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文檔簡介
1、第一次討論課第一次討論課1人類基因組人類基因組DNADNA提取、限制性核酸內(nèi)提取、限制性核酸內(nèi)切酶切割的原理、方法、瓊脂糖凝膠切酶切割的原理、方法、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用。電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用。2 人類基因組DNA提取可以從外周血,肝或脾組織取材,也可以無創(chuàng)傷的采集材料,如用口腔上皮脫落細胞,發(fā)根細胞。提取方法有經(jīng)典酚醇法、鹽析法、煮沸法。 以下以酚醇法提取外周血白細胞DNA為例3原理原理l原則保證DNA一級結(jié)構(gòu)的完整。減少細胞內(nèi)DNase對DNA的降解。排除蛋白質(zhì),其他核酸及有機溶劑分子的污染。原理原理4lDNA和蛋白質(zhì)的性質(zhì)DNA整體表現(xiàn)為酸性,帶負電。是極性化合物,微溶于水,不溶
2、于乙醇,苯酚,氯仿,乙醚等有機溶劑,形成沉淀。從而被分離提取出來。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團,也容易進行水合作用,并在表面形成一層水化層,使蛋白質(zhì)分子能順利地進入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當有機溶液存在時,蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞,變性沉淀,從而被除去。5l相關(guān)試劑及作用細胞裂解液 :82.9g NH4CL,10gKHCO3,0.37gEDTANA2, 滅菌雙蒸水定容至1000mL EDTANA2是一種血液抗凝劑低滲溶液使細胞膜漲破,白細胞釋放細胞核,紅細胞釋放血紅蛋白 細胞核裂解液(STE):0.1 mol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA
3、 使核膜破裂,釋放染色質(zhì) EDTA是一種血液抗凝劑,同時抑制核酸酶活性,防止DNA被水解。6RNase是RNA酶,能水解去除DNA中的RNASDS(十二烷基硫酸鈉)是一種去污劑,能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,成為易溶于水的復(fù)合物。從而破壞蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合,使DNA釋放出來。蛋白酶K是一種很強的蛋白水解酶,在SDS中穩(wěn)定。水解各種蛋白質(zhì)(包括糖蛋白和肽類,和脂類,胺類物質(zhì))。同時由于RNA酶和DNA酶是蛋白質(zhì),也可被水解,從而防止DNA被水解。7酚是蛋白質(zhì)的變性劑,并將變性的蛋白質(zhì)溶解其中。而DNA則溶解于水相。氯仿也是蛋白質(zhì)的變性劑,促進兩相分離,并除去DNA溶液中的酚。無水乙醇:DNA不溶于其中,
4、沉淀DNA70%乙醇:溶解其他有機溶劑, 而DNA幾乎不溶于其中, 洗滌DNA沉淀。洗滌完后, 乙醇易揮發(fā)。8l注意事項操作時要戴手套,因為苯酚是腐蝕劑,另外防止手上的核酸酶或細菌污染DNA樣品。9方法方法加入細胞裂解液和細胞核裂解液,裂解細胞和細胞核,釋放染色質(zhì)加入RNase,SDS,蛋白酶K等,水解RNA和蛋白質(zhì)酚:氯仿(1:1)分離DNA70%乙醇,漂洗DNA無水乙醇沉淀TE緩沖液溶解DNA。,-20保存。取材。EDTANA2抗凝處理的新鮮全血10限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶l定義 限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別特定的核苷酸序列,并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的
5、一類酶,簡稱限制酶。磷酸二酯鍵11l分類 根據(jù)酶的功能特性、大小及反應(yīng)時所需的輔助因子 I類酶在DNA分子上沒有特異性的酶解片斷 類酶在DNA分子上有特異性的酶解片斷12原理原理l識別特定的核苷酸序列(識別序列多為回文序列)l在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割13切割方法切割方法l生成平末端 有一些酶沿識別序列對稱軸切斷DNA,產(chǎn)生的末端稱為平端或鈍端。例如:SmaI14l生成粘性末端 切點是交錯的,生成兩條單鏈末端的堿基是互補的,切后末端可以粘接起來,稱為粘性末端。黏性末端的片段可自行復(fù)性,易于通過DNA連接酶把斷裂點接上而復(fù)原。不同來源的DNA用同一限制性內(nèi)切酶切后生成
