第十章微生物分類,鑒定和菌種保藏

1、第十章第十章 微生物的分類、鑒定微生物的分類、鑒定和菌種保藏和菌種保藏Taxonomy, Identification, Conservation of Microbiology微生物分類鑒定目的微生物分類鑒定目的 分類是人類認識微生物，進而利用和改造微分類是人類認識微生物，進而利用和改造微生物的一種手段，微生物工作者只有在掌握了生物的一種手段，微生物工作者只有在掌握了分類學(xué)知識的基礎(chǔ)上，才能對紛繁的微生物類分類學(xué)知識的基礎(chǔ)上，才能對紛繁的微生物類群有一清晰的輪廊，了解其親緣關(guān)系與演化關(guān)群有一清晰的輪廊，了解其親緣關(guān)系與演化關(guān)系，為人類開發(fā)利用微生物資源提供依據(jù)。系，為人類開發(fā)利用微生物資源提

2、供依據(jù)。 Phylogeny of the Living World-Overview第一節(jié)第一節(jié) 微微 生生 物物 分分 類類 學(xué)學(xué)微生物分類學(xué)微生物分類學(xué)(Taxonomy) 是一門按微生物類群的親緣關(guān)系把它們安排是一門按微生物類群的親緣關(guān)系把它們安排成條理清楚的各種分類單元或分類群（成條理清楚的各種分類單元或分類群（Taxon）的科學(xué)的科學(xué) 分類學(xué)的任務(wù)分類學(xué)的任務(wù) 分類（分類（Classification）：是指根據(jù)相似性或）：是指根據(jù)相似性或親緣關(guān)系，將一個有機體放在一個單元中親緣關(guān)系，將一個有機體放在一個單元中 命名（命名（Nomenclature）：是按照國際命名法）：是按照國際

3、命名法規(guī)給予有機體一個科學(xué)的名稱規(guī)給予有機體一個科學(xué)的名稱 鑒定（鑒定（Identification）：是指確定一個新分）：是指確定一個新分離物是否歸屬于某個已命名的分類單元的過程。離物是否歸屬于某個已命名的分類單元的過程。 一、微生物的分類單位一、微生物的分類單位界（界（Kingdom） 門（門（Phylum or Division） 綱（綱（Class） 目（目（Order） 科（科（Family） 屬（屬（Genus） 種（種（Species） 種是最基本的分類單位。種是最基本的分類單位。 但分類單元之間科加入亞門、亞綱、亞目、亞但分類單元之間科加入亞門、亞綱、亞目、亞科等次要分類單位。

4、種以下又可分為亞種、變科等次要分類單位。種以下又可分為亞種、變種、型、菌株等種、型、菌株等 微生物種與亞種的概念微生物種與亞種的概念種種(Species) 凡是于典型培養(yǎng)菌緊密相同的其他培養(yǎng)菌共同統(tǒng)凡是于典型培養(yǎng)菌緊密相同的其他培養(yǎng)菌共同統(tǒng)一起來，區(qū)分為細菌的一個種（一起來，區(qū)分為細菌的一個種（Species），即是），即是以某個以某個“典型菌株典型菌株”為代表、十分類似的菌株的總稱。為代表、十分類似的菌株的總稱。1987年，國際細菌分類委員會頒布，年，國際細菌分類委員會頒布，DNA同源同源 70%，而且其，而且其Tm5oC的菌群為一個種的菌群為一個種 亞種（亞種（Subspecies) 在種

5、內(nèi)，有些菌株在遺傳學(xué)上關(guān)系密切，而且在表在種內(nèi)，有些菌株在遺傳學(xué)上關(guān)系密切，而且在表型上僅存在較小的某些差異，在種內(nèi)分成型上僅存在較小的某些差異，在種內(nèi)分成2個或個或2個個以上的分類單位，即為亞種以上的分類單位，即為亞種微生物亞種以下的變型分類微生物亞種以下的變型分類亞種以下亞種以下 生物變型生物變型表示特殊的生化或生理特征表示特殊的生化或生理特征 血清變型血清變型表示抗原結(jié)構(gòu)不同表示抗原結(jié)構(gòu)不同 致病變型致病變型表示某些寄主的專一致病性表示某些寄主的專一致病性 噬菌變型噬菌變型表示對噬菌體的特異性反應(yīng)表示對噬菌體的特異性反應(yīng) 形態(tài)變型形態(tài)變型表示特殊的形態(tài)特征表示特殊的形態(tài)特征 微微 生生

