一種水溶性茶多糖的單糖組成及糖醛酸含量的測定

1、m icin in s wine and calf tissues by high 2perf or mance liquid chr omat ography combined with electr os p ray i onizati on mass s pectr ometry J .J Mass Spectr om,2000,35(11:1342-1350.3Zhou MJ,W ei G L,L iu YP,et al .Deter m inati on of vertil 2m icin in rat seru m by high -perf or mance liquid chr

2、 omat ogra 2phy using 12fluor o 22,42dinitr obenzene derivatizati on J .JChr omat ogr B,2003,798(1:43-48.4Heller DN,Clark S B,R ighler HF .Confir mati on of genta m i 2cin and neomycin in m ilk by weak cati on 2exchange extracti on and electr os p ray i onizati on trap tande m mass s pectr ometry J

3、.J Mass Spectr om,2000,35(1:39-49.(收稿:2007-10-15一種水溶性茶多糖的單糖組成及糖醛酸含量的測定孫平楠1,周小玲1,汪東風2(1.汕頭大學醫(yī)學院,廣東汕頭515041;2.中國海洋大學食品學院,山東青島266003摘要:目的研究一種水溶性茶多糖中的中性糖組成及其對糖醛酸含量測定的影響,為準確測定茶多糖中糖醛酸含量提供參考依據(jù)。方法采用氣相色譜法分析了10種茶多糖樣品單糖組成,考察了其主要的三種單糖組分組成的混合中性糖(110.5,摩爾比對硫酸咔唑法、間羥聯(lián)苯法兩種方法測定糖醛酸含量的影響。結果10種水溶性茶多糖樣品的主要單糖組成為阿拉伯糖(A ra

4、、半乳糖(Gal 以及葡萄糖(Glc 。結論在測定茶多糖中糖醛酸含量時,這3種中性糖對間羥聯(lián)苯法的干擾遠小于硫酸咔唑法。關鍵詞:茶多糖;中性糖;糖醛酸;硫酸咔唑法;間羥聯(lián)苯法中圖分類號:R927.2文獻標識碼:A 文章編號:1673-4610(200801-0053-03基金項目:汕頭大學博士啟動基金作者簡介:孫平楠(1977-,男,博士,講師,從事生物技術與新藥開發(fā)研究工作。Neutral Sacchari de Co mpositi on and Uron i c Ac i d Deter m i n ati on of A Soluble Tea Polys accharideS UN

5、Ping 2nan 1,ZHOU Xiao 2ling 1,WANG Dong 2feng 2(1.Shant ou UniversityM edical College,Shant ou,Guangdong 515041;2.College of Food Science,Ocean University of China,Q ingdao,Shandong 266003Abstract:O bjecti ve To investigate neutral saccharide compositi on in a s oluble tea polysaccharide and their i

6、nfluence on deter m inati on of the ur onic acid content in order t o deter m ine it accurately .M ethods Based on the sugar analysis of 10tea polysaccharides,the m ix of arabinose galact ose glucose (110.5,mol rati o ,which was the maj or sugar compositi on in tea polysaccharides,were app lied t o

7、investigate the influence of sugar on the carbazole method and meta 2hydr oxydi phenyl method res pectively .Results The s oluble tea polysaccharides were mainly consisted of arabinose,galact ose,and glucose .Conclusi on Meta 2hydr oxydi phenyl method is less influenced by the neutral sugar in tea p

8、olysaccharides than carbazole method and dis p layed high sensitivity and s pecificity .Key words:tea polysaccharides;neutral saccharide;ur onic acids;carbazole method;meta 2hydr oxydi phenyl method茶多糖是從茶葉中提取的一類雜多糖,有降血糖、降血脂、抗輻射、增強免疫功能等生理活性,是一種具有開發(fā)前景的天然保健品。研究表明具有生理活性的多糖往往含有較高含量的糖醛酸成分。因而,糖醛酸含量的測定成為一些活

