人表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR-醫(yī)療器械

1、附件1人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變基因檢測(cè)試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則（征求意見(jiàn)稿）本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，以下簡(jiǎn)稱為 EGFR 突變基因檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技 術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。本指導(dǎo)原則是針對(duì)EGFF突變基因檢測(cè)試劑的一般要求， 申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不 適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具 體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不 包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)

2、，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行， 如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但 需要詳細(xì)闡明理由，并對(duì)其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì) 的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提 下使用本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水 平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的 不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。、范圍本指導(dǎo)原則所述 EGFR基因突變檢測(cè)試劑主要是指基于 核酸聚合酶鏈反應(yīng)（PCR，以EGFR突變基因?yàn)闄z測(cè)目的， 體外定性檢測(cè)細(xì)胞學(xué)樣本、人體新鮮組織、冰凍組織、中性 福爾馬林固定石蠟包埋組織和外周血樣本、其他體液提取的 核酸組分中的EGFR

3、基因序列。EGFF是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長(zhǎng)因子 受體（HER家族成員之一。 HER家族由EGFR/HER1/erbB1、 HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3 及 HER4/erbB4 四個(gè)分子構(gòu)成， 在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作 用。EGFR是 一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體激酶域激活與 癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等多種信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。肺腺癌 患者EGFR基因敏感突變亞裔人群陽(yáng)性率要高于高加索人群。 EGFR突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶（TK）區(qū)域的前四個(gè)外顯子上（1821）,目前發(fā)現(xiàn)的 TK區(qū)域突變有30多種。缺 失突變主要發(fā)生在外

4、顯子 19 上，最常見(jiàn)的是 del E746-A750， 替代突變最常見(jiàn)的是發(fā)生在外顯子21上的L858R,復(fù)制或插入突變發(fā)生在外顯子 20上。其中外顯子 20上的T790M替代 突變?yōu)橐淮鶨GFR酪氨酸激酶抑制劑（ Tyrosine KinaseInhibitor , TKI）的耐藥突變。此外，還有許多類型的突變 臨床意義尚不明確。EGFR乍為癌癥治療的分子靶標(biāo)受到普遍 關(guān)注，并陸續(xù)開(kāi)發(fā)出了吉非替尼( Gefitinib )、厄洛替尼 (Erlotinib )和?？颂婺? Icotinib )等 TKI 。腫瘤組織樣本仍是獲取腫瘤基因相關(guān)信息的主要來(lái)源， 但大部分晚期肺癌患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì)或

5、由于種種原因不 能獲取腫瘤組織樣本。研究結(jié)果表明，實(shí)體腫瘤患者的外周 血中存在來(lái)源于凋亡、壞死的腫瘤細(xì)胞的游離DNA對(duì)晚期肺癌患者，在不能獲取肺癌組織樣本時(shí)，可以選擇外周血樣 本進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)；如可以獲得病理組織時(shí)，建議 以病理組織提取檢測(cè)結(jié)果優(yōu)先考慮。當(dāng)腫瘤組織難以獲取 時(shí)，外周血樣本可以是 EGFR基因突變檢測(cè)方式的重要補(bǔ)充 手段之一。本指導(dǎo)原則相關(guān)技術(shù)要求是圍繞基于熒光探針PCR方法的EGFR基因突變?cè)噭┻M(jìn)行評(píng)價(jià)，如基于熒光探針PCR原理的同類試劑不適用本指導(dǎo)原則部分相關(guān)技術(shù)要求，申請(qǐng)人應(yīng) 闡述不適用的理由并結(jié)合自身產(chǎn)品特性提出科學(xué)合理的評(píng) 價(jià)方法，并根據(jù)實(shí)際產(chǎn)品特性選擇合適的

6、方法或結(jié)合本指導(dǎo) 原則補(bǔ)充需要的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。對(duì)于其他分子生物學(xué)檢測(cè)技 術(shù)，如適用，申請(qǐng)人可參考本指導(dǎo)原則部分相關(guān)技術(shù)要求進(jìn) 行性能評(píng)價(jià)。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng) 變更的產(chǎn)品。本指導(dǎo)原則不適用于EGFR基因拷貝數(shù)變化檢測(cè)、核酸序列測(cè)定、免疫組化技術(shù)、熒光原位雜交法。EFGR病理組織學(xué)樣本和外周血樣本檢測(cè)中存在差異性較大，在參考品及質(zhì)控品設(shè)臵、分析性能評(píng)估、臨床評(píng)價(jià)要 求、產(chǎn)品技術(shù)要求、 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)等多個(gè)方面均存在不同要求， 為便于申請(qǐng)人對(duì)指導(dǎo)原則進(jìn)行理解，故將產(chǎn)品預(yù)期用途用于 組織學(xué)樣本檢測(cè)和預(yù)期用途用于外周血樣本檢測(cè)試劑申報(bào) 要求進(jìn)行分開(kāi)說(shuō)明。需要說(shuō)明的是，申請(qǐng)人申報(bào)產(chǎn)品

7、如同時(shí) 包括外周血樣本和組織學(xué)樣本，對(duì)于相同部分，申請(qǐng)人可合 并提交注冊(cè)申報(bào)資料。如原注冊(cè)產(chǎn)品預(yù)期用途中僅為組織樣 本類型，現(xiàn)需增加 EGFR外周血樣本類型，考慮到外周血樣 本類型與組織樣本類型中 EGFR片段長(zhǎng)度，樣本中突變比例 等差異，申請(qǐng)人除完成許可事項(xiàng)變更申報(bào)資料要求，還應(yīng)提 交擴(kuò)增反應(yīng)體系性能，外周血分析性能評(píng)價(jià)，外周血樣本保 存及處理、性能評(píng)價(jià)等研究資料。申報(bào)試劑作為腫瘤藥物個(gè)體化伴隨檢測(cè)試劑，主要用于 人非小細(xì)胞肺癌（NSCLC個(gè)體化治療。如申請(qǐng)人將 EGFR申 報(bào)試劑運(yùn)用于其他癌癥類型的研究；申請(qǐng)人可參照本指導(dǎo)原 則適用的研究體系，但應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，腫瘤藥物個(gè)體化檢測(cè)試 劑與治療藥

8、物具有關(guān)聯(lián)性，申請(qǐng)人因結(jié)合EGFR基因突變檢測(cè)與治療藥物預(yù)期用途所限定的癌癥類型進(jìn)行聯(lián)合評(píng)價(jià)研 究。二、注冊(cè)申報(bào)資料要求（ 一 ） 綜述資料1. 產(chǎn)品預(yù)期用途。描述產(chǎn)品的預(yù)期用途，與預(yù)期用途 相關(guān)的臨床適應(yīng)癥背景情況，EGFF與不同人群之間的關(guān)聯(lián)，不同藥物對(duì) EGFR患者治療效果描述。如臨床適應(yīng)癥的發(fā)生 率、易感人群等，相關(guān)的臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷方法等。2. 產(chǎn)品描述。描述產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理，主要原材 料的來(lái)源及制備方法，主要生產(chǎn)工藝過(guò)程，質(zhì)控品、校準(zhǔn)品 的制備方法情況。3. 有關(guān)生物安全性方面說(shuō)明。由于體外診斷試劑中的 主要原材料可能是由各種動(dòng)物、病原體、人源的組織和體液 等生物材料經(jīng)處理或者

