銀杏達莫對兔心肌缺血再灌注誘導內(nèi)皮細胞損傷的影響及機制(一)

1、銀杏達莫對兔心肌缺血再灌注誘導內(nèi)皮細胞損傷的影響及機制(一)    作者：郭瀟，王莉，陸艷，高雁【摘要】 目的研究銀杏達莫對兔心肌缺血再灌注損傷內(nèi)皮細胞的保護作用。方法結(jié)扎兔左冠狀動脈前降支制作心肌缺血再灌注損傷模型。實驗兔隨機分為空白對照組（假手術）、缺血再灌注組和銀杏達莫組。銀杏達莫組在心肌缺血前10min給予銀杏達莫。觀察各組缺血再灌注過程中心電圖的動態(tài)改變，以及銀杏達莫對血管性血友病因子及丙二醛和血清一氧化氮含量的影響。結(jié)果缺血再灌注組和銀杏達莫組均造成明顯的心電圖動態(tài)改變，與空白對照組比較，銀杏達莫組心電圖ST段出現(xiàn)有效改變。銀杏達莫組與缺血再

2、灌注組比較血管性血友病因子活性和丙二醛水平較缺血再灌注組顯著降低，而血清一氧化氮水平明顯提高。結(jié)論 銀杏達莫對心肌缺血再灌注損傷內(nèi)皮細胞有明顯的保護作用，其作用與清除氧自由基的膜脂質(zhì)過氧化及擴張冠脈有關。 【關鍵詞】 銀杏達莫； 心肌缺血再灌注損傷； 內(nèi)皮細胞； 心肌保護； 脂質(zhì)過氧化Abstract：Objective To study the protective effects and mechanism of Egb on endothelial cell injury induced by myocardium experienced ischemia-reperfusion in

3、rabbits. MethodsThe model of myocardial ischemia-reperfusion injury was established by ligating the left anterior descending artery of New Zealand rabbits. Anesthetized rabbits were randomly divided into 3 groups: blank control group (n=9) in which left anterior descending coronary artery was expose

4、d and a piece of silk thread was placed around the artery but not tied; Myocardial ischemia-reperfusion group (n=9) in which 1ml/kg normal saline was injected into vein 10 min before logation. Egb group (n=9) received intravenous inject on of Egb 10min before logation. The effect of egb on the von w

5、illebrand factor (vWF), malondialdehyde (MDA) in the plasma, the level of serum NO in injured rabbits and ECG were observed. ResultsCompared with blank control group or myocardial ischemia-reperfusion group, Egb group showed protection against injury as evidenced by more effective improvement in ST

6、of ECG. Egb could evidently decrease the contects of MDA and vWF and increase serum NO as compared with ischemia-reperfusion group. ConclusionEgb has a protective effect on endordnelial injury induced by myocardial ischemia-reperfusion throngh inhibiting lipid peroxidation and increasing NO preducti

7、on.Key words：Egb; Myocardial ischemia-reperfusion; Endothelial cells; Myocardial protection; Lipid peroxidation冠狀動脈粥樣硬化所致心肌缺血病變是一種“代謝性疾病”。一些研究顯示冠心病梗塞心肌相關血管再開通后，部分患者反而會因發(fā)生急性血流動力學障礙而死亡，稱為心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)1。MIRI與心肌細胞密切相關，血管內(nèi)皮細胞是MIRI時氧自由基，黏附因子和其他生物活性物質(zhì)的來源，所以早期血管內(nèi)皮細胞

8、的結(jié)構(gòu)和功能嚴重損傷又是構(gòu)成MIRI的病理生理學基礎。銀杏提取物（Extract of ginkgo biloba, EGB）具有改善血液流變狀態(tài)、抑制血小板聚集、抗氧化、清除自由基、緩解缺血、缺氧和舒張血管平滑肌等藥理作用2,3，并且可以縮小急性心肌梗塞范圍及減輕梗塞程度4,5。所以推斷銀杏達莫對心肌內(nèi)皮有部分保護作用。本研究對在體兔心肌缺血再灌注誘導內(nèi)皮細胞損傷模型予銀杏達莫干預，初步探討其對損傷的心肌內(nèi)皮細胞的保護作用。1 材料與方法1.1 藥物和試劑銀杏達莫，由山西普德藥業(yè)公司提供（批號： 國藥準字H14023515）。丙二醛（Malondialdehyde, MDA） 、一氧化氮（N

