人表皮生長因子受體EGFR-醫(yī)療器械

1、附件1人表皮生長因子受體（EGFR）突變基因檢測試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則（征求意見稿）本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對人表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，以下簡稱為 EGFR 突變基因檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技 術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。本指導(dǎo)原則是針對EGFF突變基因檢測試劑的一般要求， 申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不 適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具 體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細(xì)化。本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不 包括注冊審批所涉及的行政事項

2、，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行， 如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但 需要詳細(xì)闡明理由，并對其科學(xué)合理性進行驗證，提供詳細(xì) 的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提 下使用本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水 平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的 不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。、范圍本指導(dǎo)原則所述 EGFR基因突變檢測試劑主要是指基于 核酸聚合酶鏈反應(yīng)（PCR，以EGFR突變基因為檢測目的， 體外定性檢測細(xì)胞學(xué)樣本、人體新鮮組織、冰凍組織、中性 福爾馬林固定石蠟包埋組織和外周血樣本、其他體液提取的 核酸組分中的EGFR

3、基因序列。EGFF是原癌基因c-erbB1的表達產(chǎn)物，是表皮生長因子 受體（HER家族成員之一。 HER家族由EGFR/HER1/erbB1、 HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3 及 HER4/erbB4 四個分子構(gòu)成， 在細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作 用。EGFR是 一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體激酶域激活與 癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等多種信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。肺腺癌 患者EGFR基因敏感突變亞裔人群陽性率要高于高加索人群。 EGFR突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶（TK）區(qū)域的前四個外顯子上（1821）,目前發(fā)現(xiàn)的 TK區(qū)域突變有30多種。缺 失突變主要發(fā)生在外

4、顯子 19 上，最常見的是 del E746-A750， 替代突變最常見的是發(fā)生在外顯子21上的L858R,復(fù)制或插入突變發(fā)生在外顯子 20上。其中外顯子 20上的T790M替代 突變?yōu)橐淮鶨GFR酪氨酸激酶抑制劑（ Tyrosine KinaseInhibitor , TKI）的耐藥突變。此外，還有許多類型的突變 臨床意義尚不明確。EGFR乍為癌癥治療的分子靶標(biāo)受到普遍 關(guān)注，并陸續(xù)開發(fā)出了吉非替尼( Gefitinib )、厄洛替尼 (Erlotinib )和埃克替尼( Icotinib )等 TKI 。腫瘤組織樣本仍是獲取腫瘤基因相關(guān)信息的主要來源， 但大部分晚期肺癌患者已失去手術(shù)機會或

5、由于種種原因不 能獲取腫瘤組織樣本。研究結(jié)果表明，實體腫瘤患者的外周 血中存在來源于凋亡、壞死的腫瘤細(xì)胞的游離DNA對晚期肺癌患者，在不能獲取肺癌組織樣本時，可以選擇外周血樣 本進行EGFR基因突變檢測；如可以獲得病理組織時，建議 以病理組織提取檢測結(jié)果優(yōu)先考慮。當(dāng)腫瘤組織難以獲取 時，外周血樣本可以是 EGFR基因突變檢測方式的重要補充 手段之一。本指導(dǎo)原則相關(guān)技術(shù)要求是圍繞基于熒光探針PCR方法的EGFR基因突變試劑進行評價，如基于熒光探針PCR原理的同類試劑不適用本指導(dǎo)原則部分相關(guān)技術(shù)要求，申請人應(yīng) 闡述不適用的理由并結(jié)合自身產(chǎn)品特性提出科學(xué)合理的評 價方法，并根據(jù)實際產(chǎn)品特性選擇合適的

6、方法或結(jié)合本指導(dǎo) 原則補充需要的評價和驗證。對于其他分子生物學(xué)檢測技 術(shù)，如適用，申請人可參考本指導(dǎo)原則部分相關(guān)技術(shù)要求進 行性能評價。本指導(dǎo)原則適用于進行首次注冊申報和相關(guān)許可事項 變更的產(chǎn)品。本指導(dǎo)原則不適用于EGFR基因拷貝數(shù)變化檢測、核酸序列測定、免疫組化技術(shù)、熒光原位雜交法。EFGR病理組織學(xué)樣本和外周血樣本檢測中存在差異性較大，在參考品及質(zhì)控品設(shè)臵、分析性能評估、臨床評價要 求、產(chǎn)品技術(shù)要求、 產(chǎn)品說明書等多個方面均存在不同要求， 為便于申請人對指導(dǎo)原則進行理解，故將產(chǎn)品預(yù)期用途用于 組織學(xué)樣本檢測和預(yù)期用途用于外周血樣本檢測試劑申報 要求進行分開說明。需要說明的是，申請人申報產(chǎn)品

7、如同時 包括外周血樣本和組織學(xué)樣本，對于相同部分，申請人可合 并提交注冊申報資料。如原注冊產(chǎn)品預(yù)期用途中僅為組織樣 本類型，現(xiàn)需增加 EGFR外周血樣本類型，考慮到外周血樣 本類型與組織樣本類型中 EGFR片段長度，樣本中突變比例 等差異，申請人除完成許可事項變更申報資料要求，還應(yīng)提 交擴增反應(yīng)體系性能，外周血分析性能評價，外周血樣本保 存及處理、性能評價等研究資料。申報試劑作為腫瘤藥物個體化伴隨檢測試劑，主要用于 人非小細(xì)胞肺癌（NSCLC個體化治療。如申請人將 EGFR申 報試劑運用于其他癌癥類型的研究；申請人可參照本指導(dǎo)原 則適用的研究體系，但應(yīng)強調(diào)的是，腫瘤藥物個體化檢測試 劑與治療藥

