單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)苯作業(yè)工人淋巴細(xì)胞DNA損傷

1、論著單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)苯作業(yè)工人淋巴細(xì)胞DNA 損傷邢彩虹 李桂蘭 李玉英 曲青山 常平 穆瑞東 王援相 尹松年(本文圖1見(jiàn)封四摘要! 目的 用堿性單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)苯作業(yè)工人外周血淋巴細(xì)胞DNA 損傷, 研究苯的遺傳毒性。方法 采用堿性單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)。將接苯工人按累積濃度、歷史平均濃度和測(cè)定當(dāng)時(shí)8h 時(shí)間加權(quán)平均濃度(8h TWA 分組。觀察指標(biāo)包括DNA 斷裂分級(jí)(將DNA 斷裂損傷細(xì)胞按其損傷程度分級(jí) 及DNA 彗星尾長(zhǎng)(彗頭末端到彗尾的長(zhǎng)度 。結(jié)果 接苯工人DNA 斷裂程度及DNA 彗星尾長(zhǎng)lg(尾長(zhǎng)+1 兩個(gè)參數(shù), 接苯組按累積濃度、歷史平均濃度和8hTWA 濃度計(jì)算, 均

2、明顯高于對(duì)照組, 差異有顯著性(P 0. 01 , 并有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。結(jié)論 彗星試驗(yàn)?zāi)軌蚩焖?、敏感地檢測(cè)苯引起的人類淋巴細(xì)胞DNA 損傷, 提示對(duì)于檢測(cè)環(huán)境致癌物和致突變物可能是一有用工具。關(guān)鍵詞! 苯; 單細(xì)胞凝膠電泳(彗星試驗(yàn) ; DNA 損傷Study of DNA dam age among workers exposed to benzene by alkaline single cell gel electrophoresis detection XING Caihong *, LI Guilan, LI Yuying, et al. *Institute o f Occu

3、 pationa l Medicine, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijin g 100050, ChinaAbstract ! Objective To detect DNA damage in peripheral lymphocytes of workers exposed to benzene by alka li ne single cell gel electrophoresis and to study the genetic toxicity of benzene. Methods Alkali ne single ce

4、ll gel elec trophoresis(Comet assay was used.T he workers were divided into different group s by levels of accumulative exposure, his torical average and the eight hour time weigh ted average(8h TWA . The grade of DNA breakage and tail length of Comet assay were used to measure DNA damage. Results T

5、he grade of DNA breakage, the tail lengthlg(tail+1 and levels of accu mulative exposure, historical average and 8h TWA were significantly higher in lymphocytes of exposed workers, compared to matched controls(P 0. 01 . The dose response relationship was significant in the above three benzene con cen

6、trations. Conclusion Comet assay could sensitively and more conveniently detect DNA damage induced by benzene in human lymphocytes. It may be a useful tool for hu man bi omonitoring, particularly for the analysis of environ mental muta gens and carcinogens.Key w ords ! Benzene; Single cell gel elect

7、rophoresis(SC GE, comet assay ; DNA damage以往大量實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)場(chǎng)研究資料表明, 苯是一典型致突變劑, 可以引起動(dòng)物和人體染色體的廣泛損傷。彗星試驗(yàn)作為一種檢測(cè)DNA 損傷的技術(shù), 已成為檢測(cè)苯引起DNA 損傷及苯的遺傳毒性的有效方法。Plappert 等1證明單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(SCGE可在染苯小鼠的肝臟和血細(xì)胞中檢測(cè)DNA 的損傷。在苯暴露工人外周血淋巴細(xì)胞中也多次檢測(cè)出了DNA 損傷2, 3。為研究苯引起DNA 損傷的劑量-反應(yīng)關(guān)系, 我們用彗星試驗(yàn)檢測(cè)了苯作業(yè)工人外周血淋巴細(xì)胞的DNA 損傷。對(duì)象與方法1. 研究對(duì)象:接苯工人組46人, 分別選自制鞋

