生化技術(shù)第五章

1、第五章第五章 基因重組與基因分析基因重組與基因分析第一節(jié) 核酸的分離純化n 核酸是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。無論是進行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化，核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。n核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，要純化核酸就必須去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，同時要保持所要提取核酸分子的結(jié)構(gòu)和活性不被破壞。n核酸的性質(zhì)：nDNA為白色類似石棉樣的纖維狀物， RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 nDNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于

2、乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。核酸分離、純化要保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性核酸分離、純化要保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性n遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。n分離核酸要注意：n溫度不要過高；n控制一定的pH值范圍（pH值5-9）；n保持一定的離子強度；n減少物理因素對核酸降解的機械剪切力。n防止核酸的生物降解 細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制

3、劑。nDNA酶抑制劑n金屬離子螯合劑：DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA、8-羥基喹啉；n陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。nRNA酶抑制劑酶抑制劑nRNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。 n皂土。 皂土帶負電荷，能吸附RNase，使其失活。nDEPC（二乙基焦碳酸鹽）。粘性液體，強核酸酶抑制劑n作用機制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。n使用注意：DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌

4、呤環(huán)。但濃度比使蛋白變性的濃度大1001000倍。容易降解，保存在4 或液氮中；提RNA時，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。劇毒。核酸提取的過程與原理核酸提取的過程與原理n裂解細胞。n去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子時，應(yīng)去除RNA，反之亦然。n濃縮沉淀核酸。n純化核酸，去除鹽類，有機劑等雜質(zhì)。n檢測純度與質(zhì)量。n核酸的保存保存。n細胞的破碎細胞的破碎n細胞破碎的方法有：高速組織搗碎機搗碎；玻璃勻漿器勻漿；超聲波處理法；液氮研磨法；化學處理法（SDS、吐溫80等）；生化法（溶菌酶、纖維素酶等）。該過程要在低溫下進行，并避免核酸

5、酶對核酸的水解。n核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核蛋白的解聚、變性蛋白的去除n核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負靜電吸力（核酸與堿性蛋白的結(jié)合）、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。n核蛋白有核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白兩種，針對所提核酸的種類，要選擇合適的方法。常用方法：n加入濃鹽溶液（如NaCl）。核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；常選用0.14mol/L的氯化鈉溶液提取RNP，而選用1mol/L的氯化鈉溶液提取DNP。n加入SDS。SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；n酚/

6、氯仿抽提。酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用?？杉由弦欢康漠愇齑伎煞乐蛊鹋莺痛偈顾嗯c有機相的分離（酚:氯:異戊醉=25:24:1）。核蛋白0.14mol/LNaCl1.0mol/LNaClRNP溶解度大溶解度大溶解度小溶解度小DNP 溶解度?。▋H為水中溶解度?。▋H為水中1%）溶解度大溶解度大 (比在水中大比在水中大2倍倍)n核酸的沉淀濃縮核酸的沉淀濃縮n核酸和蛋白質(zhì)分離后，經(jīng)離心后溶液分為三層：上中下分別是核酸溶液、變性蛋白質(zhì)凝膠和氯仿。接下來要濃縮核酸，沉淀是濃縮核酸最

7、常用的方法。n優(yōu)點：改變核酸的溶解緩沖液；重新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。n一般強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0冰水，10-15min， DNA樣品足可達到實驗要求。n核酸的純化n得到核酸沉淀后，還要要去除鹽類，有機劑等雜質(zhì)。通常是用乙醇洗滌，由于乙醇易揮發(fā)，最后只剩下比較純的核酸。n核酸的濃度與純度的測定核酸的濃度與純度的測定A.紫外分光光度法測定紫外分光光度法測定DNA和和RNA的含量的含量n前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應(yīng)大于0.25 g/ml 。n在波長260nm

8、紫外光下，1OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單鏈DNA為37g/ml；RNA為40g/ml。n測測DNA：n純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260mOD230應(yīng)大于2.0。nOD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。n小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；nOD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。n可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。n測測RNAn純RNA樣品其OD260/OD280應(yīng)介于1.7-2.0之間，OD260 /OD230比值應(yīng)大于2.0。n若RNA樣

9、品OD260/OD280比值太小，有蛋白質(zhì)或酚污染；n比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染；nOD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。 溴乙錠熒光法測定核酸的含量n如果DNA和RNA的量很少或有較多雜質(zhì)的情況下，其含量可用溴乙錠熒光法測定。此法的比較主要基于目測，是估計水平。 電泳檢測核酸的含量和質(zhì)量n通過電泳，可以觀察所得核酸樣品降解情況，也可以通過與標準Marker亮度比較來估計所得核酸含量。n核酸的保存核酸的保存nDNAnDNA樣品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；n長期保存樣品中可加入一滴氯仿。nRNA nRNA樣品溶于0.3 mol/L NaAc (p

10、H5.2)或雙蒸滅菌水中，-70保存；n長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中；n在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復合物)凍貯于-70,可保存數(shù)年。 第二節(jié)第二節(jié) 聚合酶鏈式反應(yīng)（聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）n聚合酶鏈式反應(yīng)是上世紀80年代發(fā)展起來的一種體外快速擴增特異DNA序列的技術(shù)。此技術(shù)于1985年由Mullis發(fā)明，1988年耐熱TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)令該技術(shù)使用更加方便、有效。nPCR可以說是20世紀核酸分子生物學研究領(lǐng)域的最重大發(fā)明之一，這不僅表現(xiàn)在該方法本身的簡單和巧妙，而且還表現(xiàn)在它的出現(xiàn)高速發(fā)展了大量在以前看來似乎不可能的生物學技術(shù)。nMullis因其卓越