8、物具有關(guān)聯(lián)性，申請人因結(jié)合EGFR基因突變檢測與治療藥物預(yù)期用途所限定的癌癥類型進行聯(lián)合評價研 究。二、注冊申報資料要求（ 一 ） 綜述資料1. 產(chǎn)品預(yù)期用途。描述產(chǎn)品的預(yù)期用途，與預(yù)期用途 相關(guān)的臨床適應(yīng)癥背景情況，EGFF與不同人群之間的關(guān)聯(lián)，不同藥物對 EGFR患者治療效果描述。如臨床適應(yīng)癥的發(fā)生 率、易感人群等，相關(guān)的臨床或?qū)嶒炇以\斷方法等。2. 產(chǎn)品描述。描述產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理，主要原材 料的來源及制備方法，主要生產(chǎn)工藝過程，質(zhì)控品、校準(zhǔn)品 的制備方法情況。3. 有關(guān)生物安全性方面說明。由于體外診斷試劑中的 主要原材料可能是由各種動物、病原體、人源的組織和體液 等生物材料經(jīng)處理或者

9、添加某些物質(zhì)制備而成，人源性材料 須對有關(guān)傳染?。℉IV、HBV HCV等）病原體檢測予以說明， 并提供相關(guān)的證明文件。其他動物源及微生物來源的材料， 應(yīng)當(dāng)提供相應(yīng)的說明文件，證明其在產(chǎn)品運輸、使用過程中 對使用者和環(huán)境是安全的，并對上述原材料所采用的滅活等 試驗方法予以說明。4. 有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價。5. 其他。包括同類產(chǎn)品在國內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況。相 關(guān)產(chǎn)品所采用的技術(shù)方法及臨床應(yīng)用情況，申請注冊產(chǎn)品與 國內(nèi)外同類產(chǎn)品的異同等。對于新研制的體外診斷試劑產(chǎn) 品，需要提供被測物與預(yù)期適用的臨床適應(yīng)癥之間關(guān)系的文 獻資料。二）產(chǎn)品說明書說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、檢驗方

10、 法、檢驗結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導(dǎo)實驗室 工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解 釋的重要依據(jù)。產(chǎn)品說明書的格式及撰寫應(yīng)符合體外診斷 試劑說明書編寫指導(dǎo)原則（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通 告 2014 年第 17 號）要求，進口體外診斷試劑的中文說明書 除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性， 翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達習(xí)慣。產(chǎn)品說明書中相關(guān)技術(shù) 內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果 保持一致。如產(chǎn)品說明書中部分內(nèi)容引用自參考文獻，則應(yīng) 以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標(biāo)注，并列明所有引用文獻信息。結(jié)合體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則的要求，下 面對EG

11、FR基因突變檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細(xì)說 明，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地完成說明書編制。1. 【預(yù)期用途】1.1 本產(chǎn)品用于體外定性檢測中性福爾馬林固定石蠟包 埋（FFPF）的人非小細(xì)胞肺癌（NSCLC中腫瘤組織或外周 血或其他體液樣本的 EGFF不同外顯子中具體基因突變。1.2本產(chǎn)品檢測EGFR基因突變型別表達形式要求；對于 存在多個基因，建議列表表述，列明不同外顯子中基因的排 列順序。至少明確產(chǎn)品外顯子、突變位點、cosmic ID 、突變位點臨床意義（詳見表 1 ）。1.3 EGFR 基因突變檢測的目標(biāo)人群 : 推薦病理診斷為轉(zhuǎn)移性或進展期肺腺癌、含有腺癌成分、具有腺癌分化或不能

12、分型的NSCLC患者和不吸煙或活檢標(biāo)本較小或混合組織學(xué)形 態(tài)的鱗癌患者以及有必要進行分子檢測的鱗癌患者也應(yīng)進 行檢測。因肺癌個體化診療發(fā)展和研究不斷深入，該目標(biāo)人 群可能隨著個體化藥物和試劑發(fā)展研究而發(fā)生微調(diào)，建議申 請人參照最新肺癌研究指南或?qū)＜夜沧R。1.4 如申報試劑伴隨具體治療藥物聯(lián)合進行臨床試驗研 究，并證明兩者伴隨使用具有顯著的臨床治療意義，則可在 說明書中明確具體藥物及生產(chǎn)企業(yè)，并簡要介紹相關(guān)的臨床 患者受益情況。如申報試劑未伴隨具體治療藥物聯(lián)合進行臨床試驗研 究，應(yīng)在本項中注明該產(chǎn)品未與具體藥物聯(lián)合進行臨床試 驗，僅針對靶基因突變的檢測性能進行了驗證。如靶基因突變與腫瘤疾病及治療

13、方案的相關(guān)性描述來 自診療指南、書籍、文獻等資料，則在本項下應(yīng)注明參考資 料的出處，預(yù)期用途的相關(guān)表述中不應(yīng)涉及相關(guān)藥物生產(chǎn)企 業(yè)信息等。因EGFR基因突變檢測在不同種族之間突變頻率存在差異，此處所指臨床試驗研究均為境內(nèi)藥物個體化伴隨臨床研 究。如不同樣本類型，不同基因位點參與臨床伴隨研究情況 不同需分別進行描述，如EGFR組織檢測參與伴隨藥物臨床研究，EGFF血漿檢測未參與伴隨藥物臨床研究，需分開描述；如申報試劑包含 18 外顯子、 19 外顯子、 20 外顯子、 21 外顯 子，僅申報試劑 19 外顯子、 21 外顯子部分基因片段參與伴 隨藥物臨床研究，該試劑其它外顯子突變類別未參與伴隨藥

14、 物臨床研究，需分開描述。1.5因研究顯示，大部分（并非全部）晚期NSCLC患者的血液中存在循環(huán)游離 DNA（ cfDNA，cell free DNA。但血 液游離DNA片段通常較短，在晚期癌癥患者血液中濃度極低。 外周血樣本人群，需限定為晚期NSCLC組織樣本患者，且作為不能獲取NSCLCS織樣本時的補充手段。如可以獲得病理 組織時， 建議以病理組織提取結(jié)果優(yōu)先考慮。 如外周血 EGFR 檢測結(jié)果懷疑為假陰性時，建議采集該患者腫瘤組織樣本進 行復(fù)檢。1.6 臨床背景的介紹，包括相關(guān)適用人群特征、腫瘤的 組織類型、適用的樣本類型、待測靶基因序列的特征及選擇 依據(jù)，靶基因及其表達蛋白在惡性腫瘤發(fā)