8、作者單位:100050北京, 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病研究所(邢彩虹、李桂蘭、常平、尹松年 ; 天津市勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病研究所(李玉英、穆瑞東、王援相 ; 紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)中心環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所(曲廠及體育用品廠; 對(duì)照組工人26人, 選自糧庫(kù)管理人員。工人接苯水平按以下3種方法計(jì)算:(1 將從事接苯工作各年接苯平均濃度接苯工齡的總和作為工人一生接苯總量, 即累積濃度。共分3組:300mg m -3 a -1; (2 收集工人從事接苯工作以來(lái)歷史定點(diǎn)測(cè)定濃度水平, 以工種為單位計(jì)算歷史接苯平均濃度。共分2組:16. 5, #16. 5mg/m 3; (3 現(xiàn)接苯水平(8h TW A 用美國(guó)3M

9、公司個(gè)體采樣器采樣分析, 共分3組:40mg/m 3。2. 彗星試驗(yàn)檢測(cè)方法:單細(xì)胞凝膠電泳參照Singh 等4方法略加改進(jìn)后進(jìn)行, 主要有以下步驟:(1 分離細(xì)胞:取靜脈血10ml, 肝素抗凝、離心, 分離出白細(xì)胞, 用淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞, 用PBS 調(diào)整細(xì)胞濃度為106107個(gè)/ml 。(2 制片:在磨毛玻片兩端(一端做平行對(duì)照 各鋪200 l 正常熔,后揭去蓋玻片, 取30 l 細(xì)胞懸液與45 l 低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMP A 混勻后鋪于第一層瓊脂上, 加上蓋玻片, 4冷凝10min 5。(3 裂解:揭去蓋玻片, 將膠板輕輕放入預(yù)冷的(用前加入體積分?jǐn)?shù)為1%的Tri ton X 1

10、00細(xì)胞 裂解液中, 裂解至少1h 。(4 電泳:將膠板放入新配制的電泳緩沖液中, 靜置20min, 使DNA 雙鏈解螺旋, 然后在25V 、300m A 條件下電泳20min 。(5 中和及染色:以0. 4mol/LTris 中和后, 用碘化丙啶染色。(6 彗星圖像分析:熒光顯微鏡(400倍 下觀察, 每片計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞。選用DNA 斷裂分級(jí)及DNA 彗星尾長(zhǎng)兩種觀察指標(biāo)。DNA 斷裂分級(jí)按彗星尾部長(zhǎng)度占總長(zhǎng)的比例判斷:(圖1 0級(jí):0. 05 。3. DNA 斷裂分級(jí)和彗星尾長(zhǎng)兩參數(shù)表示DNA 損傷(表1表3 , 接苯組明顯高于對(duì)照組, 差異有顯著性(P 0. 01 。4. DNA 斷裂分

11、級(jí)比較:按累積濃度(表1 、歷史接苯平均濃度(表2 以及8h TW A 濃度(表3 分組的各濃度組(以下簡(jiǎn)稱3種濃度組 均明顯高于對(duì)照組, 差異有顯著性(P 0. 01 , 不同接苯濃度組之間兩兩比較, 差異均有顯著性(P 0. 01 ; 并存在劑量-反應(yīng)關(guān)系(線性趨勢(shì)檢驗(yàn)P 0. 01 。5. 彗星尾長(zhǎng)比較:按歷史接苯平均濃度(表2 以及8h TWA 濃度(表3 分組的低濃度組彗星尾長(zhǎng)均明顯高于對(duì)照組, 差異有顯著性(P 0. 05 。表1 不同累積濃度的接苯工人DNA 斷裂分級(jí)及其%彗星&尾長(zhǎng)組別(mg m -3 a -1 人數(shù) 細(xì)胞數(shù) D NA 斷裂分級(jí)(細(xì)胞數(shù) 0123細(xì)胞損傷率(%

12、算術(shù)均數(shù) x s 幾何均數(shù) Gg苯工人組462300 139510. 61 13. 46 30011550279598912349*#17. 8323. 170. 99(0. 52對(duì)照組261300 1164 268129101. 972. 860. 370. 28P 0. 01( 檢驗(yàn) ; 各濃度組間比較, P 0. 01; 幾何均數(shù)取自x =lg(x +1 (x 為尾長(zhǎng)幾何數(shù)值, x 為尾長(zhǎng)算術(shù)數(shù)值 ; 彗星尾長(zhǎng)算術(shù)均數(shù)與對(duì)照組比較, P 0. 05(秩和檢驗(yàn) ; 彗星尾長(zhǎng)幾何均數(shù)與對(duì)照組比較, (P 0. 05(秩和檢驗(yàn)表2 不同歷史濃度的接苯工人DNA 斷裂分

