飼料中霉菌毒素檢測技術(shù)

1、飼料中霉菌毒素檢測技術(shù) 交流提綱交流提綱一、飼料中霉菌毒素的危害飼料中霉菌毒素的危害 二二、飼料中霉菌毒素的主要檢測方法、飼料中霉菌毒素的主要檢測方法 三、三、ELISAELISA法的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)法的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng) 質(zhì)量第一質(zhì)量第一 公正科學(xué)公正科學(xué) 及時準(zhǔn)確及時準(zhǔn)確四、四、 HPLC法在飼料霉菌檢測中的應(yīng)用一、飼料中霉菌毒素的危害 1、什么是霉菌毒素？、什么是霉菌毒素？真菌霉菌抗生素霉菌毒素酵母蕈菌霉菌毒素是霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物次級代謝產(chǎn)物次級代謝產(chǎn)物一、飼料中霉菌毒素的危害 2、霉菌毒素產(chǎn)生的原因、霉菌毒素產(chǎn)生的原因霉菌無處不在，它們可在農(nóng)作物生長、收獲、運(yùn)輸和儲存期間生長并產(chǎn)

2、生毒素農(nóng)作物作為飼料原料在生產(chǎn)、銷售、儲存、運(yùn)輸過程中如果受到霉菌污染也會發(fā)生霉變、遭受霉菌毒素污染一、飼料中霉菌毒素的危害 3、霉菌毒素的種類、霉菌毒素的種類u現(xiàn)已報道的霉菌毒素大約有300種u在飼料中常見的、對人和動物健康造成潛在危害的毒素主要有：黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、伏馬毒素和脫氧雪腐鐮刀菌稀醇（嘔吐毒素）等6種毒素一、飼料中霉菌毒素的危害 4、霉菌毒素的主要危害、霉菌毒素的主要危害u一是一是可以引起飼料的變質(zhì)，產(chǎn)生異味，降低其飼用價值，甚至完全讓其失去商品價值u二二是是飼料被霉菌污染后，導(dǎo)致畜禽的急、慢性中毒，免疫機(jī)能和生產(chǎn)性能下降，造成養(yǎng)殖業(yè)效益的下降u三

3、三是是殘留于畜禽肌肉、內(nèi)臟或乳中的霉菌毒素通過食物鏈傳遞給消費(fèi)者，給食品安全帶來更大的風(fēng)險二、飼料中霉菌毒素的主要檢測方法 1、飼料中主要霉菌毒素的檢測、飼料中主要霉菌毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)一覽表標(biāo)準(zhǔn)一覽表霉菌毒素名稱霉菌毒素名稱標(biāo)準(zhǔn)號標(biāo)準(zhǔn)號標(biāo)準(zhǔn)名稱標(biāo)準(zhǔn)名稱檢測方法檢測方法黃曲霉毒素黃曲霉毒素GB/T 30955-2014GB/T 30955-2014飼料中黃曲霉毒素飼料中黃曲霉毒素B1B1、B2B2、G1G1、G2G2的測定的測定 免疫親和柱凈化高效液相色譜法免疫親和柱凈化高效液相色譜法高效液相色譜法（熒光）高效液相色譜法（熒光）GB/T 17480-2008GB/T 17480-2008飼料中黃曲

4、霉毒素飼料中黃曲霉毒素B1B1的測定的測定 酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法GB/T 8381-2008GB/T 8381-2008飼料中黃曲霉毒素飼料中黃曲霉毒素B1B1的測定的測定 半定量薄層色譜法半定量薄層色譜法薄層色譜法薄層色譜法NY/T 2071-2011NY/T 2071-2011飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2T-2毒素的測定液相色譜毒素的測定液相色譜- -串聯(lián)質(zhì)譜法串聯(lián)質(zhì)譜法液相色譜液相色譜- -串聯(lián)質(zhì)譜法串聯(lián)質(zhì)譜法NY/T 2550-2014NY/T 2550-2014飼料中黃曲霉毒素飼料中黃曲霉毒素B1B1的測定