15、生、發(fā)展過程中可 能起到的作用，相關(guān)藥物或其他治療技術(shù)及其作用機理、與 待測突變位點可能存在的關(guān)系等。1.7 明確說明該試劑盒僅用于對特定腫瘤患者靶基因序 列的檢測，其檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個體化 治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、 治療反應(yīng)及其他實驗室檢測指標(biāo)等因素對檢測結(jié)果進行綜合判斷。數(shù)據(jù)庫，等。2.2.1NCBI數(shù)據(jù)庫，SNP數(shù)據(jù)庫，HGV從類基因組數(shù)據(jù)庫【檢驗原理】對試劑盒檢測能夠覆蓋的所有突變位點或突變類型表1:列明申報試劑中所有 EGFR基因突變信息外顯氨基酸序列堿基序列變cosmic突變位點臨床18G719S2155GA18G719C2155GT1

16、8G719A2156GC19E746 A750d2235 2249d19E746 A750d2236 2250d19L747 P7532240 2257d19S747 S752d2239 2256d20T790M2369CT21L858R2573TG需標(biāo)明描述以上EGFR基因信息所使用的數(shù)據(jù)庫如：Cosmic進行詳細(xì)描述（靶序列長度、基因座位、突變類型及相關(guān)特 征等），對引物及探針設(shè)計、不同樣品反應(yīng)管組合、對照品 設(shè)臵及熒光信號檢測原理等進行逐項介紹。2.2核酸分離/純化方法、原理等。2.3試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進行說明。如添加了相關(guān)的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即

17、UDG/UNG），也應(yīng)對其作用機理作適當(dāng)介紹。3. 【主要組成成分】3.1詳細(xì)說明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、內(nèi)容物、 比例或濃度等信息，陰性 / 陽性對照品（或質(zhì)控品）可能含 有生物源性物質(zhì)的組分，應(yīng)說明其生物學(xué)來源、活性及其他 特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。3.2 試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，則應(yīng)在 此注明經(jīng)驗證后推薦配合使用的采血管，核酸分離 / 純化試 劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及該產(chǎn)品的醫(yī)療器械注冊證號 （如有）等詳細(xì)信息。如包含新鮮冰凍樣本，應(yīng)明確穿刺工 具，標(biāo)本處理試劑等信息。4. 【儲存條件及有效期】 試劑盒的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運輸

18、穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等。5. 【適用儀器】 所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以 指導(dǎo)用戶操作。6. 【樣本要求】EGFR基因突變檢測標(biāo)本一般采用腫瘤部位手術(shù)切除標(biāo) 本、活檢組織及細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。臨床取材方法主要包括手術(shù)、 纖維支氣管鏡下活檢、經(jīng)皮肺穿刺活檢、胸水、胸腔鏡、淋 巴結(jié)穿刺活檢、支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)細(xì)針穿刺活檢等。無法獲 取足夠腫瘤組織及細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的晚期肺腺癌患者，可用血液 標(biāo)本進行EGFR基因突變檢測。原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶均適合檢測。6.1 對組織學(xué)樣本類型作詳細(xì)介紹，包括樣本來源及取 材要求、組織標(biāo)本采集厚度、樣本處理方式（如組織樣本的 固定及包埋方式）、組織樣本采集量、腫瘤細(xì)胞

19、比例等。用 于腫瘤組織基因突變檢測的標(biāo)本，在進行分子檢測前，須對 腫瘤細(xì)胞進行評估 ， 富集腫瘤細(xì)胞用于核酸提取。如果為轉(zhuǎn) 移的腫瘤組織標(biāo)本，其形態(tài)學(xué)必須與原發(fā)灶的形態(tài)學(xué)一致。 腫瘤細(xì)胞所占比例需達到所用擴增檢測方法的要求。6.2 對外周血樣本作詳細(xì)介紹，包括樣本來源及采血要 求、外周血采集量、 外周血保存方式、 外周血樣本處理方式、 外周血采集管要求等。防腐劑、抗凝劑、保護劑及相關(guān)試劑 材料，外周血全血保存時間及溫度，離心參數(shù)等信息，血漿 保存時間及溫度等。6.3 如申報產(chǎn)品適用樣本類型中包括其他體液樣本或新 鮮組織樣本等應(yīng)詳細(xì)描述不同樣本類型樣本采集器具、采集 方式、樣本處理要求、注意事項

20、等。6.4 樣本處理及保存：核酸分離 / 純化前樣本的預(yù)處理、 保存條件及期限（短期、長期）、運輸條件等。6.5 在核酸分離 / 純化過程結(jié)束后，應(yīng)采用適當(dāng)方法對 分離/ 純化后的核酸儲備液進行質(zhì)量控制。比如，采用分光 光度計法對分離 / 純化后的核酸儲備液進行濃度、純度檢測， 并依據(jù)性能驗證結(jié)果在此給出用于擴增試驗的核酸溶液濃 度范圍要求。如分離 / 純化后的核酸儲備液質(zhì)量（如濃度范 圍）不符合要求，應(yīng)重新取材或擴大樣本量再進行核酸分離/ 純化。6.6 操作過程中各種制備液的穩(wěn)定性要求，如各類混合液（Mix）、DNA儲備液、反應(yīng)終體系等（常溫/冷藏/冷凍/凍 融次數(shù)限制等） 。7. 【檢驗方

21、法】詳細(xì)說明實驗操作的各個步驟，包括：7.1詳述FFPE組織樣本脫蠟過程，應(yīng)分別描述封固于載 玻片與未封固于載玻片（如有）的脫蠟步驟。7.2 試劑配制方法、注意事項。7.3 詳述核酸分離 / 純化的條件、 步驟及注意事項。 對照品（質(zhì)控品）應(yīng)參與樣本核酸的平行提?。ㄈ缬斜匾?，以對核酸分離 / 純化環(huán)節(jié)進行合理的質(zhì)量控制。7.4 擴增反應(yīng)前準(zhǔn)備：各組分加樣體積、順序、相關(guān)注 意事項等。7.5 PCR 各階段的溫度、時間設(shè)臵、循環(huán)數(shù)設(shè)臵及相關(guān) 注意事項。7.6 儀器設(shè)臵：特殊參數(shù)，待測基因、內(nèi)標(biāo)和對照品的 熒光通道選擇等。8. 【陽性判斷值】 陽性判斷值的描述包括基線的確定方法和閾值循環(huán)數(shù)（ C