11、的貢獻而獲1993年的諾貝爾化學獎。nPCR的原理：的原理：n類似于DNA的天然復制過程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的條件下，由耐熱的TaqDNA聚合酶催化DNA的復制，合成靶DNA。PCR包括三個基本過程：n變性。加熱模板使其解離成單鏈。n退火。降低溫度使人工合成的寡核苷酸引物與模板 DNA 中所要擴增的靶序列的兩側(cè)按堿基配對原則相結(jié)合。n延伸。在適宜條件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3端向前延伸，合成與模板堿基完全互補的DNA鏈。這樣變性、退火和延伸構(gòu)成一個循環(huán)，每一次循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，經(jīng)過3035個循環(huán)后，界于

12、兩個引物之間的靶序列得到大量復制，拷貝數(shù)約增加106107倍。聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）nPCR的原理：n這樣變性、退火和延伸構(gòu)成一個循環(huán)，每一次循這樣變性、退火和延伸構(gòu)成一個循環(huán)，每一次循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，經(jīng)過環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，經(jīng)過3035個循環(huán)后，界于兩個引物之間的靶序列得到大量個循環(huán)后，界于兩個引物之間的靶序列得到大量復制，拷貝數(shù)約增加復制，拷貝數(shù)約增加106107倍。倍。n典型典型PCR的反應(yīng)體系：的反應(yīng)體系：n耐熱DNA聚合酶：n耐熱DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶 ，Sac DNA聚合酶。其中Taq聚合酶應(yīng)

13、用最廣泛。Taq酶在92.5、95和97.5時半衰期分別為40min、30min和5-6min，故PCR中變性溫度不宜高于95。Taq酶的最適溫度是72 ，較高溫度下的DNA合成錯誤率較低。因此一次加酶可滿足PCR反應(yīng)全過程的需要，使PCR 走向自動化。n純化的Taq DNA聚合酶有53外切酶活性，而無35外切酶活性，無校對活性。因此在PCR中每2104個核苷酸中有可能摻入一個錯誤核苷酸，這對一般的PCR產(chǎn)物分析不會有多少影響，但將PCR擴增產(chǎn)物用于分子克隆時，需使用更準確的DNA聚合酶。n在100L反應(yīng)體系中，一般需Taq DNA聚合酶0.5-5單位，酶濃度過高，可引起非特異產(chǎn)物的擴增，濃度

14、過低則擴增產(chǎn)物量減少。Taq DNA酶可在-20貯存至少6個月。nPCR反應(yīng)的緩沖液：反應(yīng)的緩沖液：nPCR的緩沖液一般制成10，含有：500m mol/L KCl；100m mol/L Tris-HCl(pH8.3)；15m mol/L MgCl2；0.1% 明膠。使用時要稀釋10倍。n各組分的作用：nTris-HCl可維持反應(yīng)體系的pH；nKCl有利于引物退火，但濃度過高會抑制Taq DNA聚合酶活性；n明膠可保護酶不變性失活；nMg2+能影響Taq酶的活性，影響反應(yīng)的特異性和擴增DNA的產(chǎn)率，因此要將Mg2+濃度調(diào)至最佳。nPCR引物：引物：nPCR反應(yīng)成功擴增的一個關(guān)鍵條件在于寡核苷酸

15、引物的正確設(shè)計。引物設(shè)計一般遵循以下原則：n引物長度。一般為15-30bp，引物太短，就可能同非靶序列雜交得到不需要的擴增產(chǎn)物 。nG+C含量。G+C含量一般為40%-60%。引物的G+C含量和引物Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)，按公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 估計引物的Tm值。n堿基的隨機分布。引物中4種堿基應(yīng)隨機分布，不要多個嘌呤或多個嘧啶連續(xù)出現(xiàn)。引物自身不應(yīng)存在互補序列，以免自身折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)影響與模板的退火結(jié)合。兩引物之間也不應(yīng)有互補性，尤其是避免3端的互補而形成引物二聚體，使靶序列的擴增量下降。n引物濃度。引物的濃度一般為0.1-0.5mol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增。

16、 ndNTP：ndNTP常用的濃度為20-200mol/L，而且4種dNTP的終濃度相等。dNTP濃度過高雖可加快反應(yīng)速度，但會增加堿基的錯誤參入率，適當?shù)牡蜐舛葧岣叻磻?yīng)的精確度。另外，dNTP是磷酸根的來源，會與Mg2+結(jié)合，應(yīng)注意協(xié)調(diào)Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。n模板模板DNA：n模板可以是基因組DNA、質(zhì)粒DNA、擴增后的DNA、cDNA等，RNA的擴增需要首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進行正常PCR循環(huán)。含有靶序列的DNA可以單鏈或雙鏈形式加入PCR混合液。通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子DNA。n溫度循環(huán)參數(shù)溫度循環(huán)參數(shù)n變性溫度一般為在90-95。變性所需的時間

17、取決于DNA的復雜性，一般用94、30s對模板DNA進行變性，過高的溫度及過長的時間會降低Taq酶的活性。n引物退火溫度通過Tm=4(G+C)+2(A+T)計算得到，一般55-80 30s。延伸溫度選在70-75之間，此時Taq酶活性最高。n延伸反應(yīng)的時間根據(jù)擴增片段的長度而定，一般1 kb以內(nèi)延伸1 min，更長的片段需相應(yīng)延長時間。nPCR的循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度，一般20-30次。循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物也越多。 PCR技術(shù)的擴展技術(shù)的擴展n典型的PCR經(jīng)過一定的調(diào)整可用于特殊的研究工作，使PCR技術(shù)擴展到分子生物學的各個方面 ，較常用的技術(shù)擴展有：1. “巢式”PCRn先用一

