【醫(yī)院】HE技術操作規(guī)范

1、HEHE技術操作規(guī)范技術操作規(guī)范第一步：固定 固定能防止組織自溶及腐敗，盡量保持組織原貌 固定液通過以下機制穩(wěn)定蛋白： 相互交聯(lián)：甲醛與蛋白質(zhì)交聯(lián) 蛋白沉淀：蛋白變性沉淀 合理固定很重要，為了： 防止組織在處理中受損 經(jīng)處理組織能易于切片固定不當?shù)暮蠊?固定不當會導致手工及自動IHC及ISH檢測結果出現(xiàn)片狀或不正常染色，從而影響免疫組化檢測結果判定 固定不全過程固定不全過程 交聯(lián)過程發(fā)生較慢，很易逆轉(zhuǎn) 若固定時間過短，會發(fā)生交聯(lián)不全，組織將被下一步的乙醇固定 經(jīng)乙醇沉淀的蛋白其抗原結構會改變，因而不適用于IHC及ISH檢測 固定過度固定過度 固定時間過長可能導致假陰性檢測結果 過度多聚化阻止了

2、抗原暴露，因而影響抗原修復影響固定的因素 組織類型 從標本手術切除至開始固定的時間 待檢標本的體積及厚度 固定液類型 （10%福爾馬林） 固定液與組織體積比 （至少10：1） 固定的時間 溫度從標本離體到開始固定的時間 為防止組織自溶，待檢組織從手術離體至開始固定之間的時間應盡可能短 乳腺癌最多 1小時 胃癌應控制在 2030 分鐘內(nèi)固定液種類 推薦10%中性緩沖福爾馬林（中性緩沖福爾馬林（NBF）作為乳腺癌及胃癌組織的固定液（IHC或ISH） 10% NBF等同于4%甲醛溶液 交聯(lián)簡單的固定液 應使用新鮮福爾馬林溶液，福爾馬林貯備液應： 定期更換 （最多貯存6個月） 室溫貯存 標記生產(chǎn)日期或

3、稀釋濃度以及過期日期固定不當會導致手工及自動IHC及ISH檢測結果出現(xiàn)片狀或不正常染色，從而影響免疫組化檢測結果判定固定時間 乳腺組織 用于HER2檢測的手術切除組織樣本(IHC或ISH檢測)，一般固定648小時 胃組織 手術切除及活檢組織樣本，一般固定848小時 固定時間取決于待檢組織類型固定時間取決于待檢組織類型-組織取樣手段，組織厚度及固定液組織取樣手段，組織厚度及固定液 不同的檢測程序應使用優(yōu)化的相應固定時間不同的檢測程序應使用優(yōu)化的相應固定時間第二步取材 組織塊的面積通常為，厚度不超過。太大太厚的組織塊常會固定不充分，而影響脫水和制片。 第三步：脫水 目的：因為石蠟不溶于水，所以需從

4、組織中除去水分 梯度脫水：75%，85%、95%，100%乙醇 若無乙醇，其他溶劑例如異丙醇亦可用于脫水第四步：透明 因乙醇和石蠟不相溶，所以需用另外一種溶劑因乙醇和石蠟不相溶，所以需用另外一種溶劑 用于透明的溶劑既能同乙醇混溶，又能與石蠟混溶 常用透明劑包括： 二甲苯 L苧烯 氯仿 松節(jié)油（TO） 使用“透明”該詞是因組織會變?yōu)橥该鞯谖宀剑航?浸蠟過程中，液體石蠟代替透明液以利于進行超薄切片 推薦使用溶點為5658oC的新鮮石蠟 應避免浸蠟時間過長 經(jīng)合理石蠟包埋的乳腺及胃組織在進行切片之前，可在室溫下(2025oC)無限期地貯存組織處理儀 影響組織處理的因素 熱 增加浸潤速率 真空 有助

5、去除:殘余空氣之前溶劑 壓力 起攪拌作用第六步石蠟包埋 將需要切片的面靠近包埋盒 小組織盡量聚集在一起 注意管腔、皮膚等組織的位置第七步切片 切片機的種類 直推式 輪轉(zhuǎn)式 切片的方式 干切 濕切 切片厚度會影響顯色及檢測數(shù)據(jù)分析 組織切片厚度標準 35 m. 可用經(jīng)校準過的超薄切片機切片 切片需貼在粘合性強的載玻片上 (可使用經(jīng)多賴氨酸防脫片處理的玻片)，貼片后將載玻片置于室溫下風干12-24小時或于60烘干1小時 經(jīng)多賴氨酸防脫片處理的玻片 廠商試劑盒及/或自動化染色平臺需配合指定玻片使用 最好在HER2免疫組織化學染色檢測前才開始切片 如果過早切片，讓切片暴露在室溫太久，容易造成組織細胞抗

6、原性受損 應盡可能在切片后兩星期內(nèi)進行染色 切片最長保存期為4-6星期 切片應從以下細胞組織區(qū)域提取 乳腺內(nèi)的侵襲性癌細胞組織 食管及胃交界癌的代表性癌細胞組織 例如混合癌中的胃腺癌組織區(qū)域及非壞死或無感染區(qū)域第八步撈片 用玻片從冷水盆上撈起蠟片，后把蠟片放在50上清水上展平并撈起切片第九步烤片 常用溫度60-70 烤片時間：最少30分鐘 57 過夜 溫度過高、時間過長會導致蛋白變性溫度過高、時間過長會導致蛋白變性 溫度過低、時間過短烤片不充分、石蠟不溶，拖拉不徹底溫度過低、時間過短烤片不充分、石蠟不溶，拖拉不徹底第十步脫蠟至水 用二甲苯(或二甲苯代替品)為石蠟切片脫蠟，再用無水乙醇梯度稀釋液

7、回水 石蠟必須徹底清除，否則將影響染色，減低特異性染色及提高非特異性背景染色步驟取一黏有石蠟切片的載玻片，在室溫下依序作以下操作：放在二甲苯I中浸泡10分鐘 放在二甲苯II中浸泡10分鐘 放在100%乙醇中浸泡兩次，每次30秒 放在95% 乙醇中浸泡兩次，每次30秒 放在80%乙醇中浸泡一次，每次30秒 放在75%乙醇中浸泡一次，每次30秒 蒸餾水洗在紙巾上輕敲載玻片瀝干多余的緩沖液，用吸水紙抺干組織周圍第十一步：HE染色（蘇木素-伊紅染色） 原理 利用細胞內(nèi)外的酸堿度與蘇木素、伊紅進行化學反應；即細胞核（酸性）與堿性蘇木素進行反應形成藍色；細胞質(zhì)（堿性）與酸性伊紅進行反應形成紅色。步驟 二甲苯I、II各10min 100%酒精I、II，95%酒精I、II，80%酒精，蒸餾水各1min。 蘇木精染液15min，流水沖洗。 0.5%鹽酸酒精分化5s，流水沖洗1min。 飽和碳酸鋰水溶液1min，流水沖洗10min。 1%伊紅染液染40s，水洗 。 80%酒精，95%酒精I、II，80%酒精，100%酒精I、II。 二甲苯I、II各1min 。第十二步：封片 封片劑：中性樹膠、甘油等重要重要提示提示 注意在任何情況下都不能讓組織干透 盡量減少封片液用量染片結果 細胞核成藍色細胞核成藍色 細胞質(zhì)成紅色細胞質(zhì)成紅色 紅藍對比