9、添加某些物質(zhì)制備而成，人源性材料 須對(duì)有關(guān)傳染?。℉IV、HBV HCV等）病原體檢測(cè)予以說(shuō)明， 并提供相關(guān)的證明文件。其他動(dòng)物源及微生物來(lái)源的材料， 應(yīng)當(dāng)提供相應(yīng)的說(shuō)明文件，證明其在產(chǎn)品運(yùn)輸、使用過(guò)程中 對(duì)使用者和環(huán)境是安全的，并對(duì)上述原材料所采用的滅活等 試驗(yàn)方法予以說(shuō)明。4. 有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)。5. 其他。包括同類產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況。相 關(guān)產(chǎn)品所采用的技術(shù)方法及臨床應(yīng)用情況，申請(qǐng)注冊(cè)產(chǎn)品與 國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品的異同等。對(duì)于新研制的體外診斷試劑產(chǎn) 品，需要提供被測(cè)物與預(yù)期適用的臨床適應(yīng)癥之間關(guān)系的文 獻(xiàn)資料。二）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)說(shuō)明書(shū)承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、檢驗(yàn)方

10、 法、檢驗(yàn)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室 工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解 釋的重要依據(jù)。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的格式及撰寫(xiě)應(yīng)符合體外診斷 試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通 告 2014 年第 17 號(hào)）要求，進(jìn)口體外診斷試劑的中文說(shuō)明書(shū) 除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書(shū)的一致性， 翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中相關(guān)技術(shù) 內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果 保持一致。如產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中部分內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng) 以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并列明所有引用文獻(xiàn)信息。結(jié)合體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則的要求，下 面對(duì)EG

11、FR基因突變檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō) 明，以指導(dǎo)注冊(cè)申報(bào)人員更合理地完成說(shuō)明書(shū)編制。1. 【預(yù)期用途】1.1 本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)中性福爾馬林固定石蠟包 埋（FFPF）的人非小細(xì)胞肺癌（NSCLC中腫瘤組織或外周 血或其他體液樣本的 EGFF不同外顯子中具體基因突變。1.2本產(chǎn)品檢測(cè)EGFR基因突變型別表達(dá)形式要求；對(duì)于 存在多個(gè)基因，建議列表表述，列明不同外顯子中基因的排 列順序。至少明確產(chǎn)品外顯子、突變位點(diǎn)、cosmic ID 、突變位點(diǎn)臨床意義（詳見(jiàn)表 1 ）。1.3 EGFR 基因突變檢測(cè)的目標(biāo)人群 : 推薦病理診斷為轉(zhuǎn)移性或進(jìn)展期肺腺癌、含有腺癌成分、具有腺癌分化或不能

12、分型的NSCLC患者和不吸煙或活檢標(biāo)本較小或混合組織學(xué)形 態(tài)的鱗癌患者以及有必要進(jìn)行分子檢測(cè)的鱗癌患者也應(yīng)進(jìn) 行檢測(cè)。因肺癌個(gè)體化診療發(fā)展和研究不斷深入，該目標(biāo)人 群可能隨著個(gè)體化藥物和試劑發(fā)展研究而發(fā)生微調(diào)，建議申 請(qǐng)人參照最新肺癌研究指南或?qū)＜夜沧R(shí)。1.4 如申報(bào)試劑伴隨具體治療藥物聯(lián)合進(jìn)行臨床試驗(yàn)研 究，并證明兩者伴隨使用具有顯著的臨床治療意義，則可在 說(shuō)明書(shū)中明確具體藥物及生產(chǎn)企業(yè)，并簡(jiǎn)要介紹相關(guān)的臨床 患者受益情況。如申報(bào)試劑未伴隨具體治療藥物聯(lián)合進(jìn)行臨床試驗(yàn)研 究，應(yīng)在本項(xiàng)中注明該產(chǎn)品未與具體藥物聯(lián)合進(jìn)行臨床試 驗(yàn)，僅針對(duì)靶基因突變的檢測(cè)性能進(jìn)行了驗(yàn)證。如靶基因突變與腫瘤疾病及治療

13、方案的相關(guān)性描述來(lái) 自診療指南、書(shū)籍、文獻(xiàn)等資料，則在本項(xiàng)下應(yīng)注明參考資 料的出處，預(yù)期用途的相關(guān)表述中不應(yīng)涉及相關(guān)藥物生產(chǎn)企 業(yè)信息等。因EGFR基因突變檢測(cè)在不同種族之間突變頻率存在差異，此處所指臨床試驗(yàn)研究均為境內(nèi)藥物個(gè)體化伴隨臨床研 究。如不同樣本類型，不同基因位點(diǎn)參與臨床伴隨研究情況 不同需分別進(jìn)行描述，如EGFR組織檢測(cè)參與伴隨藥物臨床研究，EGFF血漿檢測(cè)未參與伴隨藥物臨床研究，需分開(kāi)描述；如申報(bào)試劑包含 18 外顯子、 19 外顯子、 20 外顯子、 21 外顯 子，僅申報(bào)試劑 19 外顯子、 21 外顯子部分基因片段參與伴 隨藥物臨床研究，該試劑其它外顯子突變類別未參與伴隨藥

14、 物臨床研究，需分開(kāi)描述。1.5因研究顯示，大部分（并非全部）晚期NSCLC患者的血液中存在循環(huán)游離 DNA（ cfDNA，cell free DNA。但血 液游離DNA片段通常較短，在晚期癌癥患者血液中濃度極低。 外周血樣本人群，需限定為晚期NSCLC組織樣本患者，且作為不能獲取NSCLCS織樣本時(shí)的補(bǔ)充手段。如可以獲得病理 組織時(shí)， 建議以病理組織提取結(jié)果優(yōu)先考慮。 如外周血 EGFR 檢測(cè)結(jié)果懷疑為假陰性時(shí)，建議采集該患者腫瘤組織樣本進(jìn) 行復(fù)檢。1.6 臨床背景的介紹，包括相關(guān)適用人群特征、腫瘤的 組織類型、適用的樣本類型、待測(cè)靶基因序列的特征及選擇 依據(jù)，靶基因及其表達(dá)蛋白在惡性腫瘤發(fā)