18、對引物對模板進行擴增，然后再用另一對引物擴增第一對引物擴增的產(chǎn)物，這一PCR 技術(shù)即巢式PCR。第一次擴增所用引物稱外引物，第二次擴增作用的引物稱內(nèi)引物。n進行“巢式”PCR可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長一些，且用量較少，用外引物進行時，采用較高退火溫度使內(nèi)引物不能與模板結(jié)合，故只有外引物擴增。經(jīng)過若干循環(huán)，待外引物基本消耗完畢后，只需降低退火溫度即可直接進行內(nèi)引物的PCR擴增。這種PCR技術(shù)被稱為“中途進退式”PCR。n“巢式”及“中途進退式”PCR主要用于極少量模板的擴增。2. 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）nPCR由于Taq酶只能以DNA為模板，當待擴增模板為RNA時，需先將其反轉(zhuǎn)錄為c

19、DNA才能進行PCR擴增，這種PCR技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR。RT-PCR常用于基因cDNA文庫的構(gòu)建和基因表達水平的分析。該技術(shù)需要用到反轉(zhuǎn)錄酶。 3. 熒光定量熒光定量PCR（RT-PCR）n通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進行分析，計算待測樣品的初始模板量。n螢光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。n熒光定量實時PCR的特點：n實時在線監(jiān)控。對樣品擴增的整個過程進行實時在線監(jiān)控。對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控，能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加，實時監(jiān)控，能夠?qū)崟r

20、地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期。直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期。n降低反應(yīng)的非特異性。使用引物和熒光探針降低反應(yīng)的非特異性。使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合，提高同時與模板特異性結(jié)合，提高PCR特異性。特異性。n增加定量的精確性。全程監(jiān)控，準確定量。增加定量的精確性。全程監(jiān)控，準確定量。n結(jié)果分析更加快捷方便，無需跑膠。結(jié)果分析更加快捷方便，無需跑膠。n基本原理：基本原理：n通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性分析。在實時熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號 強度也等比

21、例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖n一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段 , 熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR 產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進行定量分析。n實時熒光定量PCR中熒光化學物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下： nTaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的

22、熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。nSYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。 第三節(jié) 核酸序列測定nDNA測序是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是核苷酸排列方式。RNA測序則通常將RNA提取后，反轉(zhuǎn)錄為DNA后使

23、用DNA測序的方法進行測序。n在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。n目前應(yīng)用最廣泛的是：nSanger雙脫氧鏈終止法。nMaxam-Gilbert DNA化學降解法。n新技術(shù)：雜交測序法， 質(zhì)譜法， 單分子測序法， 原子探針顯微鏡測序法，DNA 芯片法 。Sanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法n基本原理：基本原理：n在模板指導下，DNA聚合酶不斷將dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延長，合成出新的互補的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于雙脫氧核糖的3位置上缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5-引

24、物端和以ddNMP殘基為3端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。n由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸單鏈DNA，從而讀取DNA核苷酸序列。nddNTPs 是反應(yīng)終止劑，是反應(yīng)終止劑，可以當作正常堿基參與復可以當作正常堿基參與復制，一旦鏈入制，一旦鏈入DNA中，其中，其后就不能再繼續(xù)連接。后就不能再繼續(xù)連接。在自動測序中將熒光素連在4種ddNTP上Sanger雙脫氧鏈終止法n基本步驟：n測序模板的純化與定量n測序反應(yīng)PCR儀n測序反應(yīng)產(chǎn)物純化與變性n上樣電泳測序儀n分析結(jié)果Sanger雙脫氧鏈終止法n測序結(jié)果：測序結(jié)果：Maxam-Gilb

25、ert DNA化學降解法化學降解法n基本原理：n在一個末端標記的DNA片段在幾組互相獨立的的化學反應(yīng)分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對某一種或某一類堿基。n因此生成一系列放射性標記的分子，從共同起點（放射性標記末端）延續(xù)到發(fā)生化學降解的位點。n每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。n鮮明特點是可以探測DNA構(gòu)象中的蛋白質(zhì)DNA相互作用。堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對 N7進行甲基化,使 C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2

26、.0 哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/L NaCl存在時,可用肼除去胞嘧啶B.Maxam-Gilbert DNA化學降解法n基本原理：n化學降解法與雙脫氧法的比較化學降解法與雙脫氧法的比較nMaxam-Gilber化學降解法所能測定DNA序列的長度要比Sanger法短一些，通常說來，化學降解法對放射性標記末端250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。n如今雙脫氧核苷酸末端終止法遠比Maxam-Gilbert化學降解法應(yīng)用得更為廣泛。但是，化學降解法具有一個Sanger 法所不具備的明顯

27、優(yōu)點：即所測核酸序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此，利用Maxam-Gilbert法可以對合成的寡核苷酸進行測序，分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，也可以通過化學保護及修飾干擾實驗來研究DNA二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。n然而，由于Sanger法的簡便快速，仍不失為現(xiàn)今DNA測序的最佳選擇方案。第四節(jié) 基因重組與表達n基因重組是由于不同基因重組是由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產(chǎn)生鏈的斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交片段的交換和重新組合，形成新?lián)Q和重新組合，形成新DNA分子的過程。發(fā)生在生物體內(nèi)的基因分子的過程。發(fā)生在生物體內(nèi)的基因重組包括同源重組、位點特異重組、轉(zhuǎn)座

