免疫學(xué)技術(shù)在科研中的應(yīng)用ppt課件

1、免疫新技術(shù)在科研中的運(yùn)用相關(guān)協(xié)助需求相關(guān)抗體試劑的可以訪問(wèn)Fantibody全球抗體搜索引擎fantibody全球抗體搜索引擎是一個(gè)供公共檢索的抗體數(shù)據(jù)庫(kù)，其抗體信息數(shù)據(jù)來(lái)源于全球范圍的研討機(jī)構(gòu)與商業(yè)公司。該引擎由商品化抗體數(shù)據(jù)庫(kù)與抗體運(yùn)用評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)兩部分組成，以協(xié)助研討者更高效的尋覓并評(píng)價(jià)該抗體的性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)之后更為復(fù)雜的運(yùn)用型檢索平臺(tái)需求相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、生物試劑、醫(yī)療器械、制藥設(shè)備、醫(yī)藥原料、體外診斷試劑及耗材與技術(shù)效力信息的，可以訪問(wèn)探生網(wǎng)biomean進(jìn)展咨詢，等待您的參與抗原或抗體的檢測(cè)w抗原抗體反響的特點(diǎn)w抗原抗體反響的影響要素w常用的抗原抗體反

2、響抗原抗體反響的特點(diǎn)w高度的特異性w可逆性w抗原抗體結(jié)合除了空間構(gòu)象互補(bǔ)外，主要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水鍵等分子外表的化學(xué)基團(tuán)之間的非共價(jià)方式結(jié)合。這種非共價(jià)鍵不如共價(jià)鍵結(jié)合穩(wěn)定，極易受溫度、酸堿度和離子強(qiáng)度的影響而解離。w抗原抗體比例影響免疫復(fù)合物的大小w抗原抗體反響的兩個(gè)階段抗原抗體反響的影響要素w抗原抗體濃度與比例w電解質(zhì)w抗原抗體特異性結(jié)合后，親水性降低，易受電解質(zhì)的影響而使外表失去較多的負(fù)電荷。w溫度w適當(dāng)?shù)臏囟瓤商砑涌乖c抗體分子的碰撞時(shí)機(jī)，加速抗原抗體復(fù)合物的構(gòu)成。w酸堿度w抗原抗體反響的最適pH在68之間，pH過(guò)高或過(guò)低，即過(guò)堿或過(guò)酸，均可影響抗原、抗體的理化性質(zhì)。常用

3、的抗原抗體反響w凝集反響w沉淀反響w免疫標(biāo)志技術(shù)凝集反響w直接凝集反響w血型鑒定w肥大反響w間接凝集反響w間接凝集抑制實(shí)驗(yàn)w微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)間接凝集反響w將可溶性抗原或抗體吸附在與免疫無(wú)關(guān)的顆粒載體上，構(gòu)成致敏顆粒，再與相應(yīng)抗體或抗原進(jìn)展反響產(chǎn)生的凝集反響，稱為間接凝集反響。w顆粒載體有紅細(xì)胞、聚苯乙烯乳膠顆粒、活性炭顆粒，而相應(yīng)的凝集景象分別稱為間接血球凝集、間接乳膠凝集、間接炭粒凝集反響。微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)w將知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素親和素酶放大系統(tǒng)相結(jié)合，最后酶作用于熒光底物，使之發(fā)熒光，經(jīng)過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度判別待測(cè)抗原的含量。w檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物CAl99、CEA、CAl2

4、5、AFP、性激素、甲狀腺素T-T+、葉酸、HIV抗體、HCG等微量可溶性抗原。沉淀反響w速率散射比濁法免疫比濁法w瓊脂分散法w單向瓊脂分散w雙向瓊脂分散w火箭電泳w對(duì)流免疫電泳w免疫印跡技術(shù)速率散射比濁法免疫比濁法w將知抗體與相應(yīng)抗原在液相中按一定比例混合構(gòu)成可溶性免疫復(fù)合物，這些復(fù)合物微小粒子對(duì)一定波長(zhǎng)的光照射發(fā)生散射，可經(jīng)過(guò)三個(gè)光路系統(tǒng)測(cè)定光散射(OD值)。w抗體含量固定并處于抗體過(guò)剩時(shí)，免疫復(fù)合物的多少直接取決于抗原的濃度，抗原的終濃度經(jīng)過(guò)規(guī)范品繪出的規(guī)范曲線查出。w提高了靈敏度，經(jīng)過(guò)自動(dòng)化，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品并進(jìn)展準(zhǔn)確的定量分析。w檢測(cè)前白蛋白、酸性蛋白酶、巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、尿微量