15、生、發(fā)展過(guò)程中可 能起到的作用，相關(guān)藥物或其他治療技術(shù)及其作用機(jī)理、與 待測(cè)突變位點(diǎn)可能存在的關(guān)系等。1.7 明確說(shuō)明該試劑盒僅用于對(duì)特定腫瘤患者靶基因序 列的檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個(gè)體化 治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、 治療反應(yīng)及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。數(shù)據(jù)庫(kù)，等。2.2.1NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，HGV從類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)【檢驗(yàn)原理】對(duì)試劑盒檢測(cè)能夠覆蓋的所有突變位點(diǎn)或突變類型表1:列明申報(bào)試劑中所有 EGFR基因突變信息外顯氨基酸序列堿基序列變cosmic突變位點(diǎn)臨床18G719S2155GA18G719C2155GT1

16、8G719A2156GC19E746 A750d2235 2249d19E746 A750d2236 2250d19L747 P7532240 2257d19S747 S752d2239 2256d20T790M2369CT21L858R2573TG需標(biāo)明描述以上EGFR基因信息所使用的數(shù)據(jù)庫(kù)如：Cosmic進(jìn)行詳細(xì)描述（靶序列長(zhǎng)度、基因座位、突變類型及相關(guān)特 征等），對(duì)引物及探針設(shè)計(jì)、不同樣品反應(yīng)管組合、對(duì)照品 設(shè)臵及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行逐項(xiàng)介紹。2.2核酸分離/純化方法、原理等。2.3試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明。如添加了相關(guān)的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即

17、UDG/UNG），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理作適當(dāng)介紹。3. 【主要組成成分】3.1詳細(xì)說(shuō)明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、內(nèi)容物、 比例或濃度等信息，陰性 / 陽(yáng)性對(duì)照品（或質(zhì)控品）可能含 有生物源性物質(zhì)的組分，應(yīng)說(shuō)明其生物學(xué)來(lái)源、活性及其他 特性；說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。3.2 試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組分，則應(yīng)在 此注明經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的采血管，核酸分離 / 純化試 劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及該產(chǎn)品的醫(yī)療器械注冊(cè)證號(hào) （如有）等詳細(xì)信息。如包含新鮮冰凍樣本，應(yīng)明確穿刺工 具，標(biāo)本處理試劑等信息。4. 【儲(chǔ)存條件及有效期】 試劑盒的效期穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸

18、穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等。5. 【適用儀器】 所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以 指導(dǎo)用戶操作。6. 【樣本要求】EGFR基因突變檢測(cè)標(biāo)本一般采用腫瘤部位手術(shù)切除標(biāo) 本、活檢組織及細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。臨床取材方法主要包括手術(shù)、 纖維支氣管鏡下活檢、經(jīng)皮肺穿刺活檢、胸水、胸腔鏡、淋 巴結(jié)穿刺活檢、支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)細(xì)針穿刺活檢等。無(wú)法獲 取足夠腫瘤組織及細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的晚期肺腺癌患者，可用血液 標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)。原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶均適合檢測(cè)。6.1 對(duì)組織學(xué)樣本類型作詳細(xì)介紹，包括樣本來(lái)源及取 材要求、組織標(biāo)本采集厚度、樣本處理方式（如組織樣本的 固定及包埋方式）、組織樣本采集量、腫瘤細(xì)胞

19、比例等。用 于腫瘤組織基因突變檢測(cè)的標(biāo)本，在進(jìn)行分子檢測(cè)前，須對(duì) 腫瘤細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估 ， 富集腫瘤細(xì)胞用于核酸提取。如果為轉(zhuǎn) 移的腫瘤組織標(biāo)本，其形態(tài)學(xué)必須與原發(fā)灶的形態(tài)學(xué)一致。 腫瘤細(xì)胞所占比例需達(dá)到所用擴(kuò)增檢測(cè)方法的要求。6.2 對(duì)外周血樣本作詳細(xì)介紹，包括樣本來(lái)源及采血要 求、外周血采集量、 外周血保存方式、 外周血樣本處理方式、 外周血采集管要求等。防腐劑、抗凝劑、保護(hù)劑及相關(guān)試劑 材料，外周血全血保存時(shí)間及溫度，離心參數(shù)等信息，血漿 保存時(shí)間及溫度等。6.3 如申報(bào)產(chǎn)品適用樣本類型中包括其他體液樣本或新 鮮組織樣本等應(yīng)詳細(xì)描述不同樣本類型樣本采集器具、采集 方式、樣本處理要求、注意事項(xiàng)

20、等。6.4 樣本處理及保存：核酸分離 / 純化前樣本的預(yù)處理、 保存條件及期限（短期、長(zhǎng)期）、運(yùn)輸條件等。6.5 在核酸分離 / 純化過(guò)程結(jié)束后，應(yīng)采用適當(dāng)方法對(duì) 分離/ 純化后的核酸儲(chǔ)備液進(jìn)行質(zhì)量控制。比如，采用分光 光度計(jì)法對(duì)分離 / 純化后的核酸儲(chǔ)備液進(jìn)行濃度、純度檢測(cè)， 并依據(jù)性能驗(yàn)證結(jié)果在此給出用于擴(kuò)增試驗(yàn)的核酸溶液濃 度范圍要求。如分離 / 純化后的核酸儲(chǔ)備液質(zhì)量（如濃度范 圍）不符合要求，應(yīng)重新取材或擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行核酸分離/ 純化。6.6 操作過(guò)程中各種制備液的穩(wěn)定性要求，如各類混合液（Mix）、DNA儲(chǔ)備液、反應(yīng)終體系等（常溫/冷藏/冷凍/凍 融次數(shù)限制等） 。7. 【檢驗(yàn)方

21、法】詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：7.1詳述FFPE組織樣本脫蠟過(guò)程，應(yīng)分別描述封固于載 玻片與未封固于載玻片（如有）的脫蠟步驟。7.2 試劑配制方法、注意事項(xiàng)。7.3 詳述核酸分離 / 純化的條件、 步驟及注意事項(xiàng)。 對(duì)照品（質(zhì)控品）應(yīng)參與樣本核酸的平行提?。ㄈ缬斜匾?，以對(duì)核酸分離 / 純化環(huán)節(jié)進(jìn)行合理的質(zhì)量控制。7.4 擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：各組分加樣體積、順序、相關(guān)注 意事項(xiàng)等。7.5 PCR 各階段的溫度、時(shí)間設(shè)臵、循環(huán)數(shù)設(shè)臵及相關(guān) 注意事項(xiàng)。7.6 儀器設(shè)臵：特殊參數(shù)，待測(cè)基因、內(nèi)標(biāo)和對(duì)照品的 熒光通道選擇等。8. 【陽(yáng)性判斷值】 陽(yáng)性判斷值的描述包括基線的確定方法和閾值循環(huán)數(shù)（ C