28、作用和異常重組四大類，重組包括同源重組、位點特異重組、轉(zhuǎn)座作用和異常重組四大類，是生物遺傳變異的一種機制。是生物遺傳變異的一種機制。n本節(jié)所講的基因重組是指基因克隆。是本節(jié)所講的基因重組是指基因克隆。是70年代發(fā)展起來的一項具年代發(fā)展起來的一項具有革命性的研究技術(shù)。有革命性的研究技術(shù)。2022-2-2南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院44基因克隆的主要步驟1. 目的基因的獲得目的基因的獲得n基因組DNA的非特異性斷裂n超聲波處理基因組DNA可得到300bp左右的隨機片段，高速組織搗碎器，控制一定的條件也能得到不同大小的DNA片段。由機械處理產(chǎn)生的DNA片段末端不一，斷點隨機，條件難以掌握，所以目前較少

29、使用這種方法。n染色體DNA的限制性內(nèi)切酶酶解n型限制性內(nèi)切酶可專一識別并切割特定的DNA順序，產(chǎn)生不同類型的DNA末端。若載體DNA與插入片段用同一種內(nèi)切酶消化，可以直接進行連接。n內(nèi)切酶識別的DNA順序長短與降解后DNA產(chǎn)生的片段大小有直接關(guān)系。若識別順序為4個堿性對，則該順序在DNA鏈上出現(xiàn)的機率為44，即在堿基隨機排列的前提下，每256個堿基對就有一個切點。對于識別6個核苷酸的限制性內(nèi)切酶，其順序出現(xiàn)的頻率為46(4096)，可獲得較大的DNA片段，也可用于DNA文庫的建立。 n通過mRNA合成cDNAn基因組DNA中重復順序和假基因占有很大比重，克隆完整基因困難。利用RT-PCR得到

30、相應(yīng)的雙鏈cDNA，再進行克隆，獲得較完整的連續(xù)編碼順序，容易在宿主細胞中表達。v人工體外合成DNA片段n一些小分子生物活性多肽，可以通過人工合成編碼順序插入載體后，轉(zhuǎn)化細菌進行表達。分子較大的基因，可以通過分段合成，然后連接組裝成完整的基因。v聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增特定基因片段n對于有部分了解或完全清楚的基因，可以通過PCR反應(yīng)，直接從染色體DNA或cDNA上高效快速地擴增出目的基因片段，然后進行克隆操作。2. 載體載體n載體是由在細胞中能夠自主復制的分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實驗手段可使其它的片段連接在它的上面，而進行復制，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個性能：n分子較小，可攜帶

31、比較大的片段。 n能獨立于染色體而進行自主復制并且是高效的復制。 n要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點。 n有適合的標記，易于選擇。 n有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉(zhuǎn)錄及表達，并且盡可能是高效的表達。 n從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實驗室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復制等等。n載體的分類載體的分類n按功能可分為：按功能可分為：n克隆載體：克隆一個基因或DNA片斷n表達載體： 用于一個基因的蛋白表達n整合載體：把一個基因插入到染色體組中n按來源可分為：按來源可分為：n質(zhì)粒載體n噬菌體載體n柯斯質(zhì)粒載體n真核細胞克隆載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體n質(zhì)粒是一種獨立

32、于染色體外的小分子環(huán)狀DNA，大小約106108 D，可自身復制和表達，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當改造便可成為良好的載體。 作為載體的質(zhì)粒大多是由天然 質(zhì)粒經(jīng)人工適當改造而成的， 目前已有多種經(jīng)改造的良好的 質(zhì)粒載體。n兩種質(zhì)粒載體：n克隆的質(zhì)粒載體。允許外源的DNA插入，儲存。主要是DNA水平上的操作。n基因表達的質(zhì)粒載體。允許外源DNA的插入、儲存和表達。npBR322npBR322是由幾個質(zhì)粒DNA通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的克隆載體，分子的長度為4363bp。具有氨芐青霉素和四環(huán)素兩種抗藥性標記。npBR322共有24種限制性內(nèi)切酶的單一識別位點，其中

33、7種酶的識別位點位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種酶的識別位點存在于這個基因的啟動子內(nèi)部。所以在這9個限制性位點上插入外源DNA通常都會導致抗四環(huán)素基因(tetr)的失活。n3種酶在氨芐青霉素抗性基因(ampr)內(nèi)具單一的識別位點，在這3個位點插入外源DNA則會導致ampr基因的失活。n若將外源基因插入tetr基因，將構(gòu)成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入對四環(huán)素和氨芐青霉素均敏感的受體菌，則在含氨芐青霉素的平面培養(yǎng)基上生長，而在含四環(huán)素的平面培養(yǎng)基上不生長的菌落均含有外源基因。20世紀世紀70年代早期年代早期主要利用天然質(zhì)粒主要利用天然質(zhì)粒，1977年年Bolivar等等構(gòu)建成功構(gòu)建成功pBR322，1982年年Vi

34、era和和 Messsing構(gòu)建成功構(gòu)建成功pUC系列質(zhì)粒，隨系列質(zhì)粒，隨后有不少穿梭質(zhì)粒后有不少穿梭質(zhì)粒，表達質(zhì)粒等問世，表達質(zhì)粒等問世。npUC18/pUC19npUC載體系列是由大腸桿菌pBR322質(zhì)粒與M13噬菌體改建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體，含有來自pBR322質(zhì)粒的復制起點(ori)，氨芐青霉素抗性基因(ampr)以及大腸桿菌半乳糖苷酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼肽鏈的基因，在lacZ基因中有一個多克隆位點(MCS)區(qū)段。n當外源的DNA片段插入到這些克隆位點使互補鏈破壞時，形成的是無活性的-半乳糖苷酶，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞，在X-gal -IPTG培養(yǎng)基上形成白色菌落，而沒有

