骨髓基質干細胞及其應用的研究進展(一)

1、骨髓基質干細胞及其應用的研究進展(一)    【摘 要】 骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，又稱骨髓基質干細胞，是骨髓中非造血實質細胞的干細胞，具有高度的自我復制能力和多向分化潛能，可分化成多種細胞。 【關鍵詞】 骨髓 干細胞 骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，又稱骨髓基質干細胞，是骨髓中非造血實質細胞的干細胞，具有高度的自我復制能力和多向分化潛能，可分化成多種細胞。近來研究表明它可以向三個胚層的多種組織分化，如來源于外胚層的神經元、神經膠質細胞等，MSCs移植為腦缺血患

2、者開辟了一種新的治療方法。本文對MSCs移植治療腦缺血的研究綜述。 1 骨髓基質細胞的生物學特性 1.1 目前發(fā)現至少存在3種形態(tài)的MSCs。Colter等從培養(yǎng)的人骨髓細胞中分離出MSCs后，發(fā)現來自單細胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平MSCs外，還有一種非常小的圓形細胞，這種小圓形細胞有更強的折光性，它們比大的MSCs能更快分裂、增殖，并且有更強的多向分化潛能，當將MSCs放在不同的微環(huán)境內時，它們可相應地分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞或成肌細胞等1-3。MSCs具有多向分化的潛能，MSCs經靜脈途徑或局部注射移植到不同的組織時，MSCs即可在相應的組織內分化形成該類組織細胞3，4

3、。 1.2 MSCs的易粘附、易貼壁生長，易增殖特性使得它們經過數次換液和傳代后得到分離、純化3。 2 骨髓基質細胞在體外誘導分化為神經元和膠質細胞 最近研究發(fā)現，在特定的實驗條件下可將人、大鼠及小鼠等的MSCs在體外誘導分化為神經元樣和膠質細胞樣細胞，Sanchoz Ramos等發(fā)現，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)或腦源性營養(yǎng)因子(brain-derived neuotrofic factor，BDNF)可誘導人及小鼠的少數MSCs分化為神經元樣及膠質細胞樣細胞，它們表達神經前體細胞的標志物巢素蛋白(nestin)及其RNA、神經元標記物神經元特異性核

4、蛋白(neuron specific nuclear protein，NeuN)、星形膠質細胞標記物膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。將人或小鼠的MSCs與胚胎大鼠中腦或紋狀體神經元共培養(yǎng)時，部分MSCs分化為NeuN陽性的神經元樣細胞及GFAP陽性的星形膠質細胞樣細胞，因此，除了可能通過營養(yǎng)因子和細胞因子傳遞信號外，細胞與細胞的直接接觸還可能在MSCs的分化中發(fā)揮重要作用5。 3 MSCS移植治療局灶性腦缺血的可行性及原理 3.1 供體與受體 MSCs移植治療腦缺血多為同種異體移植，如Brazelton等6采用的供體鼠為成熟轉基因

5、大鼠，鼠齡810w，受體鼠為致死量放療后的相同鼠齡的大鼠，移植的為新鮮未經培養(yǎng)的MSCs。有些學者將供體鼠化療(5-氟尿嘧啶，150mg/kg，腹部注射) 2d后取其骨髓進行體外培養(yǎng)3代，移植前72h加BrdU進行標記，受體鼠亦為相同鼠齡相同體重的同種鼠7。Zhao等8的研究中，hMSCs來自于1035歲的健康志愿者，hMSCs轉染了增強的綠色熒光蛋白基因，經26代培養(yǎng)后移植入成熟雄鼠體重(230250g)，結果未出現免疫排斥反應，說明MSCs具有相當大的免疫反應調節(jié)能力。上述研究中，或是供體經化療或是受體經放療或是MSCs經多次傳代培養(yǎng)以降低免疫活性，從而減少移植物抗宿主反應的發(fā)生。 3.2

6、 MSCs在腦內有遷移能力 Kopen等將小鼠MSCs注入新生小鼠側腦室后12d，發(fā)現MSCs已遷移至前腦、小腦，而且不破壞腦組織結構，其遷移方式與出生后早期的神經發(fā)育過程相同，提示MSCs的行為類似神經前體細胞9。 3.3 目前MSCs移植治療局灶性腦缺血的途徑有3種：腦立體定向移植，經頸內動脈注射移植及經靜脈注射移植 腦立體定向移植：根據缺血損傷的部位采用腦立體定向術，將一定體積適當數量的MSCs直接注射到缺血損傷部位。該方法的缺點是：(1)對腦組織產生一定程度的損傷；(2)移植物的數量受一定程度的限制；(3)不便多次多靶點注射10。頸內動脈注射移植：可將MSCs直接經缺血側頸內動脈注入，

7、該方法與立體定向法相比有以下優(yōu)點：(1)移植的MSCs可廣泛分布于缺血半暗帶區(qū)；(2)創(chuàng)傷較小；(3)可允許較多數量、較大體積的移植物輸入；(4)有更多的BrdU陽性細胞在缺血區(qū)存活，缺點是：需要一定的技術條件，經靜脈注射移植簡便、安全、快捷、有效，一次可輸入較多數量的MSCs，而且進入腦內的MSCs分布在缺血壞死灶及其周邊區(qū)較大的范圍內。經靜脈或動脈注射較腦局部注射優(yōu)越，因MSCs隨血液循環(huán)分布更廣，除大部分集聚于靶點梗死區(qū)周邊的半暗帶區(qū)外，對側鏡區(qū)也有少量分布。移植后MSCs存活和分化需要各種細胞因子的營養(yǎng)、微環(huán)境的平衡及一定的血液供應，因此，最適合注射部位應在梗死區(qū)周邊的半暗帶區(qū)。 3.