22、t ）的要求。除 Ct 值要求外，建議結(jié)合是否出現(xiàn)典型 S 形曲線對結(jié)果進行判斷。9. 【檢驗結(jié)果的解釋】 結(jié)合陽性對照、陰性對照以及樣本管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的 檢測結(jié)果（ Ct 值），對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解 釋進行詳述。如存在檢測灰區(qū)，應(yīng)對灰區(qū)結(jié)果的處理方式一 并詳述。10. 【檢驗方法的局限性】10.1 本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考， 對患者個體化 治療的選擇應(yīng)結(jié)合其癥狀 / 體征、病史、其他實驗室檢查及 治療反應(yīng)等情況綜合考慮。10.2 陰性結(jié)果不能完全排除靶基因突變的存在， 樣本中 腫瘤細(xì)胞過少、核酸過度降解或擴增反應(yīng)體系中靶基因濃度 低于檢測限亦可造成陰性結(jié)果。10.3 腫

23、瘤組織（細(xì)胞）可能存在較大異質(zhì)性，不同部位 取樣可能會得到不同的檢測結(jié)果。10.4 不合理的樣本采集、 轉(zhuǎn)運及處理， 以及不當(dāng)?shù)脑囼?操作和實驗環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。10.5 明確該檢測僅限于規(guī)定的樣本類型及檢測系統(tǒng) （包 括適用機型、核酸分離 / 純化試劑、檢測方法等） 。10.6罕見EGFR突變基因檢測結(jié)果陽性對臨床用藥的指導(dǎo)，應(yīng)結(jié)合臨床個體化用藥研究進展綜合進行評價。10.7本檢測試劑不適用 EGFR拷貝數(shù)表達量的檢測。10.8本檢測試劑EGFR基因突變檢測范圍僅包括檢測試劑明確包含的已知的基因突變位點范圍，不包括檢測試劑盒 申明之外的基因突變位點的檢測。11. 【產(chǎn)品性能

24、指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：11.1 病理組織樣本類型性能指標(biāo)11.1.1 對相應(yīng)國家參考品（如有）檢測的符合情況。11.1.2 企業(yè)內(nèi)部陽性 / 陰性參考品符合率， 陽性 / 陰性參 考品的組成、來源、濃度梯度設(shè)臵以及評價標(biāo)準(zhǔn)等信息。11.1.3 最低檢測限： 說明在試劑盒規(guī)定的檢測條件及擴 增體系中，試劑盒能夠覆蓋的所有突變類別的最低檢出濃 度，重點考慮原始模板中突變基因的百分率和擴增終體系中 核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響；并介紹最低檢測限 的確定方法。11.1.4 精密度：精密度參考品的組成、來源、濃度梯度 要求及評價標(biāo)準(zhǔn)，不同濃度精密度參考品的檢測結(jié)果（正確 符合情況或變異系數(shù)） 。

25、11.1.5 分析特異性11.1.5.1 對分析性能評估中特異性研究內(nèi)容進行歸納。 核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其 他突變類型序列間交叉反應(yīng)、EGFR野生型DNA驗證、 非人類基因組驗證、肺相關(guān)感染微生物驗證等信息。11.1.5.2 潛在干擾物質(zhì)驗證如果經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)某些序列與靶序列的交叉反應(yīng)出現(xiàn)陽性結(jié)果，則應(yīng)該對存在交叉反應(yīng)的核酸序列及濃度進行驗證 并在產(chǎn)品說明書中表明這種假陽性發(fā)生的可能，做出相關(guān)的 提示。11.1.6 對比試驗研究（如有） ：簡要介紹參比試劑（方 法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。11.2 外周血樣本類型性能指標(biāo)11.2.1 對相應(yīng)國家參考品

26、（如有）檢測的符合情況。11.2.2 最低檢測限： 說明在試劑盒規(guī)定的檢測條件及擴 增體系中，試劑盒能夠覆蓋的所有突變類別的最低檢出濃 度，并簡單介紹最低檢測限的確定方法。11.2.3 企業(yè)內(nèi)部陽性 / 陰性參考品符合率， 陽性 /陰性參 考品的組成、來源、濃度梯度設(shè)臵以及評價標(biāo)準(zhǔn)等信息。11.2.4 精密度：精密度參考品的組成、來源、濃度梯度 要求及評價標(biāo)準(zhǔn)，不同濃度精密度參考品的檢測結(jié)果（正確 符合情況或變異系數(shù)） 。11.2.5 分析特異性11.2.5.1 對分析性能評估中特異性研究內(nèi)容進行歸納。 核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其 他突變類型序列間交叉反應(yīng)、EGFR野

27、生型DNA僉證、非人類基因組驗證、肺相關(guān)感染微生物驗證等信息。11.2.5.2 潛在干擾物質(zhì)驗證。如果經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)某些序列與靶序列的交叉反應(yīng)出現(xiàn)陽性結(jié)果，則應(yīng)該對存在交叉反應(yīng)的核酸序列及濃度進行驗證 并在產(chǎn)品說明書中表明這種假陽性發(fā)生的可能，做出相關(guān)的 提示。11.2.6 對比試驗研究（如有） ：簡要介紹參比試劑（方 法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。12. 【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：12.1 如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)， 應(yīng)給出具有潛 在感染性的警告。12.2 臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照 醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實 驗室管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā) , 2010? 194 號或現(xiàn)行有效版本

28、） 等有關(guān)分子生物學(xué)實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范 執(zhí)行。12.3 標(biāo)本的處理和檢測標(biāo)本的容器、 檢驗過程中使用的 材料的處理要符合醫(yī)療廢物管理條例和醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu) 醫(yī)療廢物管理辦法 ，以及國家、地區(qū)的相關(guān)要求。（三）主要原材料的研究資料應(yīng)體現(xiàn)EGFR基因突變檢測試劑主要組成成分中所有具體組分包含引物、探針、酶、反應(yīng)緩沖液、提取成分（如包 含）等；如為申請人自行研究主要原材料，申請人應(yīng)對 EGFR 序列確定，引物、探針選擇、酶研究等實驗過程予以詳述； 并提供對各主要原材料的功能性研究，如 : 外觀、純度、蛋 白濃度、功能性研究等。并對制備完成的原料成品進行質(zhì)量 檢驗以確認(rèn)其符合標(biāo)準(zhǔn)要求，整