22、t ）的要求。除 Ct 值要求外，建議結(jié)合是否出現(xiàn)典型 S 形曲線對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。9. 【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】 結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以及樣本管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的 檢測(cè)結(jié)果（ Ct 值），對(duì)所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解 釋進(jìn)行詳述。如存在檢測(cè)灰區(qū)，應(yīng)對(duì)灰區(qū)結(jié)果的處理方式一 并詳述。10. 【檢驗(yàn)方法的局限性】10.1 本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考， 對(duì)患者個(gè)體化 治療的選擇應(yīng)結(jié)合其癥狀 / 體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及 治療反應(yīng)等情況綜合考慮。10.2 陰性結(jié)果不能完全排除靶基因突變的存在， 樣本中 腫瘤細(xì)胞過(guò)少、核酸過(guò)度降解或擴(kuò)增反應(yīng)體系中靶基因濃度 低于檢測(cè)限亦可造成陰性結(jié)果。10.3 腫

23、瘤組織（細(xì)胞）可能存在較大異質(zhì)性，不同部位 取樣可能會(huì)得到不同的檢測(cè)結(jié)果。10.4 不合理的樣本采集、 轉(zhuǎn)運(yùn)及處理， 以及不當(dāng)?shù)脑囼?yàn) 操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。10.5 明確該檢測(cè)僅限于規(guī)定的樣本類型及檢測(cè)系統(tǒng) （包 括適用機(jī)型、核酸分離 / 純化試劑、檢測(cè)方法等） 。10.6罕見(jiàn)EGFR突變基因檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性對(duì)臨床用藥的指導(dǎo)，應(yīng)結(jié)合臨床個(gè)體化用藥研究進(jìn)展綜合進(jìn)行評(píng)價(jià)。10.7本檢測(cè)試劑不適用 EGFR拷貝數(shù)表達(dá)量的檢測(cè)。10.8本檢測(cè)試劑EGFR基因突變檢測(cè)范圍僅包括檢測(cè)試劑明確包含的已知的基因突變位點(diǎn)范圍，不包括檢測(cè)試劑盒 申明之外的基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)。11. 【產(chǎn)品性能

24、指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：11.1 病理組織樣本類型性能指標(biāo)11.1.1 對(duì)相應(yīng)國(guó)家參考品（如有）檢測(cè)的符合情況。11.1.2 企業(yè)內(nèi)部陽(yáng)性 / 陰性參考品符合率， 陽(yáng)性 / 陰性參 考品的組成、來(lái)源、濃度梯度設(shè)臵以及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等信息。11.1.3 最低檢測(cè)限： 說(shuō)明在試劑盒規(guī)定的檢測(cè)條件及擴(kuò) 增體系中，試劑盒能夠覆蓋的所有突變類別的最低檢出濃 度，重點(diǎn)考慮原始模板中突變基因的百分率和擴(kuò)增終體系中 核酸濃度兩個(gè)因素對(duì)最低檢測(cè)限的影響；并介紹最低檢測(cè)限 的確定方法。11.1.4 精密度：精密度參考品的組成、來(lái)源、濃度梯度 要求及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，不同濃度精密度參考品的檢測(cè)結(jié)果（正確 符合情況或變異系數(shù)） 。

25、11.1.5 分析特異性11.1.5.1 對(duì)分析性能評(píng)估中特異性研究?jī)?nèi)容進(jìn)行歸納。 核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其 他突變類型序列間交叉反應(yīng)、EGFR野生型DNA驗(yàn)證、 非人類基因組驗(yàn)證、肺相關(guān)感染微生物驗(yàn)證等信息。11.1.5.2 潛在干擾物質(zhì)驗(yàn)證如果經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)某些序列與靶序列的交叉反應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，則應(yīng)該對(duì)存在交叉反應(yīng)的核酸序列及濃度進(jìn)行驗(yàn)證 并在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中表明這種假陽(yáng)性發(fā)生的可能，做出相關(guān)的 提示。11.1.6 對(duì)比試驗(yàn)研究（如有） ：簡(jiǎn)要介紹參比試劑（方 法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。11.2 外周血樣本類型性能指標(biāo)11.2.1 對(duì)相應(yīng)國(guó)家參考品

26、（如有）檢測(cè)的符合情況。11.2.2 最低檢測(cè)限： 說(shuō)明在試劑盒規(guī)定的檢測(cè)條件及擴(kuò) 增體系中，試劑盒能夠覆蓋的所有突變類別的最低檢出濃 度，并簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的確定方法。11.2.3 企業(yè)內(nèi)部陽(yáng)性 / 陰性參考品符合率， 陽(yáng)性 /陰性參 考品的組成、來(lái)源、濃度梯度設(shè)臵以及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等信息。11.2.4 精密度：精密度參考品的組成、來(lái)源、濃度梯度 要求及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，不同濃度精密度參考品的檢測(cè)結(jié)果（正確 符合情況或變異系數(shù)） 。11.2.5 分析特異性11.2.5.1 對(duì)分析性能評(píng)估中特異性研究?jī)?nèi)容進(jìn)行歸納。 核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其 他突變類型序列間交叉反應(yīng)、EGFR野

27、生型DNA僉證、非人類基因組驗(yàn)證、肺相關(guān)感染微生物驗(yàn)證等信息。11.2.5.2 潛在干擾物質(zhì)驗(yàn)證。如果經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)某些序列與靶序列的交叉反應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，則應(yīng)該對(duì)存在交叉反應(yīng)的核酸序列及濃度進(jìn)行驗(yàn)證 并在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中表明這種假陽(yáng)性發(fā)生的可能，做出相關(guān)的 提示。11.2.6 對(duì)比試驗(yàn)研究（如有） ：簡(jiǎn)要介紹參比試劑（方 法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。12. 【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：12.1 如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)， 應(yīng)給出具有潛 在感染性的警告。12.2 臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照 醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí) 驗(yàn)室管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā) , 2010? 194 號(hào)或現(xiàn)行有效版本

28、） 等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范 執(zhí)行。12.3 標(biāo)本的處理和檢測(cè)標(biāo)本的容器、 檢驗(yàn)過(guò)程中使用的 材料的處理要符合醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例和醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu) 醫(yī)療廢物管理辦法 ，以及國(guó)家、地區(qū)的相關(guān)要求。（三）主要原材料的研究資料應(yīng)體現(xiàn)EGFR基因突變檢測(cè)試劑主要組成成分中所有具體組分包含引物、探針、酶、反應(yīng)緩沖液、提取成分（如包 含）等；如為申請(qǐng)人自行研究主要原材料，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì) EGFR 序列確定，引物、探針選擇、酶研究等實(shí)驗(yàn)過(guò)程予以詳述； 并提供對(duì)各主要原材料的功能性研究，如 : 外觀、純度、蛋 白濃度、功能性研究等。并對(duì)制備完成的原料成品進(jìn)行質(zhì)量 檢驗(yàn)以確認(rèn)其符合標(biāo)準(zhǔn)要求，整