9、性多糖質(zhì)量控制的一個重要方面1,2。常用的糖醛酸測定方法主要有硫酸咔唑法、間羥聯(lián)苯法兩種方法。但由于多糖所含的中性糖對糖醛酸的測定有干擾,故在測定其含量時對方法的選擇上應有所考慮。有研究報道,葡萄糖、木糖、和巖藻糖對硫酸咔唑法測定結果影響較大,鼠李糖和木糖對間羥聯(lián)苯法測定結果影響較大3。在茶多糖的相關研究報道中,糖醛酸含量范圍相差很大。究竟是什么因素造成如此大的差異,有待深入研究討論。因此,本文采用氣相色譜法對10個茶樣中分離純化得到的茶多糖的中性糖組成進行了分析,考察了由茶多糖中主要中性糖組分配比得到的混合糖對硫酸咔唑法、間羥聯(lián)苯法測定糖醛酸的影響,為茶多 糖中糖醛酸的準確測定提供參考。1儀

10、器與試劑Unico紫外分光光度計;間羥聯(lián)苯、葡萄糖醛酸、L2阿拉伯糖、D2半乳糖、D2葡萄糖均購自sig ma 公司;硫酸(分析純、咔唑(化學純、茶多糖樣品(經(jīng)Q2Sephar ose FF陰離子交換柱分離純化制得4,氣相色譜儀(Agilent GCE890、DB225毛細管柱(30m×0132mm×25m;火焰離子化檢測器(F I D。2實驗方法2.1茶多糖的單糖組成測定:氣相色譜法52.1.1多糖水解精密稱取供試樣品22mg置于玻璃試管中,加入3m l三氟乙酸,溶解完全后轉移至安瓿瓶中,然后充氮氣密封,在100油浴中水解6h,冷卻,打開安瓿瓶后,旋轉蒸發(fā)濃縮至干,加2

11、m l甲醇超聲振蕩溶解,再濃縮至干,重復3次,將三氟乙酸徹底除去。2.1.2單糖還原在水解后的茶多糖供試樣品中加入50mg Na BH4和5mg內(nèi)標物肌醇,再加2m l 超純水在室溫下反應1.5h,然后滴入冰醋酸至沒有氣泡產(chǎn)生為止,濃縮至干,加0.1%鹽酸甲醇溶液1 m l溶解,濃縮至干,重復6次。2.1.3糖醇乙?；鲜鏊庖褐屑尤?m l乙酸酐后置于100水浴中使完全溶解,然后封管,在沸水中乙?；?h,冷卻后加入1m l蒸餾水,用3m l 三氯甲烷分3次萃取。小心取出下層有機相,合并后濃縮至0.5m l,封口后冷凍保存供氣相色譜分析。2.1.4氣相色譜條件DB225毛細管柱(30m

12、15;0132mm×25m;載氣流速為1m l/m in;火焰離子化檢測器(F I D;柱溫220,結果見表1。2.2硫酸咔唑法測定茶多糖中糖醛酸含量精確稱取干燥的葡萄糖醛酸對照品10mg,定容于25m l量瓶作為對照品溶液。準確量取0,0.1, 0.2,0.4,0.6,0.8m l對照品溶液于帶塞試管中,各管加水至1m l。在冰水浴中向各管加入6m l濃硫酸,搖勻后,改在85水浴20m in,取出后冷至室溫,各管加0.2m l咔唑液,在室溫下保持2h,530 nm測定吸光值,制作標準曲線6。取樣品適量,同法測定,經(jīng)標準曲線計算含量。2.3間羥聯(lián)苯法測定茶多糖中糖醛酸含量精密量取葡萄

13、糖醛酸對照品溶液(60mg/m l 0,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5m l,用蒸餾水補加至0.25m l。冰浴預冷后加入1.5m l四硼硫酸鈉硫酸溶液。振搖混合,在沸水浴中加熱5m in。冰浴冷卻至室溫,加入25m l間羥聯(lián)苯試液,搖勻后,在520nm處測定吸光度,繪制標準曲線7。取樣品適量,同法測定,經(jīng)標準曲線計算含量。3結果與討論3.1茶多糖樣品的中性糖組成茶多糖中的中性糖由鼠李糖(Rha、阿拉伯糖(A ra、木糖(Xyl、甘露糖(Man、半乳糖(Gal、葡萄糖(Glc組成,其中以阿拉伯糖、半乳糖以及葡萄糖3種單糖為主。在所測的10種茶多糖樣品中,這3種單糖占中性糖的摩