6、物物 的的 菌菌 株株菌株菌株(Strain)或稱品系或稱品系 是指同種微生物不同來源的純培養(yǎng)物即單個分是指同種微生物不同來源的純培養(yǎng)物即單個分離物的純培養(yǎng)后代，常以數(shù)字、字母、人命或地名離物的純培養(yǎng)后代，常以數(shù)字、字母、人命或地名等表示等表示 分離物是指已分離得到但為經(jīng)鑒定的純培養(yǎng)物分離物是指已分離得到但為經(jīng)鑒定的純培養(yǎng)物的后代即為分離物的后代即為分離物 群群(Group) 為工作方便而將近似的種或介于種間的菌株按為工作方便而將近似的種或介于種間的菌株按其形態(tài)或結(jié)合生理生化、生態(tài)特征歸為若干類群。其形態(tài)或結(jié)合生理生化、生態(tài)特征歸為若干類群。如放線菌中的鏈霉菌屬內(nèi)的種歸為如放線菌中的鏈霉菌屬內(nèi)

7、的種歸為12個類群個類群 二、微二、微 生生 物物 的的 命命 名名1 微生物的命名按國際命名法命名，即微生物的命名按國際命名法命名，即Linna所創(chuàng)立的所創(chuàng)立的“雙名法雙名法” 每一種微生物都用屬與種命名，由每一種微生物都用屬與種命名，由2個拉丁詞或希臘個拉丁詞或希臘詞或拉丁化了的其他文字組成。屬名和種名用斜體表詞或拉丁化了的其他文字組成。屬名和種名用斜體表達達 屬名在前，用拉丁名詞表示微生物的構(gòu)造、形態(tài)、屬名在前，用拉丁名詞表示微生物的構(gòu)造、形態(tài)、某科學(xué)家名字等，描述微生物的主要特征。第一字母某科學(xué)家名字等，描述微生物的主要特征。第一字母大寫大寫 種名在后，第一字母小寫。用拉丁形容詞表示，

8、描種名在后，第一字母小寫。用拉丁形容詞表示，描述微生物的色素、形狀、來源、病名、地名、某科學(xué)述微生物的色素、形狀、來源、病名、地名、某科學(xué)家的名字等等家的名字等等 在種名后，附上命名者的姓和命名年份在種名后，附上命名者的姓和命名年份 微微 生生 物物 的的 命命 名名2 2 如命名對象是新種，需在種名后加如命名對象是新種，需在種名后加n.sp (即即novo species) 如僅泛指某一屬的微生物，或某屬微生物內(nèi)的某些如僅泛指某一屬的微生物，或某屬微生物內(nèi)的某些種，則在屬名后用種，則在屬名后用sp.（單數(shù)時）或（單數(shù)時）或spp.（復(fù)數(shù)時）（復(fù)數(shù)時） 如需表示變種，則在變種學(xué)名前加如需表示變

9、種，則在變種學(xué)名前加var., 變種學(xué)名命變種學(xué)名命名原則與種名的命名同名原則與種名的命名同 Staphylococcus aureus Rosenbach 1884 屬名：葡萄球菌屬名：葡萄球菌 種名：金黃色種名：金黃色 命名者姓命名者姓 命名年命名年份份 Bacillus subtilis var. niger Desulfotomaculum thermoacetoxidans n. sp. Strain CAMZ三、微生物系統(tǒng)發(fā)育分析三、微生物系統(tǒng)發(fā)育分析 由于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，正在形成一由于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，正在形成一套與傳統(tǒng)的分類鑒定方法完全不同的分類鑒定技