35、外源DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞后，在X-gal-IPTG培養(yǎng)基上形成藍色菌落。npUC質(zhì)粒載體比pBR322具有更小的相對分子質(zhì)量，更大的拷貝數(shù)（每個細胞可達500-700個拷貝），因此由pUC質(zhì)粒重組體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞，可獲得高產(chǎn)量的克隆DNA分子。pUC18和pUC19的唯一差別是多克隆位點的方向相反。nXgal可被可被-半乳糖苷酶水解生成深蘭色的半乳糖苷酶水解生成深蘭色的5-溴溴-4-靛蘭，靛蘭，IPTG可誘導可誘導-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-鏈的合成。鏈的合成。 白色菌落：含外源DNA的轉(zhuǎn)化菌落藍色菌落：轉(zhuǎn)化入空載體的菌落藍白篩選噬菌體噬菌體n噬菌體的基因組是長度約為50kb的線性

36、雙鏈DNA分子。在其兩端，各有一條由12個核苷酸組成的互補粘性末端。當噬菌體DNA進入寄主細胞后，線性DNA分子通過粘性末端的堿基配對而結(jié)合，形成環(huán)狀DNA分子。這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段為cos位點。n現(xiàn)用的噬菌體載體都是在野生型基礎(chǔ)上改造而成的。改建之后的常用載體有兩類：n插入型載體，具有一個可供外源DNA插入的克隆位點；n替換型載體，具有成對的克隆位點，在兩個位點之間的DNA區(qū)段可被外源插入的DNA片段取代。n插入型載體只能插入較小的外源DNA片段（10kb），而替換型載體能插入較大的外源DNA片段（20-24kb左右）。當重組體DNA分子大于噬菌體基因組105%或小于75% 時，

37、重組噬菌體的活力會大大下降，不能形成正常大小的噬菌斑，所以重組體DNA分子長度應(yīng)控制在包裝限度范圍內(nèi)。 n噬菌體重組體分子不具抗生素抗性選擇標記，主要是依據(jù)噬菌斑的形態(tài)學特征和Xgal-IPTG顯色反應(yīng)來篩選重組子。ncI基因的存在將使噬菌體進入溶源狀態(tài)，因此在培養(yǎng)基上形成的是混濁型的噬菌斑。cI基因失活或缺失 的噬菌體在培養(yǎng)基上形成清亮型噬菌斑。根據(jù)這個形態(tài)學特征可篩選重組體分子。v 許多載體，含有編碼半乳糖苷酶基因lacZ（其中引入多克隆位點）。由這種載體感染的大腸桿菌lac-菌，涂布在含有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基平板上，會形成藍色噬菌斑。當外源DNA片段插入到這些克隆位點時，寄主細胞就

38、會在Xgal-IPTG培養(yǎng)基上形成無色噬菌斑。柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體ncosmid載體：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體。ncosmid載體帶有質(zhì)粒的復制起點、克隆位點、選擇性標記以及噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細胞內(nèi)。n柯斯質(zhì)粒載體的特點：n具有噬菌體的特性；n具有質(zhì)粒載體的特性；n具有較高容量的克隆能力；n具有與同源性序列

39、的質(zhì)粒進行重組的能力。酵母人工染色體(YAC)v 酵母人工染色體是一種真核細胞克隆載體。v YAC含有酵母染色體端粒、著絲點及復制起點等功能序列，可插入長度達200 - 500kb的外源DNA，導入酵母細胞可以隨細胞分裂周期復制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計劃的重要工具。M13噬菌體噬菌體nM13噬菌體是一種單鏈噬菌體載體。M13噬菌體顆粒的外形呈絲狀，具有長約6400bp的閉合環(huán)狀單鏈(+)DNA，它只感染帶有F因子所編碼的性纖毛的大腸桿菌，所以是雄性大腸桿菌特有的噬菌性。M13(+)鏈DNA進入大腸桿菌寄主細胞后形成雙鏈復制型DNA（RF DNA）。(-)鏈轉(zhuǎn)錄成M13的mRNA，并以滾

40、環(huán)復制合成M13(+)鏈DNA，并環(huán)化形成M13基因組。nM13是一種非溶菌的噬菌體，在實驗中所觀察到的混濁型噬菌斑，是由于感染的細菌生長速度比未感染的細菌明顯下降所致。由于M13能以雙鏈DNA形式存在于細胞中，并以單鏈DNA形式分泌到大腸桿菌以外，所以適合于在Sanger設(shè)計的雙脫氧DNA序列分析中制備單鏈模板。n在M13系列中，部分載體中含有大腸桿菌lacZ序列，并可在此序列中導入多克隆位點，進行藍白篩選。nM13噬菌體這類單鏈噬菌體載體的優(yōu)越性：噬菌體這類單鏈噬菌體載體的優(yōu)越性：n單鏈DNA噬菌體的復制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復制形式 的 DNA簡稱RFDNA；n不論是RF-

41、DNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；n單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的多制約的，不存在包裝限制問題；n容易測定外源DNA片斷的插入取向；n可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。n這類載體主要用來獲得大量的單鏈片段，這種單鏈片段在遺傳學研究中主要用來測定序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。 工具酶工具酶n20世紀60年代末70年代初，科學家們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄酶等一系列工具酶，為基因的剪切和基因片段與載體的鏈接等相應(yīng)基因操作奠定了基礎(chǔ)。這一類酶在重組DNA系統(tǒng)或基因工程操作中起著重要作用。n常用的工具酶有：n限制性內(nèi)切酶主要