9、O）試劑盒購自南京建成生物工程研究所， 血管性血友病因子（Von willebrand factor ,vWF）試劑盒購自上海朗卡公司。1.2 動物健康新西蘭大白兔，雌雄不限，共27只，體重（2.82±0.31）kg，由蘭州生物制品研究所提供。1.3 模型制備動物分組1.3.1 心肌缺血再灌注損傷模型6及標本的采樣選擇健康新西蘭大白兔,20%烏拉坦按5 ml/kg耳緣靜脈麻醉，氣管插管，人工呼吸，開胸，暴露心肌，自冠狀動脈左前降支(Left anterior descending coronary artery, LAD)0.5 cm處穿線環(huán)繞動脈，結(jié)扎線線自一膠管腔內(nèi)引出，結(jié)扎LA

10、D，造成急性心肌缺血,通過肉眼觀察及心電圖改變判斷LAD結(jié)扎是否成功。LAD結(jié)扎30 min后剪開穿線使冠狀動脈再通形成再灌注，再灌注30 min，從左心室取2 ml制備血漿供檢測。入選標準：結(jié)扎后導聯(lián)ST段出現(xiàn)弓背向上抬高，T波高聳等表現(xiàn)為缺血成功。剪線后，行再灌注，抬高的ST段出現(xiàn)下降1/2以上為再灌注成功，行再灌注60 min。1.3.2 分組與給藥大白兔隨機分為3組，每組9只?？瞻讓φ战M（組）行假手術(Sham operated control，SC)，即在LAD0.5 cm處穿一膠管內(nèi)引絲線，但不予結(jié)扎；缺血再灌注組（組）和銀杏達莫組（組，缺血再灌注+銀杏達莫）于結(jié)扎前10 min，

11、組靜注生理鹽水1 ml/kg，組靜注銀杏達莫30 ml(銀杏總黃酮10 mg/kg，雙嘧達莫8 mg/kg)。1.4 心電圖動態(tài)變化記錄全程記錄心電圖變化,心電圖顯效標準為缺血導致抬高的ST段在再灌注60 min內(nèi)恢復接近正?；€。1.5 檢測指標采用硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid, TBA）法測定血漿MDA含量（nmol/ml）；血漿vWF活性由ELISH法測定其百分率；取已分離血清1 ml,由化學比色硝酸還原酶法測定血清NO含量（mol/L）。以上實驗均嚴格按試劑盒說明操作。1.6 統(tǒng)計學處理應用SPSS 11.5軟件，實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，各組間比較采用方

12、差分析（Analyisi of variance,ANorA)法，各組之間兩兩比較，采用q檢驗，P0.05為有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 缺血再灌注組和銀杏達莫組心電圖的比較缺血再灌注組和銀杏達莫組再灌注60 min，以心電圖ST段恢復接近正?；€為顯效，則缺血再灌注組有5例顯效，銀杏達莫組中有7例顯效。2.2 3組大白兔血漿中MDA含量，vWF活性及血清NO含量的比較組血漿中MDA含量、vWF活性明顯高于組(P0.01)，而血清NO含量則顯著低于組(P0.01)；銀杏達莫組MDA含量、vWF活性均明顯低于組(P0.01)，NO含量則顯著高于組(P0.01）。結(jié)果見表1。表1 銀杏達莫對兔血漿

13、MDA，vWF活性及血清NO含量影響的比較（略）3 討論心肌缺血再灌注損傷的機制至今仍未完全明了，一般認為與能量代謝、細胞內(nèi)鈣離子超載7、氧自由基大量產(chǎn)生8、中性粒細胞9的作用以及血管內(nèi)皮細胞分泌的一系列內(nèi)皮因子等因素有關10。再灌注時，大量氧自由基的爆發(fā)性產(chǎn)生使心肌細胞膜的不飽和脂肪酸和磷脂的過氧化反應加劇，MDA大量產(chǎn)生，損傷組織結(jié)構(gòu)和功能，從而導致內(nèi)皮細胞功能障礙。本實驗中觀察到缺血再灌注組血漿中，MDA含量與其他兩組比較有非常明顯的增高，表明缺血再灌注后氧自由基產(chǎn)生有顯著的增加，而機體對清除氧自由基的能力則有明顯的降低，從而使內(nèi)皮細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷，導致內(nèi)皮細胞分泌功能障礙，NO分