13、級(jí)及其%彗星&尾長(zhǎng)組別(mg/m3 人數(shù) 細(xì)胞數(shù) D NA 斷裂分級(jí)(細(xì)胞數(shù) 0123細(xì)胞損傷率(% 算術(shù)均數(shù) x s 幾何均數(shù) Gg苯工人組462300 1395 10. 61 13. 46 16. 5341700 1087 102 28123036*#8. 027. 79 0. 83( 0. 32#16. 512600308529015049*#17. 953. 441. 00(0. 52對(duì)照組261300 1164 268129101. 972. 860. 370. 28P 0. 01( 檢驗(yàn) ; 各濃度組間比較, P 0. 01; 幾何均數(shù)取自x =lg(x

14、+1 (x 為尾長(zhǎng)幾何數(shù)值, x 為尾長(zhǎng)算術(shù)數(shù)值 ; 彗星尾長(zhǎng)算術(shù)均數(shù)與對(duì)照組比較, P 0. 05(秩和檢驗(yàn) ; 彗星尾長(zhǎng)幾何均數(shù)與對(duì)照組比較, (P 0. 05(秩和檢驗(yàn)表3 不同8h TWA 濃度的接苯工人DNA 斷裂分級(jí)及其%彗星&尾長(zhǎng)組別(mg/m3 人數(shù) 細(xì)胞數(shù) D NA 斷裂分級(jí)(細(xì)胞數(shù) 0123細(xì)胞損傷率(% 算術(shù)均數(shù) x s幾何均數(shù) Gg苯工人組462300 1395 10. 6113. 46408400143337914564*#25. 7423. 981. 27(0. 40對(duì)照組261300 1164 268129101. 972. 860. 3

15、70. 28值 , P 0. 05( ; , (0. 05(秩和檢驗(yàn)將尾長(zhǎng)取對(duì)數(shù)lg(尾長(zhǎng)+1 后, 3種濃度組的各濃度組尾長(zhǎng)均明顯高于對(duì)照組, 差異有顯著性(P 0. 05 。除按8h TW A 濃度分組的低濃度組和中濃度組與高濃度組間差異有顯著性(P 0. 05 , 但可看到在3種濃度組中隨濃度增加尾長(zhǎng)均有增加趨勢(shì)。作回歸和相關(guān)分析, 在散點(diǎn)圖上未發(fā)現(xiàn)3種濃度下彗星尾長(zhǎng)分布有明顯直線或曲線趨勢(shì), 尾長(zhǎng)與累積濃度、歷史接苯平均濃度、8h TW A 濃度間無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。討 論彗星試驗(yàn)在苯的體內(nèi)遺傳毒性研究中, 與微核實(shí)驗(yàn)、姊妹染色單體交換、染色體畸變相比同樣敏感, 且具有簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)。本

16、試驗(yàn)中改進(jìn)了傳統(tǒng)的三層凝膠方法, 只鋪二層, 使操作更簡(jiǎn)單, 鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)更清晰。也有人建立了帶槽磨毛載玻片加蓋玻片進(jìn)行單層灌膠的方法6, 操作更為方便。本試驗(yàn)中, 無(wú)論是按工人一生接苯累積濃度、歷史平均接苯濃度還是按8h TWA 濃度分析, 接苯工人DNA 單鏈斷裂程度隨接苯濃度的增加而增加, 并呈明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。雖然在散點(diǎn)圖上3種濃度下的彗星尾長(zhǎng)分布均無(wú)明顯的直線或曲線趨勢(shì), 但就分組而言, 各濃度組尾長(zhǎng)及取對(duì)數(shù)后的尾長(zhǎng)均隨濃度增加而增加, 且取對(duì)數(shù)后的尾長(zhǎng)均明顯高于對(duì)照組, 提示, 彗星尾長(zhǎng)可以作為分析DNA 損傷的指標(biāo)應(yīng)用于群體分析。另外, 各濃度組間尾長(zhǎng)兩兩比較差異無(wú)顯著