29、個(gè)生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可控。如 為申請(qǐng)人外購(gòu)主要原材料，應(yīng)詳述每一原材料外購(gòu)方來(lái)源， 提交外購(gòu)方出具的每種原材料性能指標(biāo)及質(zhì)量控制資料，并 詳述申請(qǐng)人對(duì)外購(gòu)主要原材料的各指標(biāo)質(zhì)量要求以及確定 該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細(xì)依據(jù)。1. 核酸分離 / 純化組分（如有）的主要組成、原理介紹 及相關(guān)的驗(yàn)證資料。2. PCR 組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其 他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主 要包括以下內(nèi)容：2.1 脫氧三磷酸核苷（ dNTP）核酸的組成成分，包括： dATP、 dUTP、 dGTP、dCTP 和 dTTP;應(yīng)提交對(duì)純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料。2.2

30、引物 應(yīng)優(yōu)化每一單一突變基因?qū)Ｓ靡锏南鄬?duì)濃度，避免多 個(gè)核酸靶序列同時(shí)擴(kuò)增時(shí)可能出現(xiàn)的相互影響和競(jìng)爭(zhēng)。引物 設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)對(duì)反應(yīng)體系中所有引物進(jìn)行篩選，避免引物二聚 體形成。為保證每一靶序列檢測(cè)準(zhǔn)確性，EGFR僉測(cè)試劑中每一突變基因引物對(duì)濃度必須進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)根據(jù)靶序列突變性 質(zhì)，C+G含量等確定每一突變基因引物長(zhǎng)度和濃度，且單一引物最適濃度還應(yīng)考慮所有引物之間濃度的相互影響。由一 定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE或其他適宜方法純化。需提供對(duì)分子量、純度、穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)等的 驗(yàn)證資料。如為外購(gòu)，還應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的

31、質(zhì)檢證明，如 PAGE結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC分析圖 譜。應(yīng)對(duì)引物結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，引物擴(kuò)增區(qū)段不應(yīng)有重復(fù)序列。2.3探針特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核 苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序 列的探測(cè)。合成后經(jīng)PAGE或其他適宜方法純化，在5-端（和 /或3-端）進(jìn)行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化， 純度 應(yīng)達(dá)到HPLC純。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物質(zhì)檢證明， 如HPLC分析圖譜，應(yīng)對(duì)探針的分子量、純度及標(biāo)記的熒光 素進(jìn)行核實(shí)，并進(jìn)行功能性試驗(yàn)驗(yàn)證。2.4酶DNA聚合酶，應(yīng)具有 DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活 性，具熱穩(wěn)定性，如：94 C保溫1小時(shí)

32、后仍保持50%S性； 尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG，具有水解尿嘧啶糖苷鍵 的活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性；逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆 轉(zhuǎn)錄酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)對(duì)酶活性進(jìn)行合理驗(yàn)證。3. 核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)脫氧核糖核酸酶（DNase和核糖核酸酶（RNase污染4. 企業(yè)內(nèi)部參考品： 企業(yè)內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測(cè)值可 溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過(guò) 程、定值研究、評(píng)價(jià)指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)部 陽(yáng)性 / 陰性參考品的來(lái)源、基因序列設(shè)臵等信息進(jìn)行精確的 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并提供參考品溯源過(guò)程的測(cè)量程序或參考方法的 相關(guān)信息及詳細(xì)的驗(yàn)證資料

33、。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證實(shí) 際情況自行設(shè)定內(nèi)部參考品，陽(yáng)性參考品應(yīng)著重考慮 EGFR 基因突變型別要求，陰性參考品則主要涉及對(duì)分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗(yàn)證情況。如該類產(chǎn)品有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，在不 低于國(guó)家參考品要求前提下，研究人員可以結(jié)合實(shí)際情況設(shè) 臵合理內(nèi)部陽(yáng)性 / 陰性參考品。具體要求如下：4.1 組織樣本參考品設(shè)臵要求4.1.1 陽(yáng)性參考品 陽(yáng)性參考品中常見(jiàn)基因突變位點(diǎn)（如： 19 外顯子 19del 和20外顯子（T790M、21外顯子（L858R）建議采用臨 床樣本提取的DNA儲(chǔ)備液或細(xì)胞系作為原料。其他突變位點(diǎn) 可采用DNA儲(chǔ)備液、細(xì)胞系或質(zhì)粒樣本作為原料。陽(yáng)性參考 品中還應(yīng)設(shè)臵雙突變

34、陽(yáng)性樣本類型，如：19del/L858R 、T790M/19del、T790M/L585R等。如采用質(zhì)粒作為陽(yáng)性參考品， 應(yīng)盡可能模擬真實(shí)樣本，需要對(duì)樣本基質(zhì)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)研試劑盒(分型或不分型)所能覆蓋的所有突變位點(diǎn)均應(yīng) 設(shè)臵相應(yīng)的陽(yáng)性參考品，每個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)臵至少三個(gè)突變百 分率梯度，其中需包括至少高濃度和低濃度陽(yáng)性參考品。陽(yáng) 性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需經(jīng)過(guò)ddPCF或測(cè)序方法等進(jìn)行確認(rèn)。4.1.2 陰性參考品可采用經(jīng)確認(rèn)無(wú)相應(yīng)靶突變序列的DNA儲(chǔ)存液。如野生型人基因組DNA HER家族DNA等。4.1.3 檢測(cè)限參考品檢測(cè)限參考品的原料要求參考陽(yáng)性參考品，需包括所有 的突變類型。在進(jìn)行最低

35、檢測(cè)限性能評(píng)估時(shí)，應(yīng)設(shè)臵多個(gè)梯 度，主要從擴(kuò)增反應(yīng)終體系核酸濃度和突變序列所占百分率 兩個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，建議采用95%( n 20)臵信區(qū)間的陽(yáng)性檢出率作為最低檢測(cè)限確定的標(biāo)準(zhǔn)。 每種基因型別最低檢出限應(yīng)低于或至少檢出 10ng/ 反應(yīng)體系 中 5%突變比例。4.1.4 精密度參考品精密度參考品原料要求參考陽(yáng)性參考品，需至少包括弱 陽(yáng)性、中或強(qiáng)陽(yáng)性水平的精密度驗(yàn)證，中 / 強(qiáng)陽(yáng)性精密度參 考品可不必包括所有突變類型，以常見(jiàn)突變類型(L858R、T790M、19dell )為主；建議設(shè)臵至少一種雙突變基因類型，同時(shí)設(shè)臵陰性參考品精密度驗(yàn)證。4.1.5 提取內(nèi)對(duì)照參考品（如適用） 設(shè)臵專門的質(zhì)控管

36、對(duì)管家基因或其他源于人類基因組DNA的靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，以對(duì)核酸分離/純化的質(zhì)量及效率進(jìn) 行評(píng)估。4.2 外周血樣本參考品設(shè)臵要求4.2.1 陽(yáng)性參考品 陽(yáng)性參考品中常見(jiàn)基因突變位點(diǎn)（如： 19 外顯子 19del 和20外顯子（T790M、21外顯子（L858R）建議采用臨 床樣本提取的DNA儲(chǔ)備液或細(xì)胞系作為原料。陽(yáng)性參考品中 還應(yīng)設(shè)臵雙突變陽(yáng)性樣本類型，如：19del/L858R、 T790M/19del、T790M/L585R等。理論上應(yīng)采用血液中提取的 DNA作為該類產(chǎn)品參考品且覆蓋所有位點(diǎn)，但考慮外周血中 EGFF基因突變DNA含量較低，其他突變位點(diǎn)可以采用臨床樣 本提取的DNA儲(chǔ)備

