人SonicHedgehog基因遠距離增強子ZRS調節(jié)基因

1、論文：人Sonic Hedgehog基因遠距離增強子ZRS調節(jié)基因表達機制的初步研究【中文摘要】Sonic Hedge基因在動物個體發(fā)育過程中起到形態(tài)發(fā)生素的作用,在多種器官和組織形成中發(fā)揮效用,如大腦,脊髓,丘腦,肢芽,上皮組織等,目前研究已經表明,在不同的組織中shh(Sonic Hedgehog)基因的表達是由不同的增強子序列調節(jié)起作用的。在肢芽中,shh的表達受到距離其上游1Mb遠的一段保守序列ZRS (ZPA regulatory sequence)的調節(jié),而當該序列內部出現(xiàn)點突變時,shh在肢芽部分的表達會發(fā)生變化,從而導致軸前多指畸形(PPD)這種嚴重遺傳病的出現(xiàn)。ZRS序列本身

2、非常保守,在人、小鼠、大鼠、雞、河豚中,目前已經有報道10個以上的點突變會引發(fā)肢芽部分的發(fā)育異常。本實驗從病人樣本的基因組中篩選到了一個沒有被報道過的點突變(3C>G),PCR擴增了兩種長度的含有點突變的DNA序列,并通過使用熒光素酶報告基因活性檢測系統(tǒng),在HEK-293A細胞中,發(fā)現(xiàn)具有點突變的ZRS序列和野生型的ZRS序列均具有增強子活性,而且活性是突變型的高于野生型的序列。對于這個突變體的生物信息學分析發(fā)現(xiàn),該點突變可能會改變這段增強子序列的轉錄因子結合位點,因此使Shh基因的表達出現(xiàn)了異常。.【英文摘要】Sonic Hedgehog works like a morphogen

3、during the animal individual development. It functions in many organs, such as brain, spinal cord, thalamus, limb bud and epithelial cells. Recently reports show that in different tissues, different tissue specificity enhancers regulate shh expression. During limb bud shaping, the conserved ZRS sequ

4、ence locating IMbp upstream of the shh proximal promoter regulates shh expression as a long-range enhancer. And point mutation in this ZRS sequence would cause the preaxial p.【關鍵詞】【英文關鍵詞】Sonic hedgehog ZRS DAPA Luciferase Reporter Assay System Point Mutation【索購全文】聯(lián)系Q1：138113721 Q2：139938848【目錄】人Soni

5、c Hedgehog基因遠距離增強子ZRS調節(jié)基因表達機制的初步研究中文摘要4-5Abstract5-6縮略詞10-11第1章 前言11-161.1 Sonic Hedgehog基因簡介11-131.2 shh基因表達調控模式簡介13-151.3 本課題的實驗目的、意義和研究策略15-161.3.1 實驗目的和意義151.3.2 研究策略15-16第2章 實驗材料和方法16-292.1 實驗材料16-192.1.1 菌種和載體162.1.2 人血液樣本162.1.3 細胞系和細胞培養(yǎng)基162.1.4 工具酶,試劑(盒)16-172.1.5 試劑的配制17-192.2 實驗儀器192.3 實驗方

6、法19-292.3.1 提取質粒DNA202.3.2 切膠回收DNA20-212.3.3 純化PCR產物及酶切產物21-222.3.4 提取血液中的基因組DNA22-232.3.5 連接反應232.3.6 質粒DNA及連接產物轉化感受態(tài)細胞23-242.3.7 菌落PCR鑒定陽性克隆242.3.8 SDS-PAGE電泳24-252.3.9 細胞復蘇25-262.3.11 細胞凍存262.3.12 細胞計數(shù)26-272.3.13 HEK-293A細胞轉染272.3.14 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)27-29第3章 ZRS點突變的篩選29-363.1 從病人樣本中調取ZRS序列并測序分析29-32

7、3.1.1 實驗材料293.1.2 方法,結果及分析29-323.1.2.1 從病人血液樣本中抽提基因組DNA并進行定量293.1.2.2 從提取的基因組中克隆帶有ZRS序列的DNA片段29-313.1.2.3 4個病患樣本中有2個出現(xiàn)了點突變31-323.2 病人樣本基因組shh基因外顯子序列的測序分析32-343.2.1 實驗材料323.2.2 方法、結果及分析32-343.3 表型正常人的ZRS序列突變分析34-353.3.1 實驗材料343.3.2 方法、結果及分析34-353.4 小結35-36第4章 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測ZRS突變型和野生型的增強子活性36-464.1 構建pGL3-promoter-ZRS/BLZRS質粒36-404.1.1 實驗材料364.1.2 方法,結果及分析36-404.2 轉染HEK-293A細胞并檢測熒光素酶活性40-454.2.1 實驗材料404.2.2 方法,結果及分析40-454.3 小結45-46第5章 生物素標記ZRS特異性捕獲與其作用的蛋白質46-565.1 實驗材料465.2 方法,結果及分析46-565.2.1 制備帶有生物標記的DNA探針并驗證標記效率46-485.2.2 獲取HEK-293A非變性細胞核蛋白并定量48-505.2.3