14、爾百分比在89.21% 93144%之間,而且這3種單糖的摩爾比例接近11015(表1。由此確定A ra、Gal、Glc這3種單糖是測定茶多糖中糖醛酸含量的主要干擾因素。表1不同茶樣的茶多糖的中性糖組成比例(mol%茶多糖樣品Rha A ra Xyl Man Gal Glc中性糖占樣品的質(zhì)量比(W/W綠茶13.1533.903.362.4538.4418.700.64綠茶22.9626.772.932.4440.6124.280.81綠茶33.3832.271.971.2150.3210.850.77綠茶43.2843.592.863.0734.3012.900.59綠茶53.9938.132

15、.992.4836.9215.500.78綠茶63.5234.712.883.2136.8518.830.60綠茶73.3832.422.802.8341.4117.170.57綠茶83.5331.322.673.1442.9716.360.49烏龍茶13.6531.702.792.6044.8714.380.55烏龍茶25.7732.563.811.2246.4710.180.82 3.2茶多糖中性糖對測定糖醛酸含量的影響根據(jù)茶多糖的中性糖組成,將A raGalGlc以110.5的比例配制成近似茶多糖的中性糖組成,用配比好的混合液考察中性糖對茶多糖中糖醛酸測定的影響。由圖1可見隨著中性糖質(zhì)量

16、的增加,所產(chǎn)生的吸光值代入每種方法的標準曲線后得到的糖醛酸質(zhì)量也在增加。但是同樣質(zhì)量的中性糖,在硫酸咔唑法中造成的吸光值換算成相應的糖醛酸質(zhì)量比在間羥聯(lián)苯法中要大得多,而且隨著中性糖質(zhì)量的不斷增加,兩種方法相差的糖醛酸質(zhì)量也越大。即茶多糖中的中性糖組分對硫酸咔唑法測定糖醛酸的干擾比間羥聯(lián)苯法大,且干擾隨中性糖含量的增加而增大。3.3硫酸咔唑法、間羥聯(lián)苯法測定各茶多糖中糖醛酸結果比較對10種樣品茶多糖,分別采用硫酸咔唑法、間羥聯(lián)苯法測定其中的糖醛酸含量。結果發(fā)現(xiàn)硫酸咔唑法測定的茶多糖中的糖醛酸含量均比間羥聯(lián)苯法的高出不同程度;在硫酸咔唑法中根據(jù)各個樣品的中性糖含量計算出其產(chǎn)生的吸光值,在計算時將

17、其扣除,最后獲得硫酸咔唑法修正值,與間羥聯(lián)苯法值較為接近(表2 。圖1兩種糖醛酸測定方法中中性糖吸光值造成的誤差注:此處的縱坐標值(糖醛酸質(zhì)量是中性糖的吸光值通過糖醛酸標準曲線換算而來,是中性糖吸光值引起的誤差表2兩種方法測定的不同茶多糖中糖醛酸的結果比較茶多糖樣品糖醛酸含量(%硫酸咔唑法糖醛酸含量(%硫酸咔唑法(修正值糖醛酸含量(%間羥聯(lián)苯法綠茶145.9623.3822.30綠茶247.8921.9119.57綠茶346.4133.0119.63綠茶423.3319.8817.99綠茶550.0226.4221.24綠茶637.1925.7119.28綠茶723.9319.5417.24綠

18、茶828.3015.1618.20烏龍茶127.5219.5720.60烏龍茶258.7228.9022.75因此使用硫酸咔唑法、間羥聯(lián)苯法測定茶多糖中糖醛酸含量時,必須考慮其中的中性糖組分(A ra、Gal和Glc對測定的干擾。間羥聯(lián)苯法與硫酸咔唑法相比具有靈敏度高、受中性糖干擾小、檢測迅速等優(yōu)點,在實際操作中應首選該法,但在應用該法時,也應把茶多糖樣品配制成低濃度的溶液,使干擾盡量降低。若受條件限制,采用硫酸咔唑法測定時,可以相近含量、相似組成的中性糖做對照,以減小中性糖的干擾,從而使測定結果更接近真實值8。參考文獻:1劉桂敏,趙秀梅,陳菊娣,等.刺參酸性多糖質(zhì)控分析方法的研究J.解放軍預防醫(yī)學雜志,2004,22(2:107-109.2高林,施秀芳,張文博,等.MP