6、的片段由于具有粘性末端可通過氫鍵互補地粘接,再用DNA連接酶連成重組的DNA分子,因此該酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用使基因工程成為可能。如EcoR I 5-G GAATTCAATTC-3 5-G G AATTC AATTC-3 3-CTTAACTTAAG G-5 3-CTTAACTTAA G G-515氫氧化鐵膠體在直流電作用下移向陰極,這是大家熟悉的電泳實驗現(xiàn)象。后來發(fā)展起來可以減少外界干擾的區(qū)帶電泳技術(shù),這是一種用固體作支持介質(zhì)的電泳技術(shù),待分離物質(zhì)通過在支持介質(zhì)中移動而得以分離成若干區(qū)帶。如果用瓊脂糖凝膠作支持介質(zhì),這種區(qū)帶電泳技術(shù)則稱為瓊脂糖凝膠電泳。16在電場作用下,DNA和RNA之類生物大分子可
7、在瓊脂糖凝膠中運動。由于分子泳動速率與分子大小和分子構(gòu)型有關(guān),因而可將不同大小的分子,或分子大小相同但構(gòu)型不同的分子分離開來。瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)在當代已經(jīng)成為一種極其重要的分析手段,廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)、衛(wèi)生及環(huán)保等許多領(lǐng)域。17什么是瓊脂糖凝膠什么是瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)使用瓊脂糖凝膠作為固體介質(zhì)。從海藻提取出的瓊脂中可以分離出一種膠狀多糖,稱為瓊脂糖。瓊脂糖通常為自色粉末,有時稍帶色。它的主要成分為交替連接的D-吡喃半乳糖和3,6-脫水-L-吡喃半乳糖基。瓊脂糖分子中含有很多羥基,羥基之間的氫鍵使瓊脂糖分子聚集,成為形成凝膠的主要作用力。1819瓊脂
8、糖形成凝膠的過程如圖3所示。在加熱條件下,瓊脂糖溶于水,形成溶液。當該溶液的溫度降至45左右時,多糖鏈(圖3左部)通過鏈間的氫鍵形成雙螺旋結(jié)構(gòu)(圖3中部)。雙螺旋之間通過氫鍵相連成束,束間再通過氫鍵作用形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖3右部),即凝膠36。由于維系三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的作用力主要是氫鍵,因此能破壞氫鍵的因素都能破壞瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中存在大量微孔,這就是DNA分子在凝膠中移動的通道。202122在一定的電場強度下,相同構(gòu)型的DNA分子,在凝膠中的遷移速率與分子量的對數(shù)值呈反比關(guān)系,因此可以將不同分子量的DNA分開。分子量相同時,不同構(gòu)型DNA分子的遷移速率也不同,也可以分開。圖展示
9、了DNA的3種分子構(gòu)型。通常,超螺旋DNA的遷移速率最快,線性DNA次之,開環(huán)DNA最慢。因此,瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)成為分離、鑒定DNA混合物的常用方法。23電泳是如何實現(xiàn)分離DNA的電泳實驗過程通常包含4個環(huán)節(jié)。將瓊脂糖在水中加熱到90以上使其溶解后,趁熱倒入制膠板中,讓它在室溫下自然凝固,形成半固體狀的無色透明凝膠片。這一步稱為制膠。2425制膠板中事前插有梳子,當凝膠形成后,移去梳子,膠片中就留下了小孔。將這樣的凝膠片放人電泳槽(圖7),加入電泳液后,向小孔中加入待分離的DNA樣品。這一步稱為點樣,通常的點樣量只有幾個微升。接通電源,在電場的作用下,DNA分子在凝膠的孔隙中向正極移動,這就
10、是電泳。2627分子量不同或構(gòu)型不同的DNA分子的電泳速率不同,因此可以分離開來。由于DNA本身無色,所以需要加入一種有色指示劑,來幫助人們確定它移動到了什么位置。所用指示劑一般分子量很小,電泳速率較快,跑在泳帶的最前端,可以根據(jù)它的位置及時終止電泳。實驗中還需要加入某種熒光染色劑,它與DNA的結(jié)合體在紫外光照射下發(fā)出熒光,從而將分離出的DNA條帶顯示出來。28圖1就是加有熒光染色劑的樣品在紫外光下拍攝的照片。將實驗樣品與DNA標準樣品同時電泳,比對2者的條帶位置,就可以鑒定分離出的DNA的分子量或構(gòu)型。29瓊脂糖凝膠電泳可以:(1)用于DNA切膠回收;(2)用于DNA分離;(3)用于佐證DN