5、蛋白及IgG、IgM、IgA及補(bǔ)體，藥物含量分析。免疫印跡技術(shù)w將用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE分別得到的按分子量大小陳列的非標(biāo)志蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體膜上，再用標(biāo)志的特異性的抗血清或單克隆抗體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)展定性及定量分析的技術(shù)，其鑒定蛋白質(zhì)的敏感性為15ng。w檢測(cè)可溶性抗原、細(xì)胞成分的鑒定與分析，檢測(cè)與本身變性細(xì)胞核成分結(jié)合的抗體(抗核抗體)，HIV的明確診斷。免疫印跡法的根本步驟w電泳分別蛋白抗原，SDS是一種陰離子去污劑，與蛋白質(zhì)結(jié)實(shí)結(jié)合，十二烷基磺酸根帶負(fù)電荷，使樣品中各種蛋白質(zhì)與SDS構(gòu)成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于蛋白質(zhì)外表均帶有一樣密度的負(fù)電荷，使分子構(gòu)型幾乎一樣(線性)。因此SD

6、S-PAGE中，SDS多肽復(fù)合物的電泳遷移率只與其分子質(zhì)量有關(guān)，而不受所帶電荷及分子形狀的影響。w將SDS-PAGE分別到的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至固相的硝酸纖維素膜上。w蛋白條帶可用酶、同位素標(biāo)志的一抗或二抗進(jìn)展特異性反響，參與顯色底物或放射自顯影以顯示結(jié)果。免疫標(biāo)志技術(shù)w免疫酶測(cè)定法w免疫熒光技術(shù)w放射免疫測(cè)定法w免疫膠體金技術(shù)免疫酶測(cè)定法w是一種用酶標(biāo)志一抗或二抗檢測(cè)特異性抗原或抗體的方法。w將抗原抗體反響的高度特異性與酶對(duì)底物的高效催化作用有效地結(jié)合起來(lái)，經(jīng)過(guò)酶分解底物產(chǎn)生有色物質(zhì)(也可作用于熒光底物，產(chǎn)生熒光)，肉眼察看顏色深淺或酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值(OD)，以反映抗原或抗體的含量。w本法靈敏度

7、高，檢測(cè)可溶性抗原或抗體、組織或細(xì)胞外表特異性抗原。ELISAw雙抗體夾心法(sandwich assay)w檢測(cè)血清、腦脊液、胸、腹水等各種液相中的可溶性抗原w間接法w測(cè)定細(xì)胞及組織外表抗原酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(enzymelinked immunospot assay，ELISPOT)w用知細(xì)胞因子的抗體包被固相載體，參與待檢效應(yīng)細(xì)胞，溫育一定時(shí)間后洗去細(xì)胞，如待檢效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)細(xì)胞因子，那么與已包被的抗體結(jié)合，再參與酶標(biāo)志抗該細(xì)胞因子抗體，加底物顯色。w普通選擇硝酸纖維素膜(NC)或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜覆蓋微量反響板作為固相，在分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的細(xì)胞所在部分呈現(xiàn)有色斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)表示

8、一個(gè)分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)可推算出分泌某種細(xì)胞因子細(xì)胞的頻率。免疫熒光技術(shù)w用熒光素標(biāo)志一抗或二抗，檢測(cè)特異性抗原或抗體的方法。w常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(nuorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)等。在激發(fā)光的作用下，可直接發(fā)射熒光，前者發(fā)黃綠色熒光，后者發(fā)紅色熒光。Immunofluorescent stain of immunoglobulin G (IgG) showing linear pattern in Goodpastures syndrome 天皰瘡免疫熒光染色天皰瘡免疫熒光染色放射免疫測(cè)定法w用

