最新PCR擴增和電泳檢測

1、實驗實驗13 DNA13 DNA片段的片段的PCRPCR擴增擴增1 1、用、用PCRPCR技術對技術對DNADNA進行擴增進行擴增2 2、用瓊脂糖凝膠電泳技術對擴增后的、用瓊脂糖凝膠電泳技術對擴增后的DNADNA進行檢測進行檢測 電電 泳泳觀察PCR反應反應 實驗步驟DNADNA在體內復制的條件是什么？在體內復制的條件是什么？模板：模板：酶：酶：原料、能量：原料、能量：解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等。聚合酶等。DNADNA分子的每條鏈分子的每條鏈dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP引物：引物：溫和的反應條件溫和的反應條件DNADNA分子的結構分子的結構合

2、成合成DNADNA分子的原料分子的原料脫氧核苷三磷酸脫氧核苷三磷酸合成合成DNADNA分子的原料分子的原料脫氧核苷三磷酸脫氧核苷三磷酸dATP dGTP dCTP dTTP 聚合反應機理聚合反應機理：53OPGOPA模板鏈CTA35引物3355OHOPGOPAOOHTP模板鏈CTA35引物333555POOHTPP35DNA聚合酶聚合酶不同細胞的細胞周期不同細胞的細胞周期 不同生物細胞不同生物細胞 需要的時間需要的時間細細 菌菌一般是一般是20203030分鐘分鐘蠶豆根尖細胞蠶豆根尖細胞17.317.3小時小時小鼠十二指腸細胞小鼠十二指腸細胞15.315.3小時小時人的肝細胞人的肝細胞2222

3、小時小時人的宮頸癌細胞人的宮頸癌細胞22.522.5小時小時PCRPCR技術可在技術可在幾小時內幾小時內，將特定核酸序列擴增將特定核酸序列擴增百萬倍百萬倍! !PCR的概念的概念 PCRPCR（ P Polymerase olymerase C Chain hain R Reaction,eaction,聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應）是指在體外，通過特異是指在體外，通過特異DNADNA引物引物擴增擴增核酸分子中核酸分子中某個某個特定區(qū)域特定區(qū)域的技術。的技術。 PCR的反應體系的反應體系DNA模板模板原料：原料： dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP) ； 酶：酶： Taq聚合酶聚合酶（

4、嗜熱細菌中分離得到）（嗜熱細菌中分離得到）引物：引物：（單鏈（單鏈DNA片段）片段）MgMg2+2+（維持酶活性所必需）（維持酶活性所必需）PCRPCR緩沖液：緩沖液：維持維持pH，保護，保護Taq酶酶 PCR技術原理技術原理變變 性性退火退火 延伸延伸 PCR三步曲三步曲 預變性預變性保溫保溫 變變 性性9095延伸延伸 7075退火退火 4060PCR儀儀用于用于PCR的預混液（的預混液（ 500 L 體系）：體系）： ddH2O 310 310 L L1010butter 5butter 50 0 L LMgClMgCl2 2 40 40 L LdNTPdNTP混合液混合液 2020 L

5、 L引物引物1 251 25 L L引物引物2 252 25 L L模板模板DNA 2525 L L Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 5 5 L L 標記一個微量離心管，用取樣器取標記一個微量離心管，用取樣器取20 L的預混液的預混液加入到該管中。加入到該管中。反應試劑反應試劑 用量用量PCR SuperMix 10L引物（濃度10M） 1L引物（濃度10M） 1L模板DNA 5LddH2O 3L總體積 20L微量可調移液器（微量可調移液器（一檔吸、二檔排一檔吸、二檔排） PCR反應參數(shù)反應參數(shù)： 變性變性 94 30 s退火退火 52 30 s延伸延伸 72 60 s 預變性預變性

6、 94 300 s保溫保溫 72 600 s循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 351、基本概念、基本概念 以瓊脂糖凝膠作為介質以瓊脂糖凝膠作為介質,DNA在外加電場的在外加電場的作用下泳動的技術。作用下泳動的技術。2、實驗原理、實驗原理 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。定于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠電泳基本原理瓊脂糖凝膠電泳基本原理使用使用電泳緩沖液在制膠器上配電泳緩沖液在制膠器上配制制1.0%的瓊脂糖凝膠。的瓊脂糖凝膠。2L載樣緩沖液、載樣緩沖液、 2L 核酸熒核酸熒光染料，光染料

7、，10LPCR產(chǎn)物混勻。產(chǎn)物混勻。將上步混好的樣將上步混好的樣10 L加到凝膠加到凝膠孔中孔中。90V電壓下電泳電壓下電泳1020min。瓊脂糖凝膠電泳的過程瓊脂糖凝膠電泳的過程將凝膠倒入制膠器的槽中將凝膠倒入制膠器的槽中（60oC）將瓊脂糖加入電泳緩沖液將瓊脂糖加入電泳緩沖液,在微波爐中在微波爐中加熱溶解至透明。加熱溶解至透明。將梳子從制膠槽中拔出將梳子從制膠槽中拔出 取出凝膠板放入電泳槽中取出凝膠板放入電泳槽中 向電泳槽中加入電泳緩沖液至沒過凝膠向電泳槽中加入電泳緩沖液至沒過凝膠 瓊脂糖凝膠電泳中瓊脂糖凝膠電泳中緩沖液的作用緩沖液的作用1 1、增加電導率；、增加電導率；2 2、維持電泳過程

8、中、維持電泳過程中的合適的的合適的pHpH。吸取吸取PCR反應產(chǎn)物反應產(chǎn)物10L。注意吸頭。注意吸頭要插入到管底，才能取到要插入到管底，才能取到PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物。 將將PCR產(chǎn)物與加樣緩沖液充分混合產(chǎn)物與加樣緩沖液充分混合（吸排幾次吸排幾次） 常用的上樣緩沖液配方及各成分的作用常用的上樣緩沖液配方及各成分的作用蔗糖蔗糖使樣品呈色，便于上樣，使樣品呈色，便于上樣，形成可見指示帶，預測電泳進程。形成可見指示帶，預測電泳進程。溴酚藍溴酚藍增加樣品密度，保證增加樣品密度，保證DNADNA均勻沉均勻沉入加樣孔內。入加樣孔內。核酸熒光染料核酸熒光染料可嵌合入可嵌合入DNADNA分子，在特定激發(fā)分子，在特定激發(fā)光源的激發(fā)下可發(fā)出熒光，熒光源的激發(fā)下可發(fā)出熒光，熒光強度與光強度與DNADNA含量成正比。含量成正比。（需要與加樣緩沖液混合）（需要與加樣緩沖液混合）進行電泳10-20分鐘 實驗用的核酸熒光染料與實驗用的核酸熒光染料與DNA嵌合后，在嵌合后，在DNA發(fā)射發(fā)射黃綠色黃綠色熒光。熒光。電泳結果的觀察電泳結果的觀察在在DNADNA電泳圖譜觀察儀中觀察核酸條帶并拍照。電泳圖譜觀察儀中觀察核酸條帶并拍照。PCR