5、的測定 膠體金法膠體金法膠體金法膠體金法NY/T 2549-2014NY/T 2549-2014飼料中黃曲霉毒素飼料中黃曲霉毒素B1B1的測定的測定 免疫親和熒光光度法免疫親和熒光光度法熒光光度法熒光光度法NY/T 2548-2014NY/T 2548-2014飼料中黃曲霉毒素飼料中黃曲霉毒素B1B1的測定的測定 時間分辨熒光免疫層析法時間分辨熒光免疫層析法免疫層析法免疫層析法DB37/T 2617-2014DB37/T 2617-2014飼料中黃曲霉毒素飼料中黃曲霉毒素B1B1的測定的測定 高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法玉米赤霉烯酮玉米赤霉烯酮GB/T 28716-

6、2012 GB/T 28716-2012 飼料中玉米赤霉烯酮的測定飼料中玉米赤霉烯酮的測定 免疫親和柱凈化免疫親和柱凈化- -高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法（熒光）高效液相色譜法（熒光）GB/T19540-2004GB/T19540-2004飼料中玉米赤霉烯酮的測定飼料中玉米赤霉烯酮的測定薄層色譜法薄層色譜法 酶聯(lián)酶聯(lián)免疫吸附法免疫吸附法DB51/T 1080-2010 DB51/T 1080-2010 飼料中玉米赤霉烯酮的測定飼料中玉米赤霉烯酮的測定 高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法DB22/T 1618-2012DB22/T 1618-2012飼料中玉米

7、赤霉烯酮的測定飼料中玉米赤霉烯酮的測定 液相色譜液相色譜- -質(zhì)譜質(zhì)譜/ /質(zhì)譜法質(zhì)譜法液相色譜液相色譜- -串聯(lián)質(zhì)譜法串聯(lián)質(zhì)譜法脫氧雪腐鐮刀菌烯醇脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）（嘔吐毒素） GB/T 30956-2014GB/T 30956-2014飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定 免疫親和柱凈化高效液相色譜法免疫親和柱凈化高效液相色譜法高效液相色譜法（紫外）高效液相色譜法（紫外）GB/T 8381.6-2005GB/T 8381.6-2005配合飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定薄層色譜法配合飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定薄層色譜法薄層色譜法薄層色譜法DB51/T

8、1079-2010DB51/T 1079-2010飼料中嘔吐毒素的測定高效液相色譜法飼料中嘔吐毒素的測定高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法赭曲霉毒素赭曲霉毒素A AGB/T 30957-2014GB/T 30957-2014飼料中赭曲霉毒素飼料中赭曲霉毒素A A的測定的測定 免疫親和柱凈化高效液相色譜法免疫親和柱凈化高效液相色譜法高效液相色譜法（熒光）高效液相色譜法（熒光）GB/T19539-2004GB/T19539-2004飼料中赭曲霉毒素飼料中赭曲霉毒素A A的測定的測定薄層色薄層色譜方法譜方法 酶聯(lián)免疫吸附測定法酶聯(lián)免疫吸附測定法DB51/T 1081-2010DB51/T 1

9、081-2010飼料中赭曲霉毒素飼料中赭曲霉毒素A A的測定的測定 高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法T-2T-2毒素毒素GB/T 28718-2012GB/T 28718-2012飼料中飼料中T-2T-2毒素的測定毒素的測定 免疫親和柱凈化免疫親和柱凈化- -高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法（熒光）高效液相色譜法（熒光）GB/T 8381.4-2005GB/T 8381.4-2005配合配合飼料中飼料中T-2T-2毒素的測定薄層色譜法毒素的測定薄層色譜法薄層色譜法薄層色譜法DB51/T 1078-2010DB51/T 1078-2010飼料中飼料中T-2T-2

10、毒素的測定高效液相色譜法毒素的測定高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法伏馬毒素伏馬毒素NY/T1970-2010NY/T1970-2010飼料中伏馬毒素的測定（伏馬毒素飼料中伏馬毒素的測定（伏馬毒素B1B1和伏馬毒素和伏馬毒素B2B2含量）含量）液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 高效液相色譜法（熒光）高效液相色譜法（熒光）DB51/T 1082-2010DB51/T 1082-2010飼料中伏馬毒素飼料中伏馬毒素B1B1的測定的測定 高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法二、飼料中霉菌毒素的主要檢測方法 2、霉菌毒素的主要檢測方法、霉菌毒素的主要檢測方法 膠體金免疫