10、術(shù)與套與傳統(tǒng)的分類鑒定方法完全不同的分類鑒定技術(shù)與方法，從基因水平上分析各微生物種之間的親緣關(guān)系，方法，從基因水平上分析各微生物種之間的親緣關(guān)系，即系統(tǒng)發(fā)育地位。即系統(tǒng)發(fā)育地位。 原核生物細胞中的原核生物細胞中的16S rDNA 和真核生物細胞中的和真核生物細胞中的18S rDNA的堿基序列都是十分保守的，不受微生物所的堿基序列都是十分保守的，不受微生物所處環(huán)境條件的變化、營養(yǎng)物質(zhì)的豐缺的影響而有所變處環(huán)境條件的變化、營養(yǎng)物質(zhì)的豐缺的影響而有所變化，都可以看作為生物進化的時間標(biāo)尺，記錄著生物化，都可以看作為生物進化的時間標(biāo)尺，記錄著生物進化的真實痕跡。因此，分析原核生物細胞中的進化的真實痕跡。

11、因此，分析原核生物細胞中的16S rDNA 和真核生物細胞中的和真核生物細胞中的18S rDNA的堿基序列，比的堿基序列，比較所分析的微生物與其他微生物種之間較所分析的微生物與其他微生物種之間16S rDNA和和18S rDNA序列的同源性，可以真實地揭示它們親緣關(guān)序列的同源性，可以真實地揭示它們親緣關(guān)系的距離和系統(tǒng)發(fā)育地位。系的距離和系統(tǒng)發(fā)育地位。 系統(tǒng)發(fā)育研究方法系統(tǒng)發(fā)育研究方法 除了選擇除了選擇16S rDNA和和18S rDNA作序列分析作序列分析進行系統(tǒng)發(fā)育比較外，進行系統(tǒng)發(fā)育比較外， 還可利用間隔序列還可利用間隔序列(ITS)、某些發(fā)育較為古老而序列又較穩(wěn)定的特、某些發(fā)育較為古老而

12、序列又較穩(wěn)定的特異性酶的基因作序列分析，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。異性酶的基因作序列分析，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。 如在環(huán)境微生物研究中，對于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶如在環(huán)境微生物研究中，對于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）的基因序列分析所獲得的系統(tǒng)發(fā)育鑒）的基因序列分析所獲得的系統(tǒng)發(fā)育鑒定結(jié)果與用其他方法所獲得的結(jié)果具有十分吻定結(jié)果與用其他方法所獲得的結(jié)果具有十分吻合的一致性。合的一致性。系統(tǒng)學(xué)系統(tǒng)學(xué)（systematics） 系統(tǒng)學(xué)（系統(tǒng)學(xué)（systematics）是研究生物多樣性及其分類）是研究生物多樣性及其分類和演化關(guān)系的科學(xué)。分子系統(tǒng)學(xué)是檢測、描述并揭示生和演化關(guān)系的科學(xué)。分子系統(tǒng)學(xué)是檢測、描述并揭示生物在分子水平

13、上的多樣性及其演化規(guī)律的科學(xué)。研究內(nèi)物在分子水平上的多樣性及其演化規(guī)律的科學(xué)。研究內(nèi)容包括了群體遺傳結(jié)構(gòu)、分類學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育和分子進化容包括了群體遺傳結(jié)構(gòu)、分類學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育和分子進化等領(lǐng)域。等領(lǐng)域。 群體遺傳結(jié)構(gòu)群體遺傳結(jié)構(gòu)(population genetic structure)是指一是指一個種內(nèi)總的遺傳變異程度及其在群體間的分布模式，是個種內(nèi)總的遺傳變異程度及其在群體間的分布模式，是一個種最基礎(chǔ)的遺傳信息。一個種最基礎(chǔ)的遺傳信息。 分類學(xué)分類學(xué)(taxonomy)是研究物種的界定和序級確定。是研究物種的界定和序級確定。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(phylogenetic relationsh