9、放射性同位素標(biāo)志抗原或抗體進(jìn)展的免疫測(cè)定。w既有同位素的敏感性又有抗原抗體結(jié)合的特異性，同時(shí)具有反復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、標(biāo)本用量少等優(yōu)點(diǎn)。w廣泛運(yùn)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測(cè)。免疫膠體金技術(shù)w氯金酸(HAuCl+)在復(fù)原劑作用下，產(chǎn)生分散形狀的膠體金顆粒。堿性條件下，金顆粒外表帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)正電荷基團(tuán)結(jié)合。w膠體金可標(biāo)志白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。大分子以單層方式吸附在金顆粒外表。w不同復(fù)原劑作用于氯金酸，產(chǎn)生的膠體金粒徑大小不一樣(550nm)，小粒徑的膠體金由于穿透性好，電子密度高，常被用于免疫電鏡技術(shù)。這些小粒徑的金顆粒，經(jīng)銀顯影液處置后，金粒子復(fù)原

10、銀離子生成銀顆粒而吸附在金顆粒周圍呈黑褐色，從而放大了金顆粒的顯色效果，又稱免疫金銀法。w膠體金顏色隨顆粒大小而變化，大于20 nm的金顆粒在光鏡下呈現(xiàn)磚紅色，可在光鏡程度行免疫分析，也可用銀顯影劑加強(qiáng)，進(jìn)一步提高靈敏度。w當(dāng)膠體金的粒徑較大、濃度密集時(shí)肉眼程度即可察看，即膠體金斑點(diǎn)滲濾實(shí)驗(yàn)和膠體金斑點(diǎn)免疫層析實(shí)驗(yàn)。免疫細(xì)胞的檢測(cè)w免疫細(xì)胞的分別w磁珠分別法wfluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACSw免疫細(xì)胞功能的測(cè)定wT細(xì)胞wB細(xì)胞磁珠分別法w特異性分別所需淋巴細(xì)胞的方法。w將特異性抗體(如抗CD3、抗CD4、抗CD8等)吸附在鐵顆粒(磁珠)上，加至細(xì)胞

11、懸液中，具有相應(yīng)抗原的細(xì)胞與磁珠上的特異性抗體結(jié)合。w反響管置于磁場(chǎng)中，鐵顆粒受磁場(chǎng)的吸引，攜帶有相應(yīng)細(xì)胞的磁球吸附于接近磁鐵的管壁上。w棄細(xì)胞懸液，重新解離細(xì)胞與磁珠。fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACST細(xì)胞鑒定及功能測(cè)定w運(yùn)用酶、免疫熒光標(biāo)志單抗進(jìn)展鑒定w淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)wE花環(huán)構(gòu)成實(shí)驗(yàn)w混合淋巴細(xì)胞培育wCTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)抗原肽MHC分子四聚體技術(shù)tetramerw用生物素化的抗原肽MHC分子復(fù)合物與熒光標(biāo)志的親合素結(jié)合，由于1個(gè)熒光素標(biāo)志的親合素可結(jié)合4個(gè)生物素分子，能使4個(gè)MHC抗原肽復(fù)合物構(gòu)成一個(gè)復(fù)合體，將該復(fù)合體標(biāo)志熒光素后，即成抗

12、原特異性四聚體。w抗原特異性四聚體能與樣品中的特異性T細(xì)胞的TCR結(jié)合，由于四聚體能同時(shí)結(jié)合一個(gè)T細(xì)胞外表的4個(gè)TCR，親和力大大提高。用流式細(xì)胞術(shù)即可確定待檢標(biāo)本中抗原特異性CTL細(xì)胞的頻率。wMHC分子可為工類或類分子，與抗原肽構(gòu)成的四聚體復(fù)合物，可分別鑒定表達(dá)特異性TCR的CD8+T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞的頻率。B細(xì)胞的鑒定及功能測(cè)定w檢測(cè)B細(xì)胞分化抗原w測(cè)定B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的才干w溶血空斑實(shí)驗(yàn)wELISPOT細(xì)胞因子的檢測(cè)w生物活性檢測(cè)w細(xì)胞增生或增生抑制法w細(xì)胞病變抑制法w趨化作用測(cè)定法w免疫學(xué)檢測(cè)法w分子生物學(xué)技術(shù)基因敲除技術(shù)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物w運(yùn)用基因同源重組，將外源有功能基因(基因組中原