37、液或細(xì)胞系或 EGFF突變基因擴(kuò)增檢測(cè) DNA 產(chǎn)物模擬樣本，樣本基質(zhì)應(yīng)為人血漿或人工模擬樣本，應(yīng)盡 可能模擬真實(shí)樣本， 使用人血漿時(shí)， 應(yīng)提前確認(rèn)人血漿中 DNA 背景濃度；使用人工模擬樣本時(shí)，應(yīng)參照人血漿成分進(jìn)行配 臵，并對(duì)模擬樣本進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)研究。試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點(diǎn)均應(yīng) 設(shè)臵相應(yīng)的陽(yáng)性參考品，每個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)臵至少三個(gè)突變百 分率梯度，其中需包括至少一份弱陽(yáng)性參考品。陽(yáng)性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需經(jīng)過(guò) ddPCR或測(cè)序方法等進(jìn)行確認(rèn)， 不建議用檢測(cè)試劑方法原理進(jìn)行檢測(cè)。4.2.2 陰性參考品可采用經(jīng)確認(rèn)無(wú)相應(yīng)靶突變序列的 DNA儲(chǔ)存液。如野生 型人基因組DNA H

38、ER家族DNA等。4.2.3 檢測(cè)限參考品 檢測(cè)限參考品的原料要求參考陽(yáng)性參考品，需包括所有的突變類型。在進(jìn)行最低檢測(cè)限性能評(píng)估時(shí)，應(yīng)設(shè)臵多個(gè)梯 度，建議采用95% （n20）臵信區(qū)間的陽(yáng)性檢出率作為最低 檢測(cè)限確定的標(biāo)準(zhǔn)。每種基因型別最低檢出限應(yīng)低于或至少 檢出 10ng/ 反應(yīng)體系 1%突變比例。4.2.4 精密度參考品 精密度參考品原料要求參考陽(yáng)性參考品，需至少包括弱陽(yáng)性、中或強(qiáng)陽(yáng)性水平的精密度驗(yàn)證，中 / 強(qiáng)陽(yáng)性精密度參 考品可不必包括所有突變類型，以常見(jiàn)突變類型為主；建議 設(shè)臵至少一種雙突變基因類型，同時(shí)設(shè)臵陰性參考品精密度 驗(yàn)證。4.2.5 提取內(nèi)對(duì)照參考品（如適用） 設(shè)臵專門的質(zhì)

39、控管對(duì)管家基因或其他源于人類基因組DNA的靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，以對(duì)核酸分離/純化的質(zhì)量及效率進(jìn) 行評(píng)估。5. 試劑盒內(nèi)對(duì)照品（質(zhì)控品）試劑盒的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)臵各種試劑盒對(duì)照品來(lái)實(shí)現(xiàn)， 質(zhì)控體系需考慮對(duì)樣本核酸分離 / 純化、配液及加樣、試劑 及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶 核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行合理 的質(zhì)量控制。對(duì)照品可采用質(zhì)粒、假病毒或臨床樣本的核酸 提取液等進(jìn)行配臵。申報(bào)資料應(yīng)對(duì)試劑盒對(duì)照品有關(guān)原料選 擇、制備、定值過(guò)程等試驗(yàn)資料詳細(xì)說(shuō)明。申請(qǐng)人應(yīng)視申報(bào) 產(chǎn)品具體情況設(shè)臵合理的試劑盒對(duì)照品（質(zhì)控品），試劑盒 質(zhì)控體系主要考慮以下幾方面要求。5.1

40、組織樣本類型設(shè)臵要求5.1.1 陽(yáng)性對(duì)照品（質(zhì)控品） 申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)各種陽(yáng)性對(duì)照品（質(zhì)控品）的 Ct 值做出明 確的范圍要求。如樣本反應(yīng)管內(nèi)可以覆蓋多種突變序列的檢 測(cè)（分型或不分型），相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照管可以不必涉及所有 突變類型，但應(yīng)選擇較常見(jiàn)突變序列或理論上較難測(cè)得的突 變序列作為陽(yáng)性對(duì)照。以對(duì)樣本核酸分離 / 純化、試劑及儀 器性能、擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程等環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量控制。陽(yáng)性質(zhì)控品設(shè) 臵應(yīng)至少包括每個(gè)反應(yīng)管中一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)被測(cè)物。5.1.2 陰性對(duì)照 陰性對(duì)照可以是含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可 以是空白對(duì)照，以對(duì)可能存在的交叉污染進(jìn)行假陽(yáng)性結(jié)果的 質(zhì)控。陰性對(duì)照品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。5.

41、1.3 內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)） 內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）可以對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行 質(zhì)量控制，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針和模板 濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線 又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。（四）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料 生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及 到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì) 控體系設(shè)臵、Ct （臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)，配制 工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均 勻，配制過(guò)程應(yīng)對(duì)pH電導(dǎo)率、離子濃度等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有 效控制。主要包括以下內(nèi)容：1. 主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式

42、表示。2. 反應(yīng)原理介紹。3. 基因位點(diǎn)選擇、方法學(xué)特性介紹。4. 確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度等。5. 確定PCR反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。 如反應(yīng)體系相同，多個(gè)突變基因在相同反應(yīng)條件下核酸擴(kuò)增 效率是否存在差別。6. 對(duì)于基線閾值（threshold ）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確 定的研究資料。應(yīng)提供相同反應(yīng)條件下，多個(gè)基因類型是否Ct 相同7. 不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。8. 如申報(bào)產(chǎn)品包含核酸分離 / 純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸 分離/ 純化過(guò)程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。（五）分析性能評(píng)估資料分析性能評(píng)估是

43、反映產(chǎn)品主要原材料選擇，生產(chǎn)工藝及 反應(yīng)體系等多方面因素設(shè)臵是否合理的客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)。檢測(cè) 試劑性能的研究方案應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的反應(yīng)原理，臨床用途，使 用條件等綜合因素進(jìn)行設(shè)計(jì)。性能研究應(yīng)涵蓋產(chǎn)品研制階段 對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方 法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。1. 病理組織學(xué)樣本類型1.1 最低檢測(cè)限組織學(xué)最低檢測(cè)限樣本類型應(yīng)包括擴(kuò)增反應(yīng)終體系中 的突變序列百分率和申報(bào)產(chǎn)品反應(yīng)體系中總核酸濃度兩個(gè) 因素。對(duì)于常見(jiàn)基因突變類型建議采用EGFR基因突變型的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC中性福爾馬林固定石蠟包埋組織 （FFPE 和EGFR予生型的NSCLC FFPE羊本

