人SonicHedgehog基因遠(yuǎn)距離增強(qiáng)子ZRS調(diào)節(jié)基因

1、論文：人Sonic Hedgehog基因遠(yuǎn)距離增強(qiáng)子ZRS調(diào)節(jié)基因表達(dá)機(jī)制的初步研究【中文摘要】Sonic Hedge基因在動物個體發(fā)育過程中起到形態(tài)發(fā)生素的作用,在多種器官和組織形成中發(fā)揮效用,如大腦,脊髓,丘腦,肢芽,上皮組織等,目前研究已經(jīng)表明,在不同的組織中shh(Sonic Hedgehog)基因的表達(dá)是由不同的增強(qiáng)子序列調(diào)節(jié)起作用的。在肢芽中,shh的表達(dá)受到距離其上游1Mb遠(yuǎn)的一段保守序列ZRS (ZPA regulatory sequence)的調(diào)節(jié),而當(dāng)該序列內(nèi)部出現(xiàn)點(diǎn)突變時,shh在肢芽部分的表達(dá)會發(fā)生變化,從而導(dǎo)致軸前多指畸形(PPD)這種嚴(yán)重遺傳病的出現(xiàn)。ZRS序列本身

2、非常保守,在人、小鼠、大鼠、雞、河豚中,目前已經(jīng)有報道10個以上的點(diǎn)突變會引發(fā)肢芽部分的發(fā)育異常。本實驗從病人樣本的基因組中篩選到了一個沒有被報道過的點(diǎn)突變(3C>G),PCR擴(kuò)增了兩種長度的含有點(diǎn)突變的DNA序列,并通過使用熒光素酶報告基因活性檢測系統(tǒng),在HEK-293A細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)具有點(diǎn)突變的ZRS序列和野生型的ZRS序列均具有增強(qiáng)子活性,而且活性是突變型的高于野生型的序列。對于這個突變體的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該點(diǎn)突變可能會改變這段增強(qiáng)子序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),因此使Shh基因的表達(dá)出現(xiàn)了異常。.【英文摘要】Sonic Hedgehog works like a morphogen

3、during the animal individual development. It functions in many organs, such as brain, spinal cord, thalamus, limb bud and epithelial cells. Recently reports show that in different tissues, different tissue specificity enhancers regulate shh expression. During limb bud shaping, the conserved ZRS sequ

4、ence locating IMbp upstream of the shh proximal promoter regulates shh expression as a long-range enhancer. And point mutation in this ZRS sequence would cause the preaxial p.【關(guān)鍵詞】【英文關(guān)鍵詞】Sonic hedgehog ZRS DAPA Luciferase Reporter Assay System Point Mutation【索購全文】聯(lián)系Q1：138113721 Q2：139938848【目錄】人Soni

5、c Hedgehog基因遠(yuǎn)距離增強(qiáng)子ZRS調(diào)節(jié)基因表達(dá)機(jī)制的初步研究中文摘要4-5Abstract5-6縮略詞10-11第1章 前言11-161.1 Sonic Hedgehog基因簡介11-131.2 shh基因表達(dá)調(diào)控模式簡介13-151.3 本課題的實驗?zāi)康?、意義和研究策略15-161.3.1 實驗?zāi)康暮鸵饬x151.3.2 研究策略15-16第2章 實驗材料和方法16-292.1 實驗材料16-192.1.1 菌種和載體162.1.2 人血液樣本162.1.3 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)基162.1.4 工具酶,試劑(盒)16-172.1.5 試劑的配制17-192.2 實驗儀器192.3 實驗方

6、法19-292.3.1 提取質(zhì)粒DNA202.3.2 切膠回收DNA20-212.3.3 純化PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物21-222.3.4 提取血液中的基因組DNA22-232.3.5 連接反應(yīng)232.3.6 質(zhì)粒DNA及連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞23-242.3.7 菌落PCR鑒定陽性克隆242.3.8 SDS-PAGE電泳24-252.3.9 細(xì)胞復(fù)蘇25-262.3.11 細(xì)胞凍存262.3.12 細(xì)胞計數(shù)26-272.3.13 HEK-293A細(xì)胞轉(zhuǎn)染272.3.14 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)27-29第3章 ZRS點(diǎn)突變的篩選29-363.1 從病人樣本中調(diào)取ZRS序列并測序分析29-32

7、3.1.1 實驗材料293.1.2 方法,結(jié)果及分析29-323.1.2.1 從病人血液樣本中抽提基因組DNA并進(jìn)行定量293.1.2.2 從提取的基因組中克隆帶有ZRS序列的DNA片段29-313.1.2.3 4個病患樣本中有2個出現(xiàn)了點(diǎn)突變31-323.2 病人樣本基因組shh基因外顯子序列的測序分析32-343.2.1 實驗材料323.2.2 方法、結(jié)果及分析32-343.3 表型正常人的ZRS序列突變分析34-353.3.1 實驗材料343.3.2 方法、結(jié)果及分析34-353.4 小結(jié)35-36第4章 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測ZRS突變型和野生型的增強(qiáng)子活性36-464.1 構(gòu)建pGL3-promoter-ZRS/BLZRS質(zhì)粒36-404.1.1 實驗材料364.1.2 方法,結(jié)果及分析36-404.2 轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞并檢測熒光素酶活性40-454.2.1 實驗材料404.2.2 方法,結(jié)果及分析40-454.3 小結(jié)45-46第5章 生物素標(biāo)記ZRS特異性捕獲與其作用的蛋白質(zhì)46-565.1 實驗材料465.2 方法,結(jié)果及分析46-565.2.1 制備帶有生物標(biāo)記的DNA探針并驗證標(biāo)記效率46-485.2.2 獲取HEK-293A非變性細(xì)胞核蛋白并定量48-505.2.3