11、層析法 酶聯(lián)免疫吸附法 熒光光度法 薄層色譜法 高效液相色譜（熒光/紫外）法 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法二、飼料中霉菌毒素的主要檢測方法 3、主要檢測方法的特點(diǎn)比較、主要檢測方法的特點(diǎn)比較色譜方法色譜方法ELISA試紙條試紙條樣品處理復(fù)雜，需要凈化柱純化操作簡單，只需萃取過濾 簡單，只需萃取過濾 檢測時間 30-60分鐘30-60分鐘 5-10分鐘檢測通量單個樣品，一種或多種毒素多個樣品，一個毒素單種樣品儀器成本昂貴（HPLC,LC-MS/MS）便宜 （酶標(biāo)儀）無需儀器準(zhǔn)確度高中低檢測成本 昂貴 便宜便宜人員技術(shù)要求專業(yè)技術(shù)背景 復(fù)雜的培訓(xùn) 無需專業(yè)背景，簡單培訓(xùn) 無需專業(yè)背景，簡單培訓(xùn) 樣品要求

12、幾乎可以處理任何樣品對樣品基質(zhì)要求高對樣品基質(zhì)要求非常高檢測效率可以進(jìn)行多毒素檢測只能完成單一毒素檢測只能完成單一毒素檢測二、飼料中霉菌毒素的主要檢測方法 4、檢測方案、檢測方案膠體金陽性樣確證高效液相液質(zhì)聯(lián)用熒光分析初篩ELISA批量樣本可疑樣品二、飼料中霉菌毒素的主要檢測方法 5、檢測流程、檢測流程取樣取樣 GB/T14699.1 2005 飼料飼料 采樣采樣制樣制樣 GB/T20195 動物飼料動物飼料試樣的制試樣的制備備萃取萃取凈化凈化（主要用于色譜法）分析測試三、ELISA法的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng) 1、酶聯(lián)免疫吸附（、酶聯(lián)免疫吸附（ ELISA ）試驗(yàn)的定義及分類）試驗(yàn)的定義及分類定義

13、：用定義：用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測酶標(biāo)記抗原或抗體檢測液體中液體中未知抗體或抗原的方法未知抗體或抗原的方法。將將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二抗檢測抗檢測液相中未液相中未知抗體知抗體將已知將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗檢測抗檢測液液相中的可溶性抗原相中的可溶性抗原將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體分類：分類：三、ELISA法的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng) 2、競爭、競爭 ELISA 的原理的原理三、ELISA法的操作要點(diǎn)及

14、注意事項(xiàng) 2、檢測步驟及、檢測步驟及注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)（1）準(zhǔn)備階段）準(zhǔn)備階段 詳細(xì)閱讀說明書詳細(xì)閱讀說明書 確認(rèn)試劑盒試劑組成、數(shù)量及其用途確認(rèn)試劑盒試劑組成、數(shù)量及其用途 試劑配制試劑配制 試樣的制備、提取及稀釋試樣的制備、提取及稀釋 試劑盒試用前要充分回溫試劑盒試用前要充分回溫 實(shí)驗(yàn)室室溫最好控制在實(shí)驗(yàn)室室溫最好控制在20-2520-25 準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)器具（移液槍機(jī)及槍頭）準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)器具（移液槍機(jī)及槍頭） 確認(rèn)儀器設(shè)備運(yùn)行正常確認(rèn)儀器設(shè)備運(yùn)行正常三、ELISA法的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng) 2、檢測步驟及、檢測步驟及注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)（續(xù)）（續(xù)）（2 2）加樣）加樣u 標(biāo)準(zhǔn)曲線孔標(biāo)準(zhǔn)曲線孔- - 酶標(biāo)

15、抗原酶標(biāo)抗原 + + 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液u 樣品測試孔樣品測試孔- - 酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原 + + 樣品提取物溶液樣品提取物溶液 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 加樣體積準(zhǔn)確加樣體積準(zhǔn)確 前后加樣時間不宜過長前后加樣時間不宜過長 不可漏孔、跳孔不可漏孔、跳孔 防止交叉污染防止交叉污染三、ELISA法的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng) 2、操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)（續(xù)）、操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)（續(xù)）容易出現(xiàn)的問題容易出現(xiàn)的問題解決方法加樣時間過長，導(dǎo)加樣時間過長，導(dǎo)致前后反應(yīng)時間差致前后反應(yīng)時間差異大異大一次檢測不要檢測太多樣品一次檢測不要檢測太多樣品加樣使用使用單槍，其他步驟使用排槍加樣使用使用單槍，其他步驟使用排槍先將酶

