率。另外，還有基于引物延伸(Ostranderet al., 1992 、基于選擇雜交(Karagyozovet al., 1993 等方法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其相應(yīng)技術(shù)原理可參考相應(yīng)文獻(xiàn)，這里不再一一贅述。相比之下，基于ISSR-PCR 擴(kuò)增的富集方法所需設(shè)備簡單，技術(shù)成熟，適合于多數(shù)實驗室開展工作。3.2利用RFLP 和RAPD 轉(zhuǎn)化為特異性的PCR 標(biāo)記Causse 等(1994構(gòu)建了包含800個RFLP 標(biāo)記的水稻遺傳連鎖圖。但該技術(shù)檢測步驟較多，周期長，檢出的多態(tài)性較少。基于

30、PCR 技術(shù)的RAPD 分子標(biāo)記多態(tài)性檢出率高，操作簡便、快速，但對反應(yīng)條件極為敏感，重演性相對較差(Welshand McClelland, 1991 。通過對基因組DNA 克隆的雙向末端測序并依據(jù)末端序列設(shè)計引物，William 等(1991將RFLP 標(biāo)記轉(zhuǎn)換為SCAR 標(biāo)記。這些引物直接以基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)擴(kuò)增多態(tài)性區(qū)域。如果擴(kuò)增產(chǎn)物沒有長度多態(tài)性，對PCR 片段進(jìn)行限制性酶切，如果其內(nèi)部序列存在酶切位點(diǎn)的差異，則這樣可以將改標(biāo)記轉(zhuǎn)化為CAPS 標(biāo)記。RAPD 標(biāo)記快捷方便，不需預(yù)知序列信息，但較低的穩(wěn)定性限制了其應(yīng)用。Paran 和Michelmore (1993及

31、Nair 等(1995;1996 通過將與抗蟲基因連鎖的RAPD 標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR 標(biāo)記，提高了標(biāo)記的可靠性及特異性。3.3利用AFLP 標(biāo)記開發(fā)特異性分子標(biāo)記的策略AFLP 技術(shù)是Vos 等(1995發(fā)明的一種標(biāo)記，其原理是將基因組用限制性內(nèi)切酶消化后，兩端連接上接頭，用根據(jù)接頭核苷酸序列和酶切位點(diǎn)特征設(shè)計的引物進(jìn)行兩輪PCR 擴(kuò)增。它具有多態(tài)性豐富、檢測效率高、重現(xiàn)性強(qiáng)、覆蓋整個基因組及無需預(yù)知序列信息等優(yōu)點(diǎn)。然而，由于AFLP 標(biāo)記操作繁雜且比較昂貴，有必要將其轉(zhuǎn)化為單位點(diǎn)、易操作的標(biāo)記類型。近年來，關(guān)于將AFLP 轉(zhuǎn)化為單位點(diǎn)易操作標(biāo)記被相繼報道(Shanet al., 1999;

32、Meksem et al., 2001; Brugmans et al., 2003 ，本文綜合多篇文獻(xiàn)及個人實踐體會篩選整合一套適宜普通實驗室進(jìn)行AFLP 轉(zhuǎn)化的技術(shù)路線。3.3.1對共顯性AFLP 標(biāo)記的轉(zhuǎn)換AFLP 標(biāo)記多數(shù)情況下表現(xiàn)為顯性，當(dāng)不同材料中選擇性擴(kuò)增片段有長度差異時就表現(xiàn)為共顯性。133分子植物育種Molecular Plant B比如當(dāng)檢測材料包含雙親及雜種一代時，可在凝膠上分辨出共顯性AFLP 標(biāo)記片段。此時只需回收目標(biāo)片段并以其為模板用相應(yīng)的選擇性擴(kuò)增引物再擴(kuò)增，測序，根據(jù)兩端序列設(shè)計引物，即可將把共顯性AFLP

33、 標(biāo)記轉(zhuǎn)化為特異性的共顯性SCAR 標(biāo)記。3.3.2對顯性AFLP 標(biāo)記的轉(zhuǎn)換由酶切位點(diǎn)及選擇性堿基的差異而產(chǎn)生的顯性AFLP 標(biāo)記則需要以下步驟將其轉(zhuǎn)化：(1選擇清晰可辨的多態(tài)性條帶，回收并測序(Nicodand Largiader, 2003 。(2根據(jù)AFLP 片段的序列，在符合引物設(shè)計基本原則前提下，使擴(kuò)增片段盡可能大，以提高片段內(nèi)SNP 出現(xiàn)的可能性。(3顯性SCAR 標(biāo)記的產(chǎn)生。用內(nèi)部引物對所有樣品DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，如果因為堿基的差異導(dǎo)致引物在某些樣品DNA 中不能退火而出現(xiàn)擴(kuò)增片段有無的差異，此時，顯性的AFLP 標(biāo)記就被轉(zhuǎn)換為特異性的單位點(diǎn)顯性SCAR 標(biāo)記。在對玉米S-CMS