11、A是否重組、質(zhì)粒等是否切開以及其他分子生物學(xué)研究。30第一次討論課第一次討論課 (2 2)第第3 3組組 口腔口腔14011401班班31 原理 方法 注意事項 結(jié)果鑒定人類細胞質(zhì)RNA提取 原理 方法RT-PCR的原理、方法 原理 結(jié)果分析 應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用32人類細胞質(zhì)人類細胞質(zhì)RNARNA提取提取 真核細胞總RNA主要由rRNA(80-85%)、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA(1-5%)組成,其中rRNA、tRNA和mRNA位于細胞質(zhì)中。 RNA提取實質(zhì)就是將細胞裂 解,釋放RNA,并通過不同方式去除蛋白、DNA等雜質(zhì)最終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過程
12、。AAAAAAAAAAAAtRNAmRNArRNA33人類細胞質(zhì)人類細胞質(zhì)RNARNA提取提取 RNA是一類極易降解的分子,要得到完整的RNA必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對RNA的降解。在分離RNA的過程中,用抑制劑以抑制RNA酶的活性。 RNA提取對樣品的新鮮性要求非常高,獲取樣品后最好立即提取RNA,若無條件立即實驗,應(yīng)于-80或液氮中保存樣品,取出樣品后立即在低溫下研磨裂解細胞,以防RNA降解。建立一個無RNA酶的環(huán)境Trizol法342/4/2022DEPC,焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯 RNA操作時最常用的RNase抑制劑,對核酸酶有很強的抑制作用。作用機制是與蛋
13、白質(zhì)中的活性基團組氨酸結(jié)合,使蛋白質(zhì)變性。 使用方法:用來去除溶液中的RNase 。RNA提取中 所有液體試劑都應(yīng)該用DEPC處理。 有效濃度:0.05%-0.1%,室溫磁力攪拌20分鐘。 滅活條件:高壓消毒,或70 C 1 h。 在Tris溶液中半衰期為1.25min。 儲存方法:不能用聚苯乙烯器皿。4 C ,或液氮中。35人類細胞質(zhì)人類細胞質(zhì)RNARNA提取提取 Trizol是一種苯酚與異硫氰酸胍(GTC)的混合物。 異硫氰酸胍可裂解細胞,并使RNA與蛋白質(zhì)分離。酸性苯酚促使RNA進入水相,離心后,RNA保留在水相中,DNA和蛋白質(zhì)保留在有機相中。轉(zhuǎn)移水相,加入異丙醇沉淀RNA,從而得到純
14、化的總RNA。36人類細胞質(zhì)人類細胞質(zhì)RNARNA提取提取破碎組織分離RNA沉淀RNA融解RNA保存RNA洗滌RNAl 可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、蛋白酶K等破碎組織l 加入-ME可抑制RNA酶的活性l 一般用酚、氯仿等有機溶劑,加入少量異戊醇,離心。RNA分層于上部。l 一般用乙醇、3M NaAc 或異丙醇l 使用70%乙醇洗滌,洗滌后可以曬干或烤干乙醇(但是不能過于干燥,否則不易溶解)37人類細胞質(zhì)人類細胞質(zhì)RNARNA提取提取u塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上,高壓滅菌。u有機玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室溫10min,然后用0.1
15、%DEPC水沖洗,晾干。 u所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤6h或更長時間。 u配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1% DEPC在37處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應(yīng)當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制,然后經(jīng)濾膜過濾除菌。 RNARNA酶廣泛存在而穩(wěn)定,可耐受多種處理而不被滅活酶廣泛存在而穩(wěn)定,可耐受多種處理而不被滅活38人類細胞質(zhì)人類細胞質(zhì)RNARNA提取提取u全程佩戴一次性手套。皮膚帶有細菌和外源性核糖核酸酶,可能污染RNA。392/4/20224內(nèi)因:核糖殘基的2和3位置帶有羥基,易被水解4外因:內(nèi)源、外源RNA酶含量豐富,加熱后仍能夠正確折疊
16、恢復(fù)活性,不易失活40人類細胞質(zhì)人類細胞質(zhì)RNARNA提取提取 完整的RNA的電泳可明顯地觀察到28S和18S兩條帶,并且28S大約是18S的兩倍寬。 若兩條帶不明顯, 則說明RNA部分降解。 41人類細胞質(zhì)人類細胞質(zhì)RNARNA提取提取42RT-PCR RT-PCR 原理及方法原理及方法逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR原理及方法原理及方法43知識背景基因表達44RT-PCR原理簡介 RNAcDNA目的目的片段片段PCRRTl實質(zhì)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)廣泛應(yīng)用的變形.45知識背景RT (reverse transcription )即逆轉(zhuǎn)錄,指以RNA為模板合成DNA的過程,即RNA指導(dǎo)下的DNA合