14、ip)和分子進化和分子進化(molecular evolution)是兩個密切相關(guān)的過程。是兩個密切相關(guān)的過程。 在利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在分子和基因水平上獲得大在利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在分子和基因水平上獲得大量的分類單元尤其是種的遺傳信息后，來推斷和重建微量的分類單元尤其是種的遺傳信息后，來推斷和重建微生物類群的演化歷史和演化關(guān)系，即建立系統(tǒng)發(fā)育樹。生物類群的演化歷史和演化關(guān)系，即建立系統(tǒng)發(fā)育樹。 細菌系統(tǒng)發(fā)育樹細菌系統(tǒng)發(fā)育樹古菌的系統(tǒng)發(fā)育樹古菌的系統(tǒng)發(fā)育樹第二節(jié)第二節(jié) 原核微生物分類系統(tǒng)原核微生物分類系統(tǒng)一、原核微生物伯杰氏分類系統(tǒng)一、原核微生物伯杰氏分類系統(tǒng)伯杰氏細菌鑒定手冊伯杰氏細菌鑒

15、定手冊 伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊細細 菌菌 分分 類類 系系 統(tǒng)統(tǒng)最有代表性和最有影響的細菌分類系統(tǒng)最有代表性和最有影響的細菌分類系統(tǒng) 伯杰氏細菌鑒定手冊伯杰氏細菌鑒定手冊 （Bergeys Manual of Determinative Bacteriology) 1923年年, 1925年年, 1930年年, 1934年年, 1939年年, 1948年年, 1957年年, 1974年分別出版了第一至第年分別出版了第一至第八版，八版，1994年出了第九版年出了第九版 以形態(tài)、生理生化、以形態(tài)、生理生化、G + C mol%、生態(tài)分布、生態(tài)分布等特征為主等特征為主伯杰氏系統(tǒng)細菌

16、學(xué)手冊伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊（Bergeys Manual of Systematic Bacteriology) second edition 2001 以生理生化、以生理生化、G + C mol%、系統(tǒng)發(fā)育地、系統(tǒng)發(fā)育地位等為主位等為主體現(xiàn)了現(xiàn)代分子生物學(xué)的體現(xiàn)了現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究成果研究成果 尚未出齊尚未出齊細菌的分類高級單位細菌的分類高級單位原核生物界原核生物界（Procaryotae) 薄壁菌門薄壁菌門(Gracilicutes) 暗細菌綱暗細菌綱 (Scotobacteria) 無氧光細菌綱無氧光細菌綱(Anoxyphotobacteria) 產(chǎn)氧光細菌綱產(chǎn)氧光細菌綱(Oxypho

17、tobacteria) 厚壁菌門厚壁菌門(Fimicutes) 厚壁菌綱厚壁菌綱(Fimibacteria) 放線菌綱放線菌綱 (Thallobacteria) 軟壁菌綱軟壁菌綱(Tenericutes) 柔膜菌綱柔膜菌綱 (Mollicutes) 疵壁菌門疵壁菌門(Mendosicutes) 古細菌綱古細菌綱(Archarbacteria)二、關(guān)于變形細菌二、關(guān)于變形細菌(Proteobacteria)綱綱 1 運用運用DNA/RNA雜交、雜交、16S rRNA編目法和編目法和16S rRNA序列序列分析方法對革蘭氏陰性細菌系統(tǒng)發(fā)育研究的結(jié)果相當(dāng)一致。分析方法對革蘭氏陰性細菌系統(tǒng)發(fā)育研究的結(jié)

18、果相當(dāng)一致。在研究過程中，發(fā)現(xiàn)在研究過程中，發(fā)現(xiàn)“紫細菌和相關(guān)細菌紫細菌和相關(guān)細菌”，盡管在表型和基，盡管在表型和基因型方面很不一樣即相當(dāng)異源，但在系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖譜上具因型方面很不一樣即相當(dāng)異源，但在系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖譜上具有連續(xù)現(xiàn)象，相互之間的進化關(guān)系很為密切。有連續(xù)現(xiàn)象，相互之間的進化關(guān)系很為密切。1988年，年，Stackebrandt等將這類革蘭氏陰性細菌命名為等將這類革蘭氏陰性細菌命名為“變形細菌變形細菌”（Proteobacteria），其下由），其下由a-亞綱、亞綱、b-亞綱，亞綱，g-亞綱、亞綱、d-亞綱和亞綱和e-亞綱。亞綱。關(guān)于變形細菌關(guān)于變形細菌(Proteobacteria