29、個生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可控。如 為申請人外購主要原材料，應(yīng)詳述每一原材料外購方來源， 提交外購方出具的每種原材料性能指標(biāo)及質(zhì)量控制資料，并 詳述申請人對外購主要原材料的各指標(biāo)質(zhì)量要求以及確定 該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細(xì)依據(jù)。1. 核酸分離 / 純化組分（如有）的主要組成、原理介紹 及相關(guān)的驗證資料。2. PCR 組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其 他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實驗研究資料，主 要包括以下內(nèi)容：2.1 脫氧三磷酸核苷（ dNTP）核酸的組成成分，包括： dATP、 dUTP、 dGTP、dCTP 和 dTTP;應(yīng)提交對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗證資料。2.2

30、引物 應(yīng)優(yōu)化每一單一突變基因?qū)Ｓ靡锏南鄬舛龋苊舛?個核酸靶序列同時擴增時可能出現(xiàn)的相互影響和競爭。引物 設(shè)計時，應(yīng)對反應(yīng)體系中所有引物進行篩選，避免引物二聚 體形成。為保證每一靶序列檢測準(zhǔn)確性，EGFR僉測試劑中每一突變基因引物對濃度必須進行優(yōu)化，應(yīng)根據(jù)靶序列突變性 質(zhì)，C+G含量等確定每一突變基因引物長度和濃度，且單一引物最適濃度還應(yīng)考慮所有引物之間濃度的相互影響。由一 定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE或其他適宜方法純化。需提供對分子量、純度、穩(wěn)定性、功能性實驗等的 驗證資料。如為外購，還應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的

31、質(zhì)檢證明，如 PAGE結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC分析圖 譜。應(yīng)對引物結(jié)構(gòu)進行對比，引物擴增區(qū)段不應(yīng)有重復(fù)序列。2.3探針特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核 苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序 列的探測。合成后經(jīng)PAGE或其他適宜方法純化，在5-端（和 /或3-端）進行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化， 純度 應(yīng)達到HPLC純。應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物質(zhì)檢證明， 如HPLC分析圖譜，應(yīng)對探針的分子量、純度及標(biāo)記的熒光 素進行核實，并進行功能性試驗驗證。2.4酶DNA聚合酶，應(yīng)具有 DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活 性，具熱穩(wěn)定性，如：94 C保溫1小時

32、后仍保持50%S性； 尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG，具有水解尿嘧啶糖苷鍵 的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性；逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆 轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)對酶活性進行合理驗證。3. 核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（DNase和核糖核酸酶（RNase污染4. 企業(yè)內(nèi)部參考品： 企業(yè)內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測值可 溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過 程、定值研究、評價指標(biāo)、統(tǒng)計學(xué)分析等。申請人應(yīng)對內(nèi)部 陽性 / 陰性參考品的來源、基因序列設(shè)臵等信息進行精確的 實驗驗證，并提供參考品溯源過程的測量程序或參考方法的 相關(guān)信息及詳細(xì)的驗證資料

33、。申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證實 際情況自行設(shè)定內(nèi)部參考品，陽性參考品應(yīng)著重考慮 EGFR 基因突變型別要求，陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗證情況。如該類產(chǎn)品有國家標(biāo)準(zhǔn)品，在不 低于國家參考品要求前提下，研究人員可以結(jié)合實際情況設(shè) 臵合理內(nèi)部陽性 / 陰性參考品。具體要求如下：4.1 組織樣本參考品設(shè)臵要求4.1.1 陽性參考品 陽性參考品中常見基因突變位點（如： 19 外顯子 19del 和20外顯子（T790M、21外顯子（L858R）建議采用臨 床樣本提取的DNA儲備液或細(xì)胞系作為原料。其他突變位點 可采用DNA儲備液、細(xì)胞系或質(zhì)粒樣本作為原料。陽性參考 品中還應(yīng)設(shè)臵雙突變

34、陽性樣本類型，如：19del/L858R 、T790M/19del、T790M/L585R等。如采用質(zhì)粒作為陽性參考品， 應(yīng)盡可能模擬真實樣本，需要對樣本基質(zhì)進行基質(zhì)效應(yīng)研試劑盒(分型或不分型)所能覆蓋的所有突變位點均應(yīng) 設(shè)臵相應(yīng)的陽性參考品，每個突變位點設(shè)臵至少三個突變百 分率梯度，其中需包括至少高濃度和低濃度陽性參考品。陽 性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需經(jīng)過ddPCF或測序方法等進行確認(rèn)。4.1.2 陰性參考品可采用經(jīng)確認(rèn)無相應(yīng)靶突變序列的DNA儲存液。如野生型人基因組DNA HER家族DNA等。4.1.3 檢測限參考品檢測限參考品的原料要求參考陽性參考品，需包括所有 的突變類型。在進行最低

35、檢測限性能評估時，應(yīng)設(shè)臵多個梯 度，主要從擴增反應(yīng)終體系核酸濃度和突變序列所占百分率 兩個方面進行評價，建議采用95%( n 20)臵信區(qū)間的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)。 每種基因型別最低檢出限應(yīng)低于或至少檢出 10ng/ 反應(yīng)體系 中 5%突變比例。4.1.4 精密度參考品精密度參考品原料要求參考陽性參考品，需至少包括弱 陽性、中或強陽性水平的精密度驗證，中 / 強陽性精密度參 考品可不必包括所有突變類型，以常見突變類型(L858R、T790M、19dell )為主；建議設(shè)臵至少一種雙突變基因類型，同時設(shè)臵陰性參考品精密度驗證。4.1.5 提取內(nèi)對照參考品（如適用） 設(shè)臵專門的質(zhì)控管