14、泌減少11；在進行銀杏達莫藥物干預后，在兔血漿中的MDA含量較缺血再灌注組顯著降低，這多為銀杏達莫一定的程度上清除氧自由基，降低過氧化自由基對內(nèi)皮細胞的損傷作用，改善血管內(nèi)皮細胞依賴性舒張功能所致。這些都不同程度地對再灌注心肌起到了保護作用。NO是反映內(nèi)皮細胞功能的比較敏感的指標，其是內(nèi)皮細胞在切應力、低氧和其他介質(zhì)作用下，由L-精氨酸在一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NOS）的作用下合成的12，可以抑制血小板和中性粒細胞的聚集，并且有消除體內(nèi)過多的氧自由基的作用。本實驗觀察到銀杏達莫干預組的兔血漿中NO含量較缺血再灌注組有非常明顯的提高，證實銀杏達莫能夠增加再灌注

15、期心肌組織中NO含量，使環(huán)磷酸鳥苷升高從而導致血管舒張并抑制血管平滑肌增殖，對心肌缺血再灌注損傷的內(nèi)皮細胞產(chǎn)生較好的保護作用。vWF一般在血管內(nèi)皮細胞受損時才釋放入血，與血小板膜糖蛋白b/a結(jié)合,誘導血小板聚集,使血小板能牢固地黏附于血管內(nèi)皮上,使血漿黏滯性增加。因此，vWF活性和水平升高是血管內(nèi)皮細胞受損的一個非常重要的標志。本實驗中同樣觀察到，缺血再灌注組的血漿中vWF水平升高明顯，預示著嚴重心血管事件的發(fā)生13。而在銀杏達莫進行干預后，在兔血漿中的vWF的水平較缺血再灌注組則下降顯著，證實銀杏能有效地保護內(nèi)皮細胞功能。銀杏達莫注射液是將銀杏葉的有效成分（Extract of ginkgo

16、 biloba, EGB）加以分離，富聚后與適量雙嘧達莫（潘生?。┙M方而成，其化學成分復雜，根據(jù)已有的研究成果推測其作用機制是多方面的。已知EGB中含有大量的酮化合物和萜類內(nèi)酯。其中，黃酮類化合物不但是有超氧化物歧化酶活性，能清除多種自由基，而且其本身還具有明顯的抗氧化活性，因而能增強心肌細胞在缺血再灌注狀態(tài)下的抗損傷能力，促進內(nèi)皮細胞松弛因子的釋放而調(diào)節(jié)血管舒縮功能2，14，從而持久地擴張冠脈增加冠狀動脈血流量，促進側(cè)枝循環(huán)。銀杏達莫注射液中的萜類內(nèi)酯則是天然專屬的血小板活化因子(Platelet-activating factor, PAF)受體的拮抗劑，它與雙嘧達莫協(xié)同，可抑制血小板功能

17、，降低血液粘滯性，改善血液流變狀況；另外，還可抑制升高血栓素A-2(Raise thromborane A2,TXA2)并促進前列腺素（Prostaglandine 2, PGI2）生成，從而調(diào)節(jié)血管能力，改善組織血供15，16。綜上所述，銀杏達莫注射液具有顯著的保護內(nèi)皮細胞的作用，其對減少心肌缺血再灌注誘導內(nèi)皮細胞損傷可能是通過減少心肌脂質(zhì)過氧化物的形成、提高血清NO含量，而且較有效地清除氧自由基，使MDA含量降低和vWF活性降低而達到的。以往國內(nèi)相關實驗以離體兔，鼠研究較多，本次實驗則采取模擬臨床現(xiàn)場的方式制作在體兔缺血再灌注/損傷模型，并取得實驗結(jié)果。綜合各項實驗結(jié)果可見，銀杏達莫注射液

18、在臨床上心血管疾病的防治中可能具有較大的價值，但因其所含化學成分復雜，其作用又是通過多途徑，多層次實現(xiàn)的，所以其中仍有許多的未知領域，還有待進一步研究和探索?！緟⒖嘉墨I】1Eeckhout E, Kern MJ. The coronary no-reflow phenomenon: a review of mechanisms and therapiesJ.European Heart Journal , 2001, 22 (9): 729.2陳維洲, 張培智. 銀杏葉提取物的藥理和臨床研究進展(上)J.中國新藥與臨床雜志, 1999, 18(5): 60.3Cheung F, Siow YL

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