19、)綱綱 2 a-亞綱亞綱包括一大群形態(tài)、生理和營養(yǎng)類型（光能自養(yǎng)型、化能無機營包括一大群形態(tài)、生理和營養(yǎng)類型（光能自養(yǎng)型、化能無機營養(yǎng)型和化能有機營養(yǎng)型）等表型特征十分不同的細菌，如土壤桿菌養(yǎng)型和化能有機營養(yǎng)型）等表型特征十分不同的細菌，如土壤桿菌（Agrobacterium）、根瘤菌）、根瘤菌(Rhizobium)、紅假單胞菌、紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)、發(fā)酵單胞菌、發(fā)酵單胞菌(Zymomonas)、副球菌等、副球菌等(Paracoccus)、立克次氏體（、立克次氏體（Rickettsia）等。）等。 b-亞綱亞綱由由Woese于于1984年提出，包括的菌群有色桿菌屬年提

20、出，包括的菌群有色桿菌屬(Chromobacterium)，水螺菌屬，水螺菌屬(Aquaspirillum)，紫色桿菌，紫色桿菌(Janthinobacterium)，德克斯氏菌，德克斯氏菌(Derxia)，叢毛單胞菌，叢毛單胞菌(Comamonas)，嗜木桿菌（嗜木桿菌（Xylophilus）等。）等。 g-亞綱亞綱由由Weose1985年提出，包括了腸桿菌科年提出，包括了腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，氣單胞菌科氣單胞菌科(Aeromonadaceae)，弧菌科，弧菌科(Vibrionaceae)，巴斯德菌科，巴斯德菌科(Pasteurellaceae)，假單胞菌，假單胞

21、菌(Pseudomonas)，海洋螺菌，海洋螺菌(Oceanospirillum)，黃單胞菌，黃單胞菌(Xanthomonas)，溶桿菌，溶桿菌(Lysobacter)等等 d-亞綱亞綱由分解代謝的硫酸鹽還原細菌、元素硫還原細菌，蛭弧菌由分解代謝的硫酸鹽還原細菌、元素硫還原細菌，蛭弧菌(Bdellovibrio)和黏細菌目和黏細菌目(Myxococcales)的的6個代表。個代表。 e-亞綱亞綱僅有彎曲桿菌僅有彎曲桿菌(Campylobacter)和螺桿菌和螺桿菌(Heliobacter)2屬屬。 變形變形菌綱菌綱細菌細菌 第三節(jié)第三節(jié) 原核微生物的分類原核微生物的分類鑒定方法鑒定方法 Cla

22、ssification and Identification of Procaryotes微生物的分類技術(shù)水平微生物的分類技術(shù)水平微生物分類中使用的技術(shù)水平微生物分類中使用的技術(shù)水平 細胞形態(tài)水平細胞形態(tài)水平 細胞組分水平細胞組分水平 蛋白質(zhì)水平蛋白質(zhì)水平 基因組水平基因組水平 微生物的分類方法微生物的分類方法 1經(jīng)典分類鑒定法經(jīng)典分類鑒定法 形態(tài)特征形態(tài)特征：個體個體 群體群體 生理生化特征：營養(yǎng)要求（碳源，氮源，生生理生化特征：營養(yǎng)要求（碳源，氮源，生 長因子）；代謝產(chǎn)物（種類，產(chǎn)量，顯色反應(yīng)等）；長因子）；代謝產(chǎn)物（種類，產(chǎn)量，顯色反應(yīng)等）；酶（產(chǎn)酶種類，反應(yīng)特性等）酶（產(chǎn)酶種類，反應(yīng)特