34、 育性恢復(fù)基因精細(xì)定位過程中利用此法將一個AFLP 標(biāo)記轉(zhuǎn)化為顯性的SCAR 標(biāo)記SCARE12M7(Zhanget al., 2006 。(4由內(nèi)部多態(tài)性產(chǎn)生CAPS 標(biāo)記。內(nèi)部引物的擴(kuò)增片段如不能轉(zhuǎn)化為顯性SCAR 標(biāo)記，則用一系列較低廉的限制性內(nèi)切酶去篩選擴(kuò)增片段的內(nèi)部堿基差異。為了增加在內(nèi)切酶識別位點(diǎn)檢測到SNP 的機(jī)率，只選取4個或5個識別堿基的內(nèi)切酶。如存在所選酶切位點(diǎn)的差異，在3%EB 瓊脂糖膠上檢測，則轉(zhuǎn)換為共顯性的CAPS 標(biāo)記(Brugmanset al., 2003 。在對玉米S-CMS 育性恢復(fù)基因精細(xì)定位過程中利用此法將一AFLP 標(biāo)記轉(zhuǎn)化為共顯性的CAPS 標(biāo)記CA

35、PSE3P1(Zhanget al., 2006 。(5尋找產(chǎn)生AFLP 標(biāo)記的原始SNP 。Brugmans 等(2003開發(fā)了一套對導(dǎo)致AFLP 產(chǎn)生的多態(tài)性進(jìn)行檢測的技術(shù)，該技術(shù)構(gòu)思巧妙，檢測效率很高。(6將引起AFLP 標(biāo)記產(chǎn)生的SNP 或INDEL 轉(zhuǎn)化為CAPS 或dCAPS 標(biāo)記。第一步要獲得AFLP 多態(tài)性片段的側(cè)翼基因組序列，進(jìn)而設(shè)計引物以擴(kuò)增包含這些SNP 或INDEL 的片段。側(cè)翼序列的獲得有多種方法，首先最便捷的是利用AFLP 序列搜索公共數(shù)據(jù)庫，檢出與其高度同源且有足夠長的側(cè)翼便于引物設(shè)計的序列(Zhanget al., 2006 ；另外Brugmans 等(2003

36、認(rèn)為Genome Walker Kit (clontech是獲得側(cè)翼序列的一種高效手段；而對于基因組中含有大量重復(fù)序列的生物來講，反向PCR (inversePCR 則是更好的選擇(Ochmanet al., 1988 。獲得側(cè)翼序列并設(shè)計引物得到不同材料的擴(kuò)增產(chǎn)物后，對限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)內(nèi)部的SNP 或INDEL 可直接用相應(yīng)的內(nèi)切酶轉(zhuǎn)化為CAPS 標(biāo)記；對選擇性堿基內(nèi)的SNP 或IN-DEL 標(biāo)記需轉(zhuǎn)化為dCAPS 標(biāo)記。DCAPS 標(biāo)記是在目標(biāo)突變的基礎(chǔ)上利用PCR 引物錯配引入一個限制性酶切位點(diǎn)多態(tài)性(Neffet al., 1998 。Komori 等(2003對BT 型水稻不育系

37、恢復(fù)基因進(jìn)行了精細(xì)定位，其中標(biāo)記C1361MwoI 即是由一個INDEL 轉(zhuǎn)化而來的dCAPS 標(biāo)記。3展望分子標(biāo)記在過去的遺傳學(xué)研究和育種實踐過程中發(fā)揮了重要作用。然而，對于近等基因系庫的構(gòu)建、基因/QTL的精細(xì)定位、圖位克隆及多數(shù)非模式植物而言，現(xiàn)有的分子標(biāo)記數(shù)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，公共數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)中所能提供的遺傳連鎖圖的密度尚需不斷提高。在全基因組測序或序列資源相對豐富的作物中采用生物信息學(xué)方法開發(fā)新標(biāo)記是經(jīng)濟(jì)有效的選擇；相反，對于大量可用序列信息較少的非模式生物采用PCR 等生物技術(shù)手段開發(fā)標(biāo)記是首選策略。近年來一些學(xué)者提出功能標(biāo)記的概念，功能標(biāo)記是指從影響特定性狀變異基因的功能域開發(fā)的分

38、子標(biāo)記，用于分子標(biāo)記輔助選擇可提高選擇效率(Baggeet al., 2007 。應(yīng)用本文所述各種技術(shù)從ESTs 數(shù)據(jù)庫、cDNA 或候選基因中開發(fā)標(biāo)記，如ESTs-SSR 、cDNA-RAPD 、cDNA-SRAP 、cDNA-AFLP ，候選基因中開發(fā)SCAR 、CAPS 等，則可望獲得連鎖于相關(guān)性狀的功能標(biāo)記。參考文獻(xiàn)Bagge M., Xia X., and Lubberstedt T., 2007, Functional markersin wheat, Curr. Opin. Plant Biol., 10(2:211-216Batley J., Barker G., O'

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