8、4 移植的時間 動物研究從腦梗死模型建立后1天到1月移植均有，有關不同移植時間對神經的增生、細胞分化、整合及神經功能恢復的影響的研究還較少。急性期時興奮毒性神經基質、自由基等的釋放對新生組織造成損害。考慮到腦梗死的自然恢復過程，有些學者在腦梗死后數月進行移植，疤痕組織的形成可能會影響移植物的生長。 3.5 MSCs可參與正常的基質代謝，修復細胞外基質，促進神經元細胞的增殖、分化和遷移，參與中樞神經系統(tǒng)損傷的修復。 由于嚴重缺血或細胞因子的刺激，基質祖細胞可以沿內皮祖細胞伸展并聚集，因而有助于血管新生和(或)損傷愈合，Chen等發(fā)現，MSCs移植后14d，BrdU標記的MSCs可能與內皮祖細胞一

9、樣發(fā)揮作用，促進缺血組織的血管再生和損傷神經組織的修復。 3.6 移植的細胞數 既往研究腦局部注射移植的細胞總數為2.25×105(分為3個點注射)，靜脈或動脈注射移植的細胞數為26×106時，神經功能缺失癥狀均有恢復8，而靜脈移植的細胞數為1×106時，神經功能恢復不明顯。MSCs濃度太低，達不到治療效果，濃度太高易致靜脈栓塞。 3.7 移植后的表達率 對供體來源的MSCs用BrdU標記，雙染后免疫熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下計算BrdU和NeuN或GFAP均為陽性的細胞以判斷移植后的表達情況。表達率與移植的方式有關5，有報道一些神經營養(yǎng)因子可以提高誘導分化后的表

10、達率，在腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)及堿性纖維母細胞生長因子(bFGF)存在的情況下，NeuN的表達率達到2%，GFAP達8%。 3.8 MSCs治療腦梗塞 研究表明部分MSCs可通過正常的血腦屏障遷移到腦內廣泛的區(qū)域，局灶性腦缺血時，由于血腦屏障的破壞，可能有助于MSCs選擇性遷入缺血腦區(qū)，此外，缺血腦組織的炎癥等缺血相關信號也可能誘導和促進MSCs的遷移，由于腦缺血后局部微血管表達的粘附因子的引導，經靜脈或頸內動脈輸入體內的MSCs可以分化為類似神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞的細胞，這些細胞主要分布在缺血區(qū)，顯然腦內的特有微環(huán)境，尤其是缺血損傷信號誘導了MSCs

11、的遷移、分化，缺血微環(huán)境似乎有利于MSCs的存活、增殖，腦缺血可以誘導腦內尤其是缺血周邊區(qū)內膠質細胞系源性神經營養(yǎng)因子(glialcellline derived neurotrophic factor，GDNF)、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、轉化生長因子1(transforming growth factor 1，TGF1)等神經營養(yǎng)因子的表達，MCAO后，BrdU陽性的MSCs高度集中在缺血周邊區(qū)，該區(qū)表達的神經營養(yǎng)因子可能對隨后移植的MSCs的存活、分化或

12、遷移有重要作用10。 4 展望 MSCs的移植，尤其是自體MSCs移植克服了諸如倫理免疫排斥等問題，因此有更好的應用前景，MSCs極易在腦內存活、分化及整合，移植后并不產生炎癥和免疫排斥反應，所以MSCs移植治療局灶性腦缺血是切實可行的，但是下列問題需要進一步解決：(1)經靜脈或頸動脈注射的MSCs遷移入腦內的機制，以提高MSCs進入腦內的數量；(2)MSCs在腦內遷移、分化和存活的機制及影響因素；(3)MSCs在腦內分化的神經元、膠質細胞能否取代已死亡的神經元和膠質細胞，分化的神經元能否與宿主神經元形成功能性突觸聯系和神經環(huán)路，它們在腦缺血損傷恢復中的地位；(4)MSCs在腦內可否產生有關神

13、經營養(yǎng)因子、細胞因子及細胞外基質并參與神經功能重建；(5)將攜帶有關神經營養(yǎng)因子或細胞因子基因的載體轉染MSCs，使其在缺血腦內表達神經營養(yǎng)因子等，從而達到治療局灶性腦缺血的目的；(6)高效誘導MSCs體外分化的最佳方法及分化的神經元的移植對局灶性腦缺血的作用；(7)MSCs和基因治療 骨髓基質細胞移植入腦幾天內發(fā)生凋亡，那么如何提高其存活率將成為一個主要問題。Bcl-2基因是細胞凋亡的重要抑制基因，近年發(fā)現它在腦缺血中表達并在其中起重要作用，Shimizu等研究發(fā)現，缺血誘發(fā)的bcl-2蛋白可增強腦對后繼缺血的耐受性，具有神經保護作用，減少缺血神經細胞凋亡。因此可嘗試利用Bcl-2基因抗骨髓

14、基質細胞凋亡觀察是否增強MSCs治療腦梗死的效果。 參考文獻 1 Woodbury Dl. Adult rat and human bone Marrow stromal cells differentiate into Neurons. Neuro sci Res，2000，61：364-370 2 Colter DC. Identification of asub population of rapidly self renewing adult potential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Pr

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