44、制備DNA存儲(chǔ)液；對(duì)于罕 見(jiàn)基因突變類型，建議采用細(xì)胞株或人工合成樣本如： EGFR 細(xì)胞株或質(zhì)粒與 EGFR予生型NSCLC FFPE羊本樣本制備 DNA 存儲(chǔ)液。同時(shí)，還應(yīng)設(shè)臵幾種常見(jiàn)多突變類型與EGFR野生 型NSCLC FFPET羊本制備DNA存儲(chǔ)液。EGFR基因突變類型不同比例混合應(yīng)注意事項(xiàng)；每種基因突變類型羊本儲(chǔ)存液按照不同突變序列所占比例進(jìn)行混合， 鑒于PCR核酸原理檢測(cè)靈敏度，此處主要針對(duì)EGFR基因突變類型低比例情況進(jìn)行配比，如從10%或 8%起始按不同比例混合。至少包括目標(biāo)檢測(cè)限，和檢測(cè)限上下至少各 2 個(gè)梯度 比例范圍研究資料，對(duì)于按不同比例混合后的不同羊本，檢 測(cè)不同羊

45、本的實(shí)際混合比例并說(shuō)明檢測(cè)方法，并以實(shí)際混合 比例做為下一步 EGFR 基因突變的最低靈敏度研究。同時(shí)， 在EFGR基因突變不同比例研究過(guò)程中應(yīng)設(shè)臵EGFR野生型樣本作為空白對(duì)照。確定反應(yīng)體系總樣本加樣量以及反應(yīng)體系中需要的 DNA 總濃度，申請(qǐng)人需說(shuō)明每uL的DNA加樣量和總DNA濃度確定方法。在進(jìn)行混合稀釋時(shí)，使用的 FFPE 樣本應(yīng)與原混合 配臵樣本類型相同。建議申請(qǐng)人設(shè)計(jì)一個(gè)顯著高于反應(yīng)體系 最高DNA加樣量的DNA存儲(chǔ)濃度。在實(shí)際的 EGFR不同基因 突變比例下，進(jìn)行不同梯度DNA濃度的檢測(cè)，不同 DNA濃度各檢測(cè)至少3次，不同梯度DNA濃度范圍應(yīng)涵蓋申報(bào)產(chǎn)品反 應(yīng)體系中設(shè)定的最高

46、DNA濃度和最低DNA濃度。待確定組織 中最低檢出限后，在組織LOD水平附近額外檢測(cè) 20份平行樣本，確定95%臵信區(qū)間陽(yáng)性檢出率的最低DNA濃度。申請(qǐng)人可用表格形式列明（如表2）表2最低檢測(cè)限驗(yàn)證基因突變類型所檢測(cè)批次檢出率實(shí)際檢測(cè)突變細(xì)胞比例總DNA濃度/反應(yīng)體系檢測(cè)次 數(shù)突變比例ADNA濃度aDNA濃度bDNA濃度c以此類推突變比例BDNA濃度aDNA濃度bDNA濃度c以此類推突變比例CDNA濃度aDNA濃度bDNA濃度c以此類推以此類推DNA濃度aDNA濃度bDNA濃度c以此類推突變比例0DNA濃度0如申報(bào)產(chǎn)品存在不同的核酸提取方法，每種核酸 提取方法應(yīng)配套檢測(cè)試劑進(jìn)行各基因突變類型最

47、低檢測(cè)限 驗(yàn)證。如申報(bào)產(chǎn)品存在不同適用機(jī)型，每種適用機(jī)型應(yīng) 配套檢測(cè)試劑進(jìn)行各基因突變類型最低檢測(cè)限驗(yàn)證。1.1.3 組織切片的提取方法應(yīng)與說(shuō)明書(shū)一致，如申報(bào)產(chǎn) 品適用于多種組織切片制作方法，最低檢測(cè)限應(yīng)對(duì)每種組織 切片制作方法進(jìn)行驗(yàn)證。1.2 分析特異性1.2.1 交叉反應(yīng) 該類產(chǎn)品主要與肺部腫瘤存在較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，申請(qǐng)人在設(shè) 計(jì)交叉反應(yīng)研究時(shí)應(yīng)將此點(diǎn)納入考慮。1.2.1.1 核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其他突變類型序列間交叉反應(yīng)。EGFF不同基因之間是否存在交叉反應(yīng)；EGFF家族之間是否存在交叉反應(yīng)；如多個(gè)不同基因聯(lián)合檢測(cè)試劑，應(yīng)檢測(cè)不同基因序列之間是否 存在交叉反應(yīng)；如

48、：人 EGFF/K-ras 突變基因聯(lián)合檢測(cè)試劑 盒（熒光PCR法），需檢測(cè) EGFF和K-ras之間是否存在交 叉反應(yīng)。野生型人DNA如不同濃度的野生型 DNA核酸樣本； 非人類組基因驗(yàn)證： 如大腸桿菌， 真核微生物 （酵母菌） 等； 肺相關(guān)感染微生物驗(yàn)證：結(jié)核分支桿菌，肺炎鏈球菌和流感 嗜血桿菌1.2.1.2 申請(qǐng)人需檢測(cè)表 3 中列出具有潛在交叉反應(yīng)的 病毒體和人基因序列。病原體需在有臨床意義相關(guān)濃度檢 測(cè)，細(xì)菌濃度水平建議至少106 cfu/ml ，病毒濃度水平建議至少 105 cfu/ml 。需明確進(jìn)行交叉反應(yīng)病毒或細(xì)菌類型及滴度。人野生型 DNA至少包含100ng/ul野生型核酸樣

49、本，應(yīng) 提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的突變或野生型序列來(lái)源、序列 確認(rèn)和濃度選擇等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)在 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。表3潛在交叉反應(yīng)研究EGFF不同突變基因型肺炎鏈球菌野生型DNA流感嗜血桿菌大腸桿菌HER-2酵母菌HER-3結(jié)核分支桿菌HER-4122干擾物質(zhì)122.1申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)試劑盒所采用的樣本類型，確定 潛在的干擾物質(zhì)。常見(jiàn)治療藥物，樣本穿刺過(guò)程的緩沖液，處理液等，組 織處理過(guò)程中的緩沖液。（見(jiàn)表 4）1.2.2.2 用于干擾試驗(yàn)的樣本，靶基因濃度應(yīng)至少包含 弱陽(yáng)性，而不應(yīng)僅選擇強(qiáng)陽(yáng)性樣本，使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干 擾物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。此外，建議申請(qǐng)人

50、同時(shí)在每種干擾物質(zhì)的 潛在最大濃度（“最差條件”）條件下同樣進(jìn)行評(píng)價(jià)。表4潛在干擾物研究甘油二酯乙醇血紅蛋白二甲基亞砜（DMSO福爾馬林焦炭酸二乙酯（DEPC石蠟沙丁胺醇(albuterol )二甲基異丙托溴銨(Ipratropium )蛋白酶K氟替卡松(Fluticasone )亞胺培南(Imipenem)頭孢他啶(Ceftazidime )氧哌嗪青霉素(piperacillin)聚維酮碘溶液(Betadine)三唑巴坦(tazobactam)利多卡因(lidocaine ).1.3精密度申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求， 如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)際