17、性可能是因?yàn)闃颖纠龜?shù)較少所致。有文獻(xiàn)報(bào)道, 接苯組DNA 損傷明顯高于對(duì)照組2, 7, 但未進(jìn)一步證明苯暴露所引起的DNA 損傷的劑量-反應(yīng)關(guān)系。也有報(bào)道, 高濃度接苯組(879. 0、376. 0mg/m 3和低濃度接苯組(172. 0mg/m3 DNA 損傷率與對(duì)照組差異無(wú)顯著性3。我們的試驗(yàn)顯示, 這種劑量-反應(yīng)關(guān)系可能由于隨著苯濃度增高, DNA 快速修復(fù)功能不能與越來(lái)越多的損傷平衡, 使DNA 損傷加重所致。由于苯引起DNA 損傷是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程, 雖然累積濃度與彗星尾長(zhǎng)的相關(guān)性(r 2=0. 05 較低, 但按累積濃度分析DNA 斷裂分級(jí)及彗星尾長(zhǎng)結(jié)果差異均有顯著性(P 0. 01

18、 , 因此, 按累積濃度計(jì)算的工人總接苯量分析苯引起的DNA 損傷應(yīng)更有價(jià)值。苯代謝物的遺傳毒性可能是由于細(xì)胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1, C YP 2E1 和髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO 將苯代謝為相關(guān)的毒性代謝CYP 2E1的催化作用被激活而引起骨髓毒性, 用選擇性CYP 2E1丙烯乙二醇抑制劑預(yù)處理后, 可降低受試物的DNA 損傷率8。該試驗(yàn)與甲苯可以減少血液和骨髓細(xì)胞中苯的毒性報(bào)告一致9, 甲苯可能是抑制了CYP 2E1的代謝作用從而減少苯的代謝作用。但也有報(bào)道, 苯與甲苯混合暴露的工人外周血淋巴細(xì)胞DNA 損傷明顯增加7, 說(shuō)明甲

19、苯的損傷作用不可低估, 甲苯的遺傳毒性機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。在體外試驗(yàn)中, 苯代謝物苯醌、氫醌和苯三酚可以引起人淋巴細(xì)胞DNA 單鏈斷裂和堿性不穩(wěn)定損傷, 在低劑量范圍內(nèi)(1 g/ml 尾長(zhǎng)隨濃度增加而增加, 當(dāng)濃度進(jìn)一步增高時(shí), 尾長(zhǎng)的增高趨勢(shì)將趨向穩(wěn)定, 這可能是導(dǎo)致自由基形成的苯內(nèi)源性代謝活化作用在某一階段達(dá)到飽和所致2。苯及其代謝物不象電離輻射、氧化劑那樣直接誘導(dǎo)DNA 損傷, 而是與DNA 共價(jià)結(jié)合形成加合物10, 在核酸內(nèi)切酶的作用下進(jìn)行切除修復(fù), 增加DNA 的不穩(wěn)定性, 導(dǎo)致基因突變和染色體畸變11。DNA 損傷與腫瘤發(fā)生有一定的關(guān)系, 由于SC GE 對(duì)低水平的DNA 損傷極

20、其敏感, 因此, SCGE 可用于人類遺傳損傷生物監(jiān)測(cè), 特別是作為職業(yè)有害因素對(duì)健康影響的早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)有更好的應(yīng)用前景。參 考 文 獻(xiàn)1Plappert U, Barthel E, Seidel HJ, et al. Reduction of benzene toxicity by toluene. Environ Mol Mut, 1994a, 24:283 292.2Andreoli C, Leopardi P, Crebelli R. Detec tion of DNA damage in humanlymphocytes by al kali ne single cell gel e

21、lectrophoresis af ter exposure to benzene of benzene metabolites. Mut Res, 1997, 377:95 104.3袁野, 鄔堂春, 陳勝, 等. 苯作業(yè)工人淋巴細(xì)胞DN A 損傷的研究.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病, 1996, 22:80 82.4Si ngh NP, M ccoy MT, Tice RR, et al. A s imple technique for quantitati onof low levels of DNA damage in indi vidual cells. Exp Cell Res, 1988, 175:184 191.5Vis vardis EE, Tas siou AM , Pi peraki s SM, et al. Study of D NA da mage induction and repai r capacity of fresh and c ryopres erved lymphocytes ex