42、用于DNA分子的特異切割 n核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 n核酸連接酶用于DNA和RNA的連接 n核酸酶用于DNA和RNA的非特異性切割 n核酸末端修飾酶用于DNA和RNA的末端修飾 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶n限制性內(nèi)切核酸酶是一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基序列的核酸水解酶。它們絕大多數(shù)是從微生物中分離出來的，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和功能特性，可分為I型、II型、III型三類。n 其中I型、III型類限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點和切割位點不同因此沒有實際應(yīng)用的價值。nII型能嚴格識別核酸序列，并在識別區(qū)內(nèi)特定的核苷酸處切開DNA雙鏈，只由一條肽鏈構(gòu)成，僅需Mg2+，切割DNA特異性最強，且

43、就在識別位點范圍內(nèi)切斷DNA，是分子生物學中應(yīng)用最廣的限制性內(nèi)切酶。故通常所指都是II型限制性DNA內(nèi)切酶，之后提到的限制性內(nèi)切核酸酶均指II型限制性內(nèi)切酶。n限制性內(nèi)切酶根據(jù)種類不同可以產(chǎn)生5黏性末端、3黏性末端和平齊末端三種末端。DNA聚合酶聚合酶nDNA聚合酶是能夠催化DNA 復制和修復DNA 分子損傷的一類酶，在基因工程操作中的許多步驟都是在DNA聚合酶催化下進行的DNA體外合成反應(yīng)。n這類酶作用時大多數(shù)需要DNA模板并且優(yōu)先作用于DNA 模板，也可作用于RNA 模板，但效率較低。最常用的依賴于DNA的DNA聚合酶有：n大腸桿菌DNA聚合酶（全酶）；n大腸桿菌DNA聚合酶大片段（Kle

44、now片段）；nT4和T7噬菌體編碼的DNA聚合酶；n經(jīng)修飾的T7噬菌體 DNA 聚合酶（測序酶）；n耐熱 DNA 聚合酶（TaqDNA 聚合酶和 AmpliTaqTM）n有一種聚合酶，即反轉(zhuǎn)錄酶，是依賴于RNA的DNA聚合酶可優(yōu)先拷貝RNA。n大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶n大腸桿菌DNA聚合酶是由大腸桿菌polA基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，是一種多功能酶，具有三種酶活性：53的聚合酶活性、53的核酸外切酶活性和35的核酸外切酶活性。n切口平移反應(yīng)：當雙鏈DNA的一條鏈產(chǎn)生缺口時，DNA聚合酶的53聚合酶將脫氧核苷酸加添到3-OH 末端上，與此同時，其53核酸外切酶從缺口的5-P末端切

45、除原有核苷酸，使切口沿著DNA平移，此即稱為切口平移反應(yīng)，又稱為缺口翻譯。n在迄今已發(fā)現(xiàn)的所有聚合酶中只有大腸桿菌 DNA 聚合酶能夠進行這種獨立的鏈的取代反應(yīng)，因為它具有53核酸外切酶活性，可以在聚合酶沿DNA鏈推進之前從DNA鏈上去除核苷酸。3.2. DNA聚合酶nKlenow 大片段酶大片段酶nDNA聚合酶可以被蛋白酶切割成兩個片段，一個片段的分子質(zhì)量較小，具有全部的53方向的核酸外切酶活性；另一個片段具有全部的53聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。n大腸桿菌DNA聚合酶大片段即Klenow大片段酶是用枯草桿菌蛋白酶裂解完整的DNA 聚合酶而產(chǎn)生出來的大片段分子，或者通過克隆技術(shù)而得到的

46、單一多肽鏈，由全酶中去除了53外切核酸酶活性，而53聚合酶活性及35核酸外切酶活性均不受影響。nKlenow片段的主要用途是：n補平限制酶切割DNA后產(chǎn)生的3凹端；n用32PdNTP對DNA片段的3凹端進行末端標記；n在cDNA克隆中，用于合成cDNA 第二鏈；n應(yīng)用Sanger雙脫氧鏈末端終止法進行DNA測序。nT4 DNA聚合酶聚合酶nT4 DNA聚合酶，是從T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出來的一種特殊的DNA聚合酶。同大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段相似，具有兩種酶催活性，即53的聚合酶活性和35外切酶活性。而且35外切活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA更強。nT7 DNA

47、聚合酶聚合酶nT7 DNA聚合酶是從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細胞中純化出來的一種復合形式的核酸酶,具有極高的連續(xù)合成能力(即高度續(xù)進性)，可以連續(xù)合成數(shù)千個核昔酸，是回前已知持續(xù)合成能力最強的DNA聚合酶。用于長模板DNA的引物延伸反應(yīng)。nT7 DNA聚合酶經(jīng)過適當化學處理可以使其失去35外切酶活性而轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N新的DNA聚合酶修飾的T7 DNA聚合酶。修飾的T7 DNA聚合酶由于失去了核酸外切酶活性，在單鏈模板上的聚合作用的速率增加了3倍，是雙脫氧終止法對長片段DNA進行序列測定的理想用酶，并以測序酶作為商品名廣泛使用。nTaq DNA聚合酶聚合酶nTaq DNA聚合酶是一種耐熱的DNA