36、對管家基因或其他源于人類基因組DNA的靶序列進行擴增，以對核酸分離/純化的質(zhì)量及效率進 行評估。4.2 外周血樣本參考品設(shè)臵要求4.2.1 陽性參考品 陽性參考品中常見基因突變位點（如： 19 外顯子 19del 和20外顯子（T790M、21外顯子（L858R）建議采用臨 床樣本提取的DNA儲備液或細(xì)胞系作為原料。陽性參考品中 還應(yīng)設(shè)臵雙突變陽性樣本類型，如：19del/L858R、 T790M/19del、T790M/L585R等。理論上應(yīng)采用血液中提取的 DNA作為該類產(chǎn)品參考品且覆蓋所有位點，但考慮外周血中 EGFF基因突變DNA含量較低，其他突變位點可以采用臨床樣 本提取的DNA儲備

37、液或細(xì)胞系或 EGFF突變基因擴增檢測 DNA 產(chǎn)物模擬樣本，樣本基質(zhì)應(yīng)為人血漿或人工模擬樣本，應(yīng)盡 可能模擬真實樣本， 使用人血漿時， 應(yīng)提前確認(rèn)人血漿中 DNA 背景濃度；使用人工模擬樣本時，應(yīng)參照人血漿成分進行配 臵，并對模擬樣本進行基質(zhì)效應(yīng)研究。試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點均應(yīng) 設(shè)臵相應(yīng)的陽性參考品，每個突變位點設(shè)臵至少三個突變百 分率梯度，其中需包括至少一份弱陽性參考品。陽性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需經(jīng)過 ddPCR或測序方法等進行確認(rèn)， 不建議用檢測試劑方法原理進行檢測。4.2.2 陰性參考品可采用經(jīng)確認(rèn)無相應(yīng)靶突變序列的 DNA儲存液。如野生 型人基因組DNA H

38、ER家族DNA等。4.2.3 檢測限參考品 檢測限參考品的原料要求參考陽性參考品，需包括所有的突變類型。在進行最低檢測限性能評估時，應(yīng)設(shè)臵多個梯 度，建議采用95% （n20）臵信區(qū)間的陽性檢出率作為最低 檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)。每種基因型別最低檢出限應(yīng)低于或至少 檢出 10ng/ 反應(yīng)體系 1%突變比例。4.2.4 精密度參考品 精密度參考品原料要求參考陽性參考品，需至少包括弱陽性、中或強陽性水平的精密度驗證，中 / 強陽性精密度參 考品可不必包括所有突變類型，以常見突變類型為主；建議 設(shè)臵至少一種雙突變基因類型，同時設(shè)臵陰性參考品精密度 驗證。4.2.5 提取內(nèi)對照參考品（如適用） 設(shè)臵專門的質(zhì)

39、控管對管家基因或其他源于人類基因組DNA的靶序列進行擴增，以對核酸分離/純化的質(zhì)量及效率進 行評估。5. 試劑盒內(nèi)對照品（質(zhì)控品）試劑盒的質(zhì)控體系通過設(shè)臵各種試劑盒對照品來實現(xiàn)， 質(zhì)控體系需考慮對樣本核酸分離 / 純化、配液及加樣、試劑 及儀器性能、擴增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶 核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結(jié)果進行合理 的質(zhì)量控制。對照品可采用質(zhì)粒、假病毒或臨床樣本的核酸 提取液等進行配臵。申報資料應(yīng)對試劑盒對照品有關(guān)原料選 擇、制備、定值過程等試驗資料詳細(xì)說明。申請人應(yīng)視申報 產(chǎn)品具體情況設(shè)臵合理的試劑盒對照品（質(zhì)控品），試劑盒 質(zhì)控體系主要考慮以下幾方面要求。5.1

40、組織樣本類型設(shè)臵要求5.1.1 陽性對照品（質(zhì)控品） 申請人應(yīng)對各種陽性對照品（質(zhì)控品）的 Ct 值做出明 確的范圍要求。如樣本反應(yīng)管內(nèi)可以覆蓋多種突變序列的檢 測（分型或不分型），相應(yīng)的陽性對照管可以不必涉及所有 突變類型，但應(yīng)選擇較常見突變序列或理論上較難測得的突 變序列作為陽性對照。以對樣本核酸分離 / 純化、試劑及儀 器性能、擴增反應(yīng)過程等環(huán)節(jié)進行質(zhì)量控制。陽性質(zhì)控品設(shè) 臵應(yīng)至少包括每個反應(yīng)管中一個或多個檢測被測物。5.1.2 陰性對照 陰性對照可以是含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可 以是空白對照，以對可能存在的交叉污染進行假陽性結(jié)果的 質(zhì)控。陰性對照品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。5.

41、1.3 內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)） 內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）可以對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進行 質(zhì)量控制，申請人應(yīng)對內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針和模板 濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線 又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。（四）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料 生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及 到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì) 控體系設(shè)臵、Ct （臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)，配制 工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均 勻，配制過程應(yīng)對pH電導(dǎo)率、離子濃度等關(guān)鍵參數(shù)進行有 效控制。主要包括以下內(nèi)容：1. 主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式

42、表示。2. 反應(yīng)原理介紹。3. 基因位點選擇、方法學(xué)特性介紹。4. 確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。5. 確定PCR反應(yīng)各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。 如反應(yīng)體系相同，多個突變基因在相同反應(yīng)條件下核酸擴增 效率是否存在差別。6. 對于基線閾值（threshold ）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確 定的研究資料。應(yīng)提供相同反應(yīng)條件下，多個基因類型是否Ct 相同7. 不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。8. 如申報產(chǎn)品包含核酸分離 / 純化試劑，應(yīng)提交對核酸 分離/ 純化過程進行工藝優(yōu)化的研究資料。（五）分析性能評估資料分析性能評估是

43、反映產(chǎn)品主要原材料選擇，生產(chǎn)工藝及 反應(yīng)體系等多方面因素設(shè)臵是否合理的客觀評價指標(biāo)。檢測 試劑性能的研究方案應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的反應(yīng)原理，臨床用途，使 用條件等綜合因素進行設(shè)計。性能研究應(yīng)涵蓋產(chǎn)品研制階段 對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方 法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。1. 病理組織學(xué)樣本類型1.1 最低檢測限組織學(xué)最低檢測限樣本類型應(yīng)包括擴增反應(yīng)終體系中 的突變序列百分率和申報產(chǎn)品反應(yīng)體系中總核酸濃度兩個 因素。對于常見基因突變類型建議采用EGFR基因突變型的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC中性福爾馬林固定石蠟包埋組織 （FFPE 和EGFR予生型的NSCLC FFPE羊本