16、標(biāo)抗原和樣品提取液在空白微孔板中混合均先將酶標(biāo)抗原和樣品提取液在空白微孔板中混合均勻，再用多通道移液器將混合液加到檢測微孔板中勻，再用多通道移液器將混合液加到檢測微孔板中交叉污染交叉污染槍頭一次性使用槍頭一次性使用試樣加入試樣加入后的后的 步驟槍步驟槍頭不接觸微孔頭不接觸微孔液體掛壁排不盡液體掛壁排不盡使用硅化槍頭使用硅化槍頭移取體積不一致移取體積不一致高質(zhì)量移液槍高質(zhì)量移液槍+配套墻頭配套墻頭+人員操作訓(xùn)練人員操作訓(xùn)練產(chǎn)生氣泡產(chǎn)生氣泡輕輕回形振蕩輕輕回形振蕩三、ELISA法的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng) 2、操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)、操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)(續(xù)續(xù))（3 3）孵育）孵育 孵育前應(yīng)混勻反應(yīng)物孵育前應(yīng)

17、混勻反應(yīng)物 嚴(yán)格按照說明書控制溫度、時間及避光要求嚴(yán)格按照說明書控制溫度、時間及避光要求 防止微孔內(nèi)防止微孔內(nèi)液體揮發(fā)，加以密封液體揮發(fā)，加以密封（4 4）洗板）洗板 甩除液體要干凈利落，不要投鼠忌器甩除液體要干凈利落，不要投鼠忌器 加洗液不要溢出微孔，防止交叉污染加洗液不要溢出微孔，防止交叉污染 拍板用力適當(dāng)，看不到明顯液體為宜拍板用力適當(dāng)，看不到明顯液體為宜三、ELISA法的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng) 2、操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)、操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)(續(xù)續(xù))（5 5）顯色）顯色 加顯色液要快速準(zhǔn)確加顯色液要快速準(zhǔn)確 回形振蕩混勻，消除氣泡回形振蕩混勻，消除氣泡 嚴(yán)格按照說明書控制溫度、時間及避光要求嚴(yán)格

18、按照說明書控制溫度、時間及避光要求 防止微孔內(nèi)防止微孔內(nèi)液體揮發(fā)，加以密封液體揮發(fā)，加以密封（6 6）顯色終止）顯色終止 按照加顯色液的順序及速度加終止夜按照加顯色液的順序及速度加終止夜 回形振蕩混勻液體回形振蕩混勻液體三、ELISA法的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng) 2、操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)、操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)(續(xù)續(xù))（6 6）讀數(shù)（檢測吸光度）讀數(shù)（檢測吸光度） 終止反應(yīng)后應(yīng)盡快檢測吸光度終止反應(yīng)后應(yīng)盡快檢測吸光度 按照說明書要求設(shè)置酶標(biāo)儀參數(shù)按照說明書要求設(shè)置酶標(biāo)儀參數(shù)三、ELISA法的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng) 3、其他應(yīng)注意的問題、其他應(yīng)注意的問題 勞動安全保護(hù)及環(huán)境保護(hù)勞動安全保護(hù)及環(huán)境保護(hù) 不同批次的試劑盒微孔板不要混用不同批次的試劑盒微孔板不要混用 試劑盒質(zhì)量差異（重復(fù)性、準(zhǔn)確性）明顯試劑盒質(zhì)量差異（重復(fù)性、準(zhǔn)確性）明顯 四、HPLC法在飼料霉菌檢測中的應(yīng)用 霉菌霉菌毒素毒素 名稱名稱提取液提取液凈化凈化檢測器檢測器備注備注黃曲霉毒素黃曲霉毒素甲醇甲醇- -水水免疫親和柱免疫親和柱多功能凈化柱多功能凈化柱熒光檢測器熒光檢測器串聯(lián)質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜熒光