牛津杯法抑菌試驗(yàn)(共3頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上牛津杯法抑菌試驗(yàn)1. 原理將加有牛津杯的雙層平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一方面試驗(yàn)菌（病原菌）開始生長繁殖，另一方面抑菌物質(zhì)呈球面擴(kuò)散，形成遞減的梯度濃度。牛津杯周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細(xì)菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物質(zhì)對指示菌的抑制程度。2. 儀器、設(shè)備2.1 超凈工作臺2.2恒溫培養(yǎng)箱：36±1。2.3恒溫水浴鍋：50±1。2.4高壓滅菌鍋。2.5平皿：直徑為9 cm。2.6 移液器（20200L，1001000L，15mL）及配套無菌槍頭。2.7試管：15×150 mm。2.8 酒精燈。2.9試管架。 2.10渦旋混勻

2、器。2.11搖床：36±1。2.12牛津杯。3. 病原菌、培養(yǎng)基及其他3.1病原菌：大腸桿菌：ATCC25922、沙門氏菌: ATCC14028、金黃色葡萄糖球菌：ATCC6538。3.2 抑菌物質(zhì)：益生菌（乳酸菌、芽孢菌）、抗生素或其它抑菌物質(zhì)。3.3 培養(yǎng)基：（1）大腸埃希菌：營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂半固體（瓊脂粉含量：1%）、營養(yǎng)瓊脂（瓊脂粉含量：2%）。（2）金黃色葡萄球菌：營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂半固體（瓊脂粉含量：1%）、營養(yǎng)瓊脂（瓊脂粉含量：2%）。（3）沙門氏菌：營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂半固體（瓊脂粉含量：1%）、營養(yǎng)瓊脂（瓊脂粉含量：2%）。（4）乳酸菌：MRS肉湯。（5）芽孢菌：營

3、養(yǎng)肉湯。3.4 其它：0.85%滅菌生理鹽水，滅菌蒸餾水。4 測定流程4.1病原菌擴(kuò)培：在超凈工作臺內(nèi)，挑取新鮮的斜面保藏病原菌1環(huán)，接種于100mL無菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種完畢，將三角瓶置于搖床內(nèi)固定，37，200rpm，培養(yǎng)16-20h。將培養(yǎng)好的病原菌菌懸液用空白營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋10倍，若OD600在0.30-0.36之間， 則為有效病原菌菌懸液，此時病原菌菌懸液原液中病原菌含量約為109cfu /ml。4.2 抑菌物質(zhì)（抗生素或益生菌菌懸液）的制備：（1）抗生素：抗生素或其它藥物用無菌水稀釋至所需要的濃度。（2）乳酸菌擴(kuò)培：無菌條件下稱取相當(dāng)于約10億CFU量的乳酸菌菌粉（如果是

4、包衣產(chǎn)品需要在稱樣前無菌條件下研磨釋放乳酸菌），接種于100mLMRS液體培養(yǎng)基中，37靜置培養(yǎng)2448h即為擴(kuò)培好的乳酸菌菌懸液。（3）芽孢菌擴(kuò)培：無菌條件下稱取相當(dāng)于約10億CFU量的芽孢菌菌粉，接種于100mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種完畢，將三角瓶置于搖床內(nèi)固定，37，200rpm，培養(yǎng)1418小時即為擴(kuò)培好的芽孢菌菌懸液。4.3雙層平皿的制備：取平皿分別傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15-18mL，使其在平板內(nèi)均勻攤布，放置水平臺面上使凝固，作為底層，將平皿倒置平均劃分區(qū)域并標(biāo)記添加物。另取半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基適量放冷至4850 ，將4.1中病原菌菌懸液原液稀釋至106cfu /mL左右，每4.5

5、mL半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加入0.5mL，倒入每平皿中，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。放置在水平臺上冷卻后，在每1平皿中以劃分好的區(qū)域等距離均勻安置牛津杯4個備用。4.4 抑菌試驗(yàn)：取4.2步驟中準(zhǔn)備的抑菌物質(zhì)，每個雙層平皿中的牛津杯中分別滴裝200L，37靜置培養(yǎng)16-20h后，測量各抑菌圈直徑（或面積）以作出評價。選取典型平皿拍照片。備注：牛津杯的放置一定要平穩(wěn)、到位，確保底部準(zhǔn)確插到兩層平皿之間；抑菌物質(zhì)添加時確保全部加到牛津杯內(nèi)部，不要灑在牛津杯外壁或外部，如果灑在外面會形成乳酸菌或芽孢菌在抑菌圈的生長；如果無法控制乳酸菌或芽孢菌在牛津杯外面的生長，可以將乳酸菌、芽孢菌菌懸液在無菌離心管中離心，取其上清加入牛津杯中做抑菌試驗(yàn)。4.5 抑菌性能評價抑菌性：抑菌圈10mm為無抑菌作用，抑菌圈