44、制備DNA存儲液；對于罕 見基因突變類型，建議采用細(xì)胞株或人工合成樣本如： EGFR 細(xì)胞株或質(zhì)粒與 EGFR予生型NSCLC FFPE羊本樣本制備 DNA 存儲液。同時，還應(yīng)設(shè)臵幾種常見多突變類型與EGFR野生 型NSCLC FFPET羊本制備DNA存儲液。EGFR基因突變類型不同比例混合應(yīng)注意事項；每種基因突變類型羊本儲存液按照不同突變序列所占比例進行混合， 鑒于PCR核酸原理檢測靈敏度，此處主要針對EGFR基因突變類型低比例情況進行配比，如從10%或 8%起始按不同比例混合。至少包括目標(biāo)檢測限，和檢測限上下至少各 2 個梯度 比例范圍研究資料，對于按不同比例混合后的不同羊本，檢 測不同羊

45、本的實際混合比例并說明檢測方法，并以實際混合 比例做為下一步 EGFR 基因突變的最低靈敏度研究。同時， 在EFGR基因突變不同比例研究過程中應(yīng)設(shè)臵EGFR野生型樣本作為空白對照。確定反應(yīng)體系總樣本加樣量以及反應(yīng)體系中需要的 DNA 總濃度，申請人需說明每uL的DNA加樣量和總DNA濃度確定方法。在進行混合稀釋時，使用的 FFPE 樣本應(yīng)與原混合 配臵樣本類型相同。建議申請人設(shè)計一個顯著高于反應(yīng)體系 最高DNA加樣量的DNA存儲濃度。在實際的 EGFR不同基因 突變比例下，進行不同梯度DNA濃度的檢測，不同 DNA濃度各檢測至少3次，不同梯度DNA濃度范圍應(yīng)涵蓋申報產(chǎn)品反 應(yīng)體系中設(shè)定的最高

46、DNA濃度和最低DNA濃度。待確定組織 中最低檢出限后，在組織LOD水平附近額外檢測 20份平行樣本，確定95%臵信區(qū)間陽性檢出率的最低DNA濃度。申請人可用表格形式列明（如表2）表2最低檢測限驗證基因突變類型所檢測批次檢出率實際檢測突變細(xì)胞比例總DNA濃度/反應(yīng)體系檢測次 數(shù)突變比例ADNA濃度aDNA濃度bDNA濃度c以此類推突變比例BDNA濃度aDNA濃度bDNA濃度c以此類推突變比例CDNA濃度aDNA濃度bDNA濃度c以此類推以此類推DNA濃度aDNA濃度bDNA濃度c以此類推突變比例0DNA濃度0如申報產(chǎn)品存在不同的核酸提取方法，每種核酸 提取方法應(yīng)配套檢測試劑進行各基因突變類型最

47、低檢測限 驗證。如申報產(chǎn)品存在不同適用機型，每種適用機型應(yīng) 配套檢測試劑進行各基因突變類型最低檢測限驗證。1.1.3 組織切片的提取方法應(yīng)與說明書一致，如申報產(chǎn) 品適用于多種組織切片制作方法，最低檢測限應(yīng)對每種組織 切片制作方法進行驗證。1.2 分析特異性1.2.1 交叉反應(yīng) 該類產(chǎn)品主要與肺部腫瘤存在較強關(guān)聯(lián)性，申請人在設(shè) 計交叉反應(yīng)研究時應(yīng)將此點納入考慮。1.2.1.1 核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其他突變類型序列間交叉反應(yīng)。EGFF不同基因之間是否存在交叉反應(yīng)；EGFF家族之間是否存在交叉反應(yīng)；如多個不同基因聯(lián)合檢測試劑，應(yīng)檢測不同基因序列之間是否 存在交叉反應(yīng)；如

48、：人 EGFF/K-ras 突變基因聯(lián)合檢測試劑 盒（熒光PCR法），需檢測 EGFF和K-ras之間是否存在交 叉反應(yīng)。野生型人DNA如不同濃度的野生型 DNA核酸樣本； 非人類組基因驗證： 如大腸桿菌， 真核微生物 （酵母菌） 等； 肺相關(guān)感染微生物驗證：結(jié)核分支桿菌，肺炎鏈球菌和流感 嗜血桿菌1.2.1.2 申請人需檢測表 3 中列出具有潛在交叉反應(yīng)的 病毒體和人基因序列。病原體需在有臨床意義相關(guān)濃度檢 測，細(xì)菌濃度水平建議至少106 cfu/ml ，病毒濃度水平建議至少 105 cfu/ml 。需明確進行交叉反應(yīng)病毒或細(xì)菌類型及滴度。人野生型 DNA至少包含100ng/ul野生型核酸樣

49、本，應(yīng) 提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的突變或野生型序列來源、序列 確認(rèn)和濃度選擇等試驗資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗證的信息應(yīng)在 產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項中有所體現(xiàn)。表3潛在交叉反應(yīng)研究EGFF不同突變基因型肺炎鏈球菌野生型DNA流感嗜血桿菌大腸桿菌HER-2酵母菌HER-3結(jié)核分支桿菌HER-4122干擾物質(zhì)122.1申請人應(yīng)根據(jù)試劑盒所采用的樣本類型，確定 潛在的干擾物質(zhì)。常見治療藥物，樣本穿刺過程的緩沖液，處理液等，組 織處理過程中的緩沖液。（見表 4）1.2.2.2 用于干擾試驗的樣本，靶基因濃度應(yīng)至少包含 弱陽性，而不應(yīng)僅選擇強陽性樣本，使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干 擾物質(zhì)進行驗證。此外，建議申請人