23、性等） 生態(tài)學(xué)特征：生長溫度，對氧需要，酸堿要求，生態(tài)學(xué)特征：生長溫度，對氧需要，酸堿要求，宿主種類等宿主種類等 血清學(xué)反應(yīng)血清學(xué)反應(yīng) 噬菌體的敏感性噬菌體的敏感性 其他其他微生物的分類方法微生物的分類方法2 2數(shù)值分類法又稱阿得遜氏法數(shù)值分類法又稱阿得遜氏法（Adansonian classification) 以兩兩菌株的形態(tài)、生理生化特征，對環(huán)境以兩兩菌株的形態(tài)、生理生化特征，對環(huán)境的反應(yīng)和忍受性及生態(tài)特征為依據(jù)的反應(yīng)和忍受性及生態(tài)特征為依據(jù) 由計算機計算兩者之間的總近似值，列出相由計算機計算兩者之間的總近似值，列出相似值矩陣，將相似度高的菌株列在一起，然后似值矩陣，將相似度高的菌株列在

24、一起，然后將矩陣圖轉(zhuǎn)換成樹狀譜（將矩陣圖轉(zhuǎn)換成樹狀譜（Dendrogram)(見下見下一張）一張）微生物的數(shù)值法分類微生物的數(shù)值法分類微生物的分類方法微生物的分類方法3化學(xué)分類法化學(xué)分類法（Chemotaxonomy） 根據(jù)微生物細胞的特征性化學(xué)組成分對微生物進根據(jù)微生物細胞的特征性化學(xué)組成分對微生物進行的分類方法行的分類方法 細菌細胞化學(xué)組分在分類上的應(yīng)用細菌細胞化學(xué)組分在分類上的應(yīng)用微生物分類方法微生物分類方法4 4遺傳學(xué)分類方法遺傳學(xué)分類方法 DNA中中G+C含量百分比分析含量百分比分析 細菌含量變化范圍在細菌含量變化范圍在25%75%，放線菌在，放線菌在37% 51%。2 種之間差異超

25、過種之間差異超過10%，肯定不是同一個種，肯定不是同一個種 DNA-DNA雜交雜交 測定雜合的百分數(shù)，如同一種，應(yīng)為測定雜合的百分數(shù)，如同一種，應(yīng)為100% DNA-rRNA雜交雜交 16SrRNA寡核苷酸的序列分析寡核苷酸的序列分析 分析后作出相似性圖，關(guān)系近的集中到一起，關(guān)系遠的分析后作出相似性圖，關(guān)系近的集中到一起，關(guān)系遠的在圖上占據(jù)不同的位置在圖上占據(jù)不同的位置 菌株菌株16S rRNA16S rRNA基因的分離基因的分離 從平板中直接挑取一環(huán)分離菌株細胞從平板中直接挑取一環(huán)分離菌株細胞, , 加入加入100L100L無無菌重蒸菌重蒸H H2 2O O中中, , 旋渦混勻后旋渦混勻后,

26、 , 沸水浴沸水浴2min, 12 000r 2min, 12 000r minmin-1-1離心離心5min, 5min, 上清液中即含上清液中即含16S rRNA16S rRNA基因，可直接基因，可直接用于用于PCRPCR擴增。擴增。 分離菌株分離菌株16S rRNA16S rRNA 基因的基因的PCRPCR擴增和序列測定的一擴增和序列測定的一般步驟為：般步驟為：16S rRNA16S rRNA基因的基因的PCRPCR引物：引物：5-AGAGT 5-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3TTGAT CCTGG CTCAG-3；5-AAGGA GGTGA TCCAG 5-AAGG