48、聚合酶，發(fā)現(xiàn)于水生棲熱菌內(nèi)，故簡稱Taq酶或Taq。Taq聚合酶在97.5C時的半衰期為9分鐘。它的最適溫度為75-80C，72C時能在10秒內(nèi)復制一段1000bp的DNA片段。這種較高的酶活性有明顯的溫度依賴性。低溫下，Taq DNA聚合酶表現(xiàn)活性明顯降低，90C以上時合成DNA的能力有限。nTaq聚合酶常見于PCR技術(shù)，用于大量擴增DNA片段。PCR反應(yīng)中應(yīng)用Taq聚合酶，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷，大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用。n一般適用于DNA片段的PCR擴增、DNA標記、引物延伸、序列測定、平末端加A等，產(chǎn)物可直接用于T-A載體克隆。nTaq聚合酶的缺點之

49、一為催化DNA合成時的相對低保真性。它缺乏35核酸外切酶的即時校正機制，出錯率為1/9000。n反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶n反轉(zhuǎn)錄酶是以RNA為模板指導三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA）的酶。n反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3-OH末端上，按53方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA，它與RNA模板形成RNA-DNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導的DNA合成過程。n反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對于遺傳工程技術(shù)起了很大的推動作用，

50、目前它已成為一種重要的工具酶。常用于構(gòu)建出cDNA文庫，從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術(shù)中最常用的獲得目的基因的方法。DNA連接酶連接酶nDNA連接酶是指能夠催化兩條鏈間磷酸二酯鍵的形成 ，用于將兩段或數(shù)段 DNA連接起來的酶 。nDNA 連接酶所催化的 DNA 片段之間的連接本質(zhì)上是一個酶促生物化學過程 。最常用的是來自大腸桿菌T4噬菌體的 T4 DNA連接酶和來自大腸桿菌染色體編碼的大腸桿菌DNA 連接酶 ，兩類酶的作用機制類似 。修飾酶修飾酶n在分子克隆中除了上述三類主要工具酶以外，還可以用一些其他的酶對DNA或RNA進行必要的修飾，以利于克隆的進行。如：n末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

51、 可以催化一種或多種核苷酸連接到DNA片段的3羥基末端形成同聚尾，可以用于寡核著酸探針的末端標記；n多聚核苷酸激酶 可以催化人工合成的多核苷酸5羥基末端的磷酸化，為連接反應(yīng)提供磷酸基團或用于寡核蓄酸探針的末端標記；n堿性磷酸酶 能特異地切除DNA或RNA的5末端的磷酸基團，防止載體DNA分子自身環(huán)化；n核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶 在重組DNA技術(shù)中用于消化去除RNA和DNA污染等。n堿性磷酸酶堿性磷酸酶n堿性磷酸酶有兩種，分別來源于大腸桿菌和小牛腸道，前者叫做細菌堿性磷酸酶，后者叫做小牛腸堿性磷酸酶。它們的共同特性是能夠催化核酸脫掉5一磷酸基團，從而使DNA（或RNA）片段的5-P末端轉(zhuǎn)換成5

52、-OH末端，這就是所謂的核酸分子的脫磷酸作用。n堿性磷酸酶的這種功能，對于DNA分子克隆是很有用的，可以防止線性化的載體分子發(fā)生自我連接作用。n末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶n末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，簡稱末端轉(zhuǎn)移酶。其在二價陽離子存在下，該酶能夠催化5脫氧核苷三磷酸進行53方向的聚合作用，逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3-OH末端。n與DNA聚合酶不同，在反應(yīng)中末端轉(zhuǎn)移酶不需要模板的存在就可以催化DNA分子發(fā)生聚合作用，而且它還是一種非特異性的酶，4種dNTP中的任何一種都可以作為它的前體物，但對不同的核著酸所需的陽離子略有不同。DNA分子的體外連接nDNA分子的連接方案要有利于重組子的形成，

53、有時需要對載體或目的基因的末端進行改造， 現(xiàn)時常用的連接方案主要有： 全同源黏性末端的連接v 若DNA插入片段與適當?shù)妮d體存在同源黏性末端，則連接十分方便。但存在的問題是載體容易自身環(huán)化降低重組率，插入片段可雙向插入或多拷貝插入，目的基因需表達時，需采用定向克隆技術(shù)。 平末端連接平末端連接nT4 DNA連接酶可連接平末端，5突出的黏性末端，可以用Klemow酶53聚合酶活力將另一鏈的3末端填平成平頭末端。3突出的黏性末端可以用T4 DNA聚合酶的35外切酶刪切成平頭末端，平末端連接可以在DNA鏈的末端產(chǎn)生新的酶切位點，從而擴大了平末端連接的應(yīng)用范圍。n平末端連接的效率較低，易形成雙向插入和多拷

54、貝插入，適當加大T4 DNA連接酶濃度，降低ATP濃度，載體5端脫磷酸處理，加入適量的PEG可提高連接效率。 定向克隆定向克隆n使外源DNA片段定向插入到載體分子中的方案叫定向克隆。定向克隆是利用DNA分子兩個末端的不同內(nèi)切酶位點進行的，對于一些表達型重組子，外源DNA片段在載體啟動子下游的正向插入，是成功表達的基本條件。同時，定向克隆可有效地限制載體DNA自身環(huán)化。n定向插入要求載體DNA分子的兩個末端不能互補，只能與外源DNA分子的相應(yīng)末端連接，達到這一要求的DNA分子末端有兩種形式：nDNA兩端為非同源互補的黏性末端(黏-黏)?！梆?黏”末端可用不產(chǎn)生相同黏性末端的兩種內(nèi)切酶作用產(chǎn)生，重