50、同時在每種干擾物質(zhì)的 潛在最大濃度（“最差條件”）條件下同樣進行評價。表4潛在干擾物研究甘油二酯乙醇血紅蛋白二甲基亞砜（DMSO福爾馬林焦炭酸二乙酯（DEPC石蠟沙丁胺醇(albuterol )二甲基異丙托溴銨(Ipratropium )蛋白酶K氟替卡松(Fluticasone )亞胺培南(Imipenem)頭孢他啶(Ceftazidime )氧哌嗪青霉素(piperacillin)聚維酮碘溶液(Betadine)三唑巴坦(tazobactam)利多卡因(lidocaine ).1.3精密度申請人應(yīng)對每項精密度指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求， 如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。具體實驗方法可以參考國際

51、或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進行。針對本類產(chǎn) 品的精密度評價主要包括以下要求。對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除 申報試劑(包括核酸分離 /純化組分)本身的影響外，還應(yīng) 對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關(guān)的驗證。132合理的精密度評價周期， 例如：為期至少12天的 連續(xù)檢測，每天至少由 2人完成不少于2次的完整檢測，從 而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進 行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實驗室進行重 復(fù)實驗以對室間精密度進行評價。133用于精密度評價的參考品應(yīng)至少包括弱陽性參考 品和高濃度參考品3個水平，如有必要，建議同時設(shè)臵陰性參考品進行驗

52、證，要求如下1.3.3.1 陰性參考品：待測靶核酸濃度低于最低檢測限 或為零濃度，建議選用背景值較高的陰性樣本，陰性符合率 應(yīng)為 100% （n20）。1.3.3.2 弱陽性參考品：待測靶核酸濃度略高于試劑盒 的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)達到 100%（n 20）。（弱陽 性參考品需包括所有的突變位點， 如果待測物靶核酸為 RNA， 則弱陽性精密度參考品中應(yīng)至少部分典型突變位點的原料為RNA如RNA干粉或相應(yīng)的假病毒）1.3.3.3 高濃度參考品：待測靶核酸呈中到強陽性的濃度，陽性檢出率為 100%且 CVC 15%（ n 20）。（如果試劑 盒可以覆蓋多個突變位點的檢測，該參考品可以設(shè)臵為對全

53、 部突變位點進行精密度驗證，也可以選擇其中部分突變位點 進行驗證，但應(yīng)至少包含常見突變序列或理論上較難測得的 突變序列）1.4 陽性 / 陰性參考品符合率各水平、各突變位點的陽性參考品均應(yīng)按要求檢出陽 性，考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對各水平陽性參考品設(shè)臵相 應(yīng) Ct 值的限制；陰性參考品在各個引物探針組合的檢測條 件下均應(yīng)檢出為陰性；如有野生型參考品的設(shè)臵，在其相應(yīng) 的引物探針組合下檢測應(yīng)為陽性。1.5 樣本的穩(wěn)定性1.5.1 樣本提取前核酸序列的穩(wěn)定性 對于經(jīng)福爾馬林石蠟包埋組織切片樣本，申請人應(yīng)對組 織樣本保存溫度，保存年限進行限定。應(yīng)規(guī)定組織切片的厚 度，制作方法，對經(jīng)臨床機構(gòu)確定的組織切

54、片進行提取。驗 證不同時間段保存的組織樣本對檢測結(jié)果的影響；對于新鮮冰凍切片樣本，應(yīng)限定新鮮冰凍切片樣本檢測 時限；新鮮冰凍切片的切片要求。1.5.2 樣本核酸提取評價要求 申報試劑配套樣本處理試劑的重復(fù)性，對同一 NSCLCFFPET組織樣本中段部分平行切去 10份切片樣本，設(shè)臵評價 方案，評價指標(biāo)，評價樣本核酸提取過程的重復(fù)性。樣本核酸的分離 / 純化主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，樣本核酸分離/純化是決定后續(xù)核酸擴增 過程成敗的要素之一。石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過 程中，會使樣品中的核酸與核酸之間，核酸與蛋白之間發(fā)

55、生 交聯(lián)；由于不同組織蛋白種類和含量存在差異，不同組織核 酸提取試劑可能也有所不同。因此，無論申報產(chǎn)品是否含有 核酸分離 /純化的組分，申請人都應(yīng)對核酸分離 /純化環(huán)節(jié)做 充分的驗證。除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純 化步驟，盡可能去除 PCR抑制物。常見的核酸分離純化均有 其優(yōu)勢和不足，申請人應(yīng)結(jié)合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇核酸分離 / 純化試劑，并提供詳細(xì)的驗證資料。1.5.3 樣本提取后核酸序列的穩(wěn)定性。樣本提取后核酸序列的穩(wěn)定性。應(yīng)檢測核酸的含量，設(shè) 臵反應(yīng)體系需要的核酸含量上限和下限。如反應(yīng)體系中起始 DNA濃度過高，可能導(dǎo)致反應(yīng)體系發(fā)生非特異性擴增，產(chǎn)生 假陽性結(jié)果。如反應(yīng)體

56、系中起始DNA濃度過低，可能導(dǎo)致反應(yīng)體系無靶序列擴增反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。紫外 - 可見分 光光度計對 DNA濃度進行定量，260 nm/280 nm 處的吸光度 比值（OD260/OD280或通過其他方法評價其純度。設(shè)臵反 應(yīng)體系所需初始 DNA濃度范圍，如單位體積 DNA濃度超過所 需濃度上限或下限，應(yīng)提供相應(yīng)的改進措施。同時，應(yīng)對核 酸提取物的保存時間， 保存溫度進行驗證。 并評價凍融次數(shù)， 儲存條件等對樣本提取后核酸序列穩(wěn)定性的影響。1.5.4 樣本完整性 在樣本提取前和提取過程、提取后，以及在儲存期間， 核酸會發(fā)生不同程度地降解。為使降解降低到最低程度（提 取前或提取后） ，應(yīng)避免樣品的多次冷凍 / 融化。必要時，申 請人應(yīng)評價提取前，提取后凍融次數(shù)，儲存條件等因素。在 長時間儲存后，應(yīng)在使用前評價核酸的完整性。比較檢測結(jié) 果與儲存前檢測結(jié)果的一致性，可采用瓊脂糖凝膠電泳或者 內(nèi)參基因PCR僉測等方法