27、A GGTGA TCCAG CCGCA-3CCGCA-3。擴增反應(yīng)體積。擴增反應(yīng)體積5050 L L，反應(yīng)條件為，反應(yīng)條件為9595預(yù)變預(yù)變性性5min5min，9494變性變性1min1min，5555退火退火1min1min，7272延伸延伸2min2min，共進行，共進行2929個循環(huán)，個循環(huán)，PCRPCR反應(yīng)在反應(yīng)在PTC-200PTC-200型熱循環(huán)型熱循環(huán)儀上進行。取儀上進行。取5 5 L L反應(yīng)液在反應(yīng)液在10g L10g L-1-1的瓊脂糖凝膠上進行的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。電泳檢測。 PCRPCR產(chǎn)物測序可由專門技術(shù)公司完成。產(chǎn)物測序可由專門技術(shù)公司完成。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建系

28、統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 測序得到分離菌株測序得到分離菌株16S rDNA部分序列，此序列一般部分序列，此序列一般以以*.f.seq形式保存，可以用寫字板或形式保存，可以用寫字板或Editsequence軟軟件打開，將所得序列通過件打開，將所得序列通過Blast程序與程序與GenBank中核中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析酸數(shù)據(jù)進行比對分析( /blast )。 具體步驟如下：點擊網(wǎng)站中具體步驟如下：點擊網(wǎng)站中Nucleotide BLAST下下Nucleotide-nucleotide BLAST blastn選項，將測選項，將測序所得序列粘貼在序所得序列粘貼

29、在“search”網(wǎng)頁空白處，或輸入測網(wǎng)頁空白處，或輸入測序結(jié)果所在文件夾目錄，點擊核酸比對選項，即序結(jié)果所在文件夾目錄，點擊核酸比對選項，即“blast”，然后點擊，然后點擊“format”，計算機自動開始搜索，計算機自動開始搜索核苷酸數(shù)據(jù)庫中序列并進行序列比較，根據(jù)同源性高核苷酸數(shù)據(jù)庫中序列并進行序列比較，根據(jù)同源性高低列出相近序列及其所屬種或?qū)?，以及菌株相關(guān)信息，低列出相近序列及其所屬種或?qū)?，以及菌株相關(guān)信息，從而初步判斷從而初步判斷16S rDNA鑒定結(jié)果。鑒定結(jié)果。 遺傳距離矩陣遺傳距離矩陣 遺傳距離矩陣與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，可采用遺傳距離矩陣與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，可采用DNAStarDNA

30、Star軟件包中的軟件包中的MegAlignMegAlign程序計算樣本間程序計算樣本間的遺傳距離。由的遺傳距離。由GenBankGenBank中得到相關(guān)菌株的序列，中得到相關(guān)菌株的序列，與本研究分離菌株所測得序列一起輸入與本研究分離菌株所測得序列一起輸入Clustalx1.8Clustalx1.8程序進行程序進行DNADNA同源序列排列，并經(jīng)同源序列排列，并經(jīng)人工仔細核查。人工仔細核查。 在此基礎(chǔ)上，序列輸入在此基礎(chǔ)上，序列輸入Phylip3.6Phylip3.6軟件包，以軟件包，以簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Kimura 2-Kimura 2-parameterpa

31、rameter法，系統(tǒng)樹各分枝的置信度經(jīng)重抽樣法，系統(tǒng)樹各分枝的置信度經(jīng)重抽樣法（法（BootstrapBootstrap）500500次重復(fù)檢測，次重復(fù)檢測，DNADNA序列變序列變異中的轉(zhuǎn)換和顛換賦于相同的加權(quán)值。異中的轉(zhuǎn)換和顛換賦于相同的加權(quán)值。Phylogeny of the Living World-BacteriaPhyloge-ny of the Living World-BacteriaPhylogeny of the Living World-Archaea第四節(jié)第四節(jié) 微生物菌種的保藏微生物菌種的保藏一、微生物菌種的保藏要求一、微生物菌種的保藏要求微生物菌種保藏的要求：微生物菌種保藏的要求： 是廣泛收集各種研究、教學(xué)和生產(chǎn)性菌種，是廣泛收集各種研究、教學(xué)和生產(chǎn)性菌種，滿足各方面需求；滿足各方面需求； 高質(zhì)量保藏，即要求保藏的菌種不死亡、高質(zhì)量保