13、先不存在、或已失活的基因)，轉(zhuǎn)入細(xì)胞與基因組中的同源序列進(jìn)展同源重組，插人到基因組中，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)。w經(jīng)過(guò)同源重組產(chǎn)生目的基因缺失或失活的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以確定被敲除的基因在體內(nèi)代謝過(guò)程中的作用，還可確定被敲除基因在分化、發(fā)育、生存等過(guò)程中的作用和必要性。w轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以作為疾病模型。w可以用于藥物挑選的動(dòng)物模型。w轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可作為“生物反響器消費(fèi)藥物。Th細(xì)胞在細(xì)胞在mCTL介導(dǎo)的腫介導(dǎo)的腫瘤維護(hù)中作用的研討瘤維護(hù)中作用的研討相關(guān)闡明wOT-1 mice : 表達(dá)SIINFEKL特異性TCRwOVA：雞卵白蛋白wOVA CTL epitope: SIINFEKLwOVA Th epitope

14、:ISQAVHAAHAEI-NEAGROVA OVTw RAG-1 KO mice:wC57BL/6 mice:wIFA/CFA/KLHwEG7 cell linewEL4 cell line相關(guān)步驟wmCTL and eCTL generationwOT-1細(xì)胞轉(zhuǎn)輸RAG-1-基因敲除小鼠，2天后以 OT-1 TCR 特異性表位多肽 SIINFEKL 免疫；wspecific Th generationwOVA 特異性和非特異性Th表位多肽免疫C57BL/6小鼠以產(chǎn)生特異性和非特異性Th細(xì)胞；wmCTL transferw記憶性CTL轉(zhuǎn)輸已產(chǎn)生特異性和非特異性Th的 C57BL/6 小鼠；w

15、tumor challengew接種表達(dá)OVA抗原的腫瘤細(xì)胞EG7；Generation of Ovalbumin-specific Memory CD8 T Cells.OT-1 lymph nodes cells were transferred to RAG-/- mice through tail vein injection, and mice were immunized with 50ug of SIINFEKL peptide in CFA 1 day later. At day 7 , 14 , 21, mice were sacrificed, and splenocyte

16、s or lymph nodes cells were isolated and analyzed. The percentage of CD44high, SIINFEKL-specific CD8 T cells was assessed by three-color FACS staining with SIINFEKL MHC class I tetramer and antibodies to CD8 and CD44. Plots shown are gated on the SIINFEKL tetramer positive lymphocytes; values are me

17、an percentages of CD44 cells within the SIINFEKL tetramer-positive population.CD8+ Memory T Cells Need Antigen-specific CD4+T-helper Cells to Achieve Tumor ProtectionOvalbumin CTL epitope (SIINFEKL)-specific T cells were parked in Rag-/- mice for 42 days to generate mCTL and then adoptively transfer

18、red to C57BL/6 mice . Two groups of recipient C57BL/6J mice were immunized 8 days prior with 50 ug of OVT in incomplete Freunds adjuvant or 20 ug keyhole limpet hemocyanin (KLH) protein as control in incomplete Freunds adjuvant . Mice were challenged with ovalbumin-expressing tumor cells (EG7) in th

19、e scruff of the neck 1 day after adoptive transfer. Normal C57BL/6 control mice were challenged with EG7 without any treatment. CTL+ThCTL+KLHCTLThKLHControl0.00.20.40.60.81.0CTL+ThCTL+KLHCTLThKLHControlTumour weight (g)Absence of tumor protection in mice without antigen-specific T-helper cells is no

20、t because of lower levels of tumor antigen (SIINFEKL)-specific CD8+ T cells.mCTLs were transferred to groups of C57BL/6 mice with or without immunization 8 days prior with 50 ug of OVT or with 20 ug of KLH protein control. C57BL/6 control group was given no treatment. IFN- Elispot assays were perfor

21、med using the splenocytes of these mice, which were challenged in vitro with (A) 1 ug/ml SIINFEKL peptide or (B) 8ug/ml OVA T-helper peptide to determine the presence of ovalbumin-specific CD8+ CTLs and CD4+ T-helper cells. In contrast to mCTLs, eCTLs do not n e e d T h e l p t o k i l l t u m o r.

22、eCTLs generated from RAG-/- mice were transferred at (A) day 7 or (B) day 14 to C57BL/6 mice that had been immunized 8 days earlier with 50 ug of OVT or as control 20 ug of KLH. C57BL/6 mice without any treatment were used as controls (EG7 and EL4 controls). Ovalbumin-expressing tumor cells (EG7 ) were injected under scruff of the neck of some groups of mice at (A) day 7 or (B) day 14. The parent tumor cell line EL4 that does not contain ovalbumin gene was injected into other groups of mice at day7 (A) as nonspec