55、組連接效率非常高，是重組方案中最有效、簡捷的途徑。nDNA分子一側(cè)為黏性末端，一側(cè)為平末端(黏-平)。 利用連接子連接利用連接子連接n連接子的作用主要是在DNA平末端添加新的內(nèi)切酶位點以產(chǎn)生黏性末端，便于DNA片段之間的連接，是亞克隆技術(shù)及基因文庫構(gòu)建中一項常用的技術(shù)。連接子大小一般為8-12bp，接受連接子的DNA片段必須是平末端，對于黏性末端則需預先修飾成平末端。n由于連接子的分子小，很容易達到DNA平末端連接所需的高末端濃度，一般連接子的末端濃度必須高于靶DNA末端濃度2-3倍。4-20mol/L連接子末端濃度，可以驅(qū)動T4 DNA連接酶的連接反應(yīng)，因此靶DNA的濃度就可以較低。市售的連

56、接子有兩種形式，即5末端磷酸化的連接子和5末端去磷酸化的連接子。前者能在T4 DNA連接酶催化下進行連接反應(yīng)。后者需要用T4多核苷酸激酶在其5端磷酸化后，才能成為連接酶的合適底物。利用連接子連接利用連接子連接n使用連接子進行亞克隆操作包括三個步驟：2022-2-2南京農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院82v 將連接子連接于外源DNA片段兩側(cè)一平末端上 ；v 用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割連接子；v 含新黏性末端的外源DNA片段與相應(yīng)的載體DNA分子連接。 利用適配子連接利用適配子連接nDNA適配子是人工合成的寡聚脫氧核糖核苷酸鏈，它含有某種黏性末端的突出順序，不需用內(nèi)切酶切割而產(chǎn)生。通過與其它適配子或連接子互補配對，

57、形成雙鏈DNA，再與靶DNA連接。在DNA重組中，可適用于各種類型的DNA末端之間的連接，且操作較使用連接子簡單。n當今，由于適配子及連接子技術(shù)的發(fā)展，就重組技術(shù)而言，幾乎不存在不能連接的DNA分子。 5. 重組子導入受體細胞重組子導入受體細胞n在基因克隆技術(shù)中，將重組質(zhì)粒導入細菌稱轉(zhuǎn)化，將重組后的噬菌體、病毒等導入細胞稱轉(zhuǎn)導。n轉(zhuǎn)化。受體菌用Ca2+處理后呈感受態(tài)，其細胞膜出現(xiàn)變化，使DNA易于進入細胞內(nèi)。重組質(zhì)粒與Ca2+處理過的感受態(tài)受體菌保溫，重組體可進入受體菌。增加培養(yǎng)基降低Ca2+ 濃度，基因便可表達。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率大約為105-107轉(zhuǎn)化體/g DNA，一般較小的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率較高。用

58、電擊法轉(zhuǎn)化細菌操作簡單，轉(zhuǎn)化率可高達109-1010 /g DNA ，此法需特殊設(shè)備，且電壓高，脈沖時間長時，細菌會有相當高的死亡率。n轉(zhuǎn)導。重組噬菌體DNA進入經(jīng)Ca2+處理的感受態(tài)細菌，轉(zhuǎn)導率可達105-106噬菌斑/g DNA，若用噬菌體的外殼蛋白包裝重組體，轉(zhuǎn)導率還可大大提高。6. 重組子的篩選重組子的篩選n不同的克隆載體及相應(yīng)的宿主系統(tǒng)，其重組子的篩選、鑒定方法不盡相同，常用的有以下幾類。針對遺傳表型改變的篩選法針對遺傳表型改變的篩選法n重組子轉(zhuǎn)化宿主細胞后，載體上的一些篩選標志基因的表達失活，會導致細菌的某些表型改變，通過瓊脂平板中添加一些相應(yīng)篩選物質(zhì)，可以直接篩選鑒別含重組子的菌

59、落。操作非常簡單，是篩選陽性重組子的第一步。插入失活雙抗生素對照篩選n如前述pBR322質(zhì)粒，若外源DNA插入tetr基因，則先將轉(zhuǎn)化菌接種到含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上，凡生長的菌落均含有質(zhì)粒。再用無菌牙簽將這些菌落接種到含四環(huán)素平板培養(yǎng)基 的對應(yīng)位置，凡不能生長者均含有重組質(zhì)粒，擴大培養(yǎng)這些菌落，即可擴增重組質(zhì)粒。 插入表達篩選n有些載體設(shè)計時，在篩選標志基因前面連接一段負控制序列，當插入失活該負調(diào)控序列時，其下游的篩選標記基因才能表達。如pTR262質(zhì)粒，其tetr基因上游存在Cl基因的負調(diào)控序列，CI基因可以抑制tetr基因的表達，當外源DNA片段插入CI基因時，tetr基因阻礙解除而表

60、達，陽性重組子為tetr表型，而質(zhì)粒本身為tets表型，故在四環(huán)素平板中，只有含外源DNA插入片段的陽性重組的轉(zhuǎn)化菌才能生長成菌落。-半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選n通過插入失活lacZ基因的載體包括M13噬菌體，pUC質(zhì)粒系列等。共同點是載體上攜帶一段細菌的基因lacZ，它編碼-半乳糖苷酶的部分，載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞為lacZM15 基因型，重組子中基因插入使-肽基因失活不能形成-互補作用，在X-gal平板上，含陽性重組體的細菌為無色噬菌斑或菌落，載體自身環(huán)化后轉(zhuǎn)化的細菌為藍色噬菌斑或菌落。這種篩選方式的操作非常簡單，只是X-gal和IPTG等試劑價格較高。分析重組子結(jié)構(gòu)特征的篩選法分析重組子結(jié)構(gòu)特征的篩