17、成。逆轉(zhuǎn)錄過程是RNA病毒的復(fù)制形式之一,需逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。RNA cDNA逆轉(zhuǎn)錄46RT逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇RNA cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三種活性:1.依賴RNA的DNA聚合酶活性:以RNA為模板合成cDNA第一條鏈;2.Rnase水解活性:由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子;3.依賴DNA的DNA聚合酶活性:以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板,以dNTP為底物,再合成第二條DNA鏈。4.常見的有哺乳動物型,最適溫度37度,禽類最適溫度42度4748RT實驗要素-決定
18、反應(yīng)的特異性和靈敏性* 分離高質(zhì)量分離高質(zhì)量RNA * 使用高活性的逆轉(zhuǎn)錄酶使用高活性的逆轉(zhuǎn)錄酶* 提高逆轉(zhuǎn)錄酶保溫溫度提高逆轉(zhuǎn)錄酶保溫溫度* 減少基因組減少基因組DNA污染污染48知識背景PCR (Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈式反應(yīng),是指在DNA聚合酶催化下,以母鏈DNA為模板,以特定引物為延伸起點,通過變性、退火、延伸等步驟,體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術(shù),能快速特異的在體外擴增任何目的的DNA??捎糜诨蚍蛛x克隆,序列分析,基因表達調(diào)控,基因多態(tài)性研究等許多方面。49PCR50RT-PCR方法51引物的設(shè)計
19、引物特異性決定PCR的特異性A.引物長度:一般為1530bp B.堿基分布:四種堿基最好應(yīng)隨機分布,避免嘌呤或嘧啶的聚集存在C. 3端要求:3端必須與模板嚴格互補,不能進行任何修飾,也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。D.引物自身二級結(jié)構(gòu):引物自身不應(yīng)存在互補序列E.引物之間的二級結(jié)構(gòu)F.同源序列。G.5端無嚴格限制52標準的PCR過程分為三步DNA變性 (90-96):雙鏈DNA模板在熱作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DNA退火 (50-60):系統(tǒng)溫度降低,引物與DNA模板結(jié)合,形成局部雙鏈。延伸 (70-75):在Taq酶(72左右,活性最佳梯度PCR儀)的作用下,以dNTP為原料,從引物的3端開
20、始以從53端的方向延伸,合成與模板互補的DNA鏈 三步一個循環(huán),以此往復(fù),53 PCR:PCR的基本流程:的基本流程:94oC, 45 sec55oC, 1 min72oC, 2 min退火溫度的變化是根據(jù)退火溫度的變化是根據(jù)引物的引物的GC比例確定或估比例確定或估計的;計的;退火時間的變化是根據(jù)退火時間的變化是根據(jù)引物的長度調(diào)整的。引物的長度調(diào)整的。熱啟動:熱啟動:避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其他二級結(jié)構(gòu)影響引他二級結(jié)構(gòu)影響引物的退火。物的退火。兩種方式加入兩種方式加入DNA聚合酶:聚合酶:熱啟動結(jié)束后暫停熱啟動結(jié)束后暫停PCR反應(yīng),在反應(yīng),在PCR儀儀上直接趁熱加入上直接趁熱加入DNA pol;熱啟動結(jié)束后將反應(yīng)管迅速放在冰上,熱啟動結(jié)束后將反應(yīng)管迅速放在冰上,然后加入然后加入DNA pol。5455PCR55RT-PCRRNAcDNA目的目的片段片段PCRRT56RT-PCR的兩種方法57RT-PCR的兩種方法%二步法58RT-PCR的兩種方法%一步法59RT-PCR兩種方法的比較60RT-PCR的應(yīng)用分析基
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