51、或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的文件進(jìn)行。針對(duì)本類產(chǎn) 品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求。對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除 申報(bào)試劑(包括核酸分離 /純化組分)本身的影響外，還應(yīng) 對(duì)PCR分析儀、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。132合理的精密度評(píng)價(jià)周期， 例如：為期至少12天的 連續(xù)檢測(cè)，每天至少由 2人完成不少于2次的完整檢測(cè)，從 而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn) 行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重 復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。133用于精密度評(píng)價(jià)的參考品應(yīng)至少包括弱陽(yáng)性參考 品和高濃度參考品3個(gè)水平，如有必要，建議同時(shí)設(shè)臵陰性參考品進(jìn)行驗(yàn)

52、證，要求如下1.3.3.1 陰性參考品：待測(cè)靶核酸濃度低于最低檢測(cè)限 或?yàn)榱銤舛龋ㄗh選用背景值較高的陰性樣本，陰性符合率 應(yīng)為 100% （n20）。1.3.3.2 弱陽(yáng)性參考品：待測(cè)靶核酸濃度略高于試劑盒 的最低檢測(cè)限，陽(yáng)性檢出率應(yīng)達(dá)到 100%（n 20）。（弱陽(yáng) 性參考品需包括所有的突變位點(diǎn)， 如果待測(cè)物靶核酸為 RNA， 則弱陽(yáng)性精密度參考品中應(yīng)至少部分典型突變位點(diǎn)的原料為RNA如RNA干粉或相應(yīng)的假病毒）1.3.3.3 高濃度參考品：待測(cè)靶核酸呈中到強(qiáng)陽(yáng)性的濃度，陽(yáng)性檢出率為 100%且 CVC 15%（ n 20）。（如果試劑 盒可以覆蓋多個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，該參考品可以設(shè)臵為對(duì)全

53、 部突變位點(diǎn)進(jìn)行精密度驗(yàn)證，也可以選擇其中部分突變位點(diǎn) 進(jìn)行驗(yàn)證，但應(yīng)至少包含常見(jiàn)突變序列或理論上較難測(cè)得的 突變序列）1.4 陽(yáng)性 / 陰性參考品符合率各水平、各突變位點(diǎn)的陽(yáng)性參考品均應(yīng)按要求檢出陽(yáng) 性，考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對(duì)各水平陽(yáng)性參考品設(shè)臵相 應(yīng) Ct 值的限制；陰性參考品在各個(gè)引物探針組合的檢測(cè)條 件下均應(yīng)檢出為陰性；如有野生型參考品的設(shè)臵，在其相應(yīng) 的引物探針組合下檢測(cè)應(yīng)為陽(yáng)性。1.5 樣本的穩(wěn)定性1.5.1 樣本提取前核酸序列的穩(wěn)定性 對(duì)于經(jīng)福爾馬林石蠟包埋組織切片樣本，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)組 織樣本保存溫度，保存年限進(jìn)行限定。應(yīng)規(guī)定組織切片的厚 度，制作方法，對(duì)經(jīng)臨床機(jī)構(gòu)確定的組織切

54、片進(jìn)行提取。驗(yàn) 證不同時(shí)間段保存的組織樣本對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；對(duì)于新鮮冰凍切片樣本，應(yīng)限定新鮮冰凍切片樣本檢測(cè) 時(shí)限；新鮮冰凍切片的切片要求。1.5.2 樣本核酸提取評(píng)價(jià)要求 申報(bào)試劑配套樣本處理試劑的重復(fù)性，對(duì)同一 NSCLCFFPET組織樣本中段部分平行切去 10份切片樣本，設(shè)臵評(píng)價(jià) 方案，評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)樣本核酸提取過(guò)程的重復(fù)性。樣本核酸的分離 / 純化主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，樣本核酸分離/純化是決定后續(xù)核酸擴(kuò)增 過(guò)程成敗的要素之一。石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過(guò) 程中，會(huì)使樣品中的核酸與核酸之間，核酸與蛋白之間發(fā)

55、生 交聯(lián)；由于不同組織蛋白種類和含量存在差異，不同組織核 酸提取試劑可能也有所不同。因此，無(wú)論申報(bào)產(chǎn)品是否含有 核酸分離 /純化的組分，申請(qǐng)人都應(yīng)對(duì)核酸分離 /純化環(huán)節(jié)做 充分的驗(yàn)證。除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純 化步驟，盡可能去除 PCR抑制物。常見(jiàn)的核酸分離純化均有 其優(yōu)勢(shì)和不足，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合申報(bào)產(chǎn)品的特性，合理選擇核酸分離 / 純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。1.5.3 樣本提取后核酸序列的穩(wěn)定性。樣本提取后核酸序列的穩(wěn)定性。應(yīng)檢測(cè)核酸的含量，設(shè) 臵反應(yīng)體系需要的核酸含量上限和下限。如反應(yīng)體系中起始 DNA濃度過(guò)高，可能導(dǎo)致反應(yīng)體系發(fā)生非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生 假陽(yáng)性結(jié)果。如反應(yīng)體

56、系中起始DNA濃度過(guò)低，可能導(dǎo)致反應(yīng)體系無(wú)靶序列擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。紫外 - 可見(jiàn)分 光光度計(jì)對(duì) DNA濃度進(jìn)行定量，260 nm/280 nm 處的吸光度 比值（OD260/OD280或通過(guò)其他方法評(píng)價(jià)其純度。設(shè)臵反 應(yīng)體系所需初始 DNA濃度范圍，如單位體積 DNA濃度超過(guò)所 需濃度上限或下限，應(yīng)提供相應(yīng)的改進(jìn)措施。同時(shí)，應(yīng)對(duì)核 酸提取物的保存時(shí)間， 保存溫度進(jìn)行驗(yàn)證。 并評(píng)價(jià)凍融次數(shù)， 儲(chǔ)存條件等對(duì)樣本提取后核酸序列穩(wěn)定性的影響。1.5.4 樣本完整性 在樣本提取前和提取過(guò)程、提取后，以及在儲(chǔ)存期間， 核酸會(huì)發(fā)生不同程度地降解。為使降解降低到最低程度（提 取前或提取后） ，應(yīng)避免樣品的多次冷凍 / 融化。必要時(shí)，申 請(qǐng)人應(yīng)評(píng)價(jià)提取前，提取后凍融次數(shù)，儲(chǔ)存條件等因素。在 長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后，應(yīng)在使用前評(píng)價(jià)核酸的完整性。比較檢測(cè)結(jié) 果與儲(chǔ)存前檢測(cè)結(jié)果的一致性，可采用瓊脂糖凝膠電泳或者 內(nèi)參基因PCR僉測(cè)等方法