骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究進(jìn)展(一)

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究進(jìn)展(一)    【摘要】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。雖然近幾年來(lái)有關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞的研究已取得了很大進(jìn)展，但仍有很多問(wèn)題有待進(jìn)一步解決。本文主要對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性、以及免疫耐受性、分化和促修復(fù)、間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記等問(wèn)題進(jìn)行綜述。 【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 分化 標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowderived Mesenchymalstem cells，BMSCs)是骨髓內(nèi)除造血干細(xì)胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一類干細(xì)胞，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，在體

2、內(nèi)外均具有支持和調(diào)控造血的作用。因其比較容易貼壁和形成成纖維樣的克隆，因此也稱成纖維細(xì)胞集落形成單位(Colonyforming unit fibroblast，CFUF)。又由于它們來(lái)自骨髓的支持結(jié)構(gòu)，并作為滋養(yǎng)層支持造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此也有人稱其為骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)。1 骨髓MSCs的生物學(xué)特性不同物種的BMSCs體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征大致相同，主要表現(xiàn)為梭形、紡錘形，少數(shù)為多角形 。目前，BMSCs的分離方法主要有以下幾種：(1)全骨髓培養(yǎng)，是將無(wú)菌抽取的骨髓加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液并培養(yǎng)，原代培養(yǎng)培養(yǎng)物以造血細(xì)胞成分居多，為利于

3、BMSCs的貼壁生長(zhǎng)，可采用DMEM和胎牛血清培養(yǎng)。BMSCs對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高，胎牛血清終濃度為1020，有人認(rèn)為紅細(xì)胞會(huì)隨著換液而逐漸被自然去除，對(duì)BMSCs影響不大。細(xì)胞融合后以1:2比例傳代，34天換液一次1；(2)離心培養(yǎng)法，是根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同，采用離心分離法提取單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在新鮮無(wú)菌的骨髓抽取物中加入抗凝培養(yǎng)液稀釋15002000rmin離心2030min，采集交界處的單核細(xì)胞層，PBS洗滌23次后，加入培養(yǎng)液接種培養(yǎng)；(3)細(xì)胞表面分子標(biāo)記分選法，主要是根據(jù)BMSCs的細(xì)胞表面分子特征來(lái)分離。一般采用流式細(xì)胞儀、免疫磁珠或免疫沉積法來(lái)進(jìn)行分選。但由于目前仍未找到BMS

4、Cs特異性的細(xì)胞表面標(biāo)記物2該法較少采用。影響B(tài)MSCs擴(kuò)增的主要因素：(1)血清：血清對(duì)大量擴(kuò)增BMSCs起著重要的作用，不同濃度的血清對(duì)培養(yǎng)BMScs純度的影響亦較大，常用1%20%的胎牛血清培養(yǎng)BMSCs;(2)接種密度：BMSCs的體外擴(kuò)增速度與其接種密度也有關(guān)，一般認(rèn)為較低密度種植有益于增殖。高密度接種后細(xì)胞生長(zhǎng)較慢其原因可能是由于細(xì)胞間的接觸抑制，或細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中的因子影響了BMSCs的生長(zhǎng);(3)細(xì)胞因子：一些細(xì)胞因子對(duì)于維持BMSCs增殖和未分化狀態(tài)亦十分重要;(4)動(dòng)物種屬：一般認(rèn)為BMSCs的生長(zhǎng)特性相似，但也有資料顯示BMSCs生長(zhǎng)特點(diǎn)有種屬差異3。2 間充質(zhì)干細(xì)胞移

5、植后的免疫耐受性在移植治療中，一般情況下，移植物會(huì)引起宿主的免疫排斥反應(yīng)。但對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)說(shuō)卻不是這樣。實(shí)驗(yàn)表明間充質(zhì)干細(xì)胞可以抑制T細(xì)胞的增殖從而導(dǎo)致免疫耐受47。T細(xì)胞與其它細(xì)胞的相互作用可以通過(guò)混和淋巴細(xì)胞反應(yīng)來(lái)觀察。被標(biāo)記的T細(xì)胞與其它細(xì)胞混合后，如果可以引起T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，則可以觀察到T細(xì)胞的增殖現(xiàn)象。但當(dāng)把間充質(zhì)干細(xì)胞與T細(xì)胞混合后卻觀察不到T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，而且這種現(xiàn)象并不是由于T細(xì)胞凋亡或其它的有害作用引起的。因?yàn)樵谌コg充質(zhì)干細(xì)胞后，這些T細(xì)胞仍然可以對(duì)其它物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。此外，使用趨化膜將兩種細(xì)胞分隔開培養(yǎng)后，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的抑制作用依然存在，表明這種抑制作用可能

6、通過(guò)某種可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞可以抑制T細(xì)胞的增殖外，實(shí)驗(yàn)也表明，隨著干細(xì)胞的分化，其抗原性并沒有隨之增加8。總之，間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)某種機(jī)制抑制T細(xì)胞的成熟來(lái)逃避免疫系統(tǒng)的清除。也暗示間充質(zhì)干細(xì)胞可能在機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)及骨髓中各種干細(xì)胞未分化狀態(tài)的維持方面起作用。3 促組織修復(fù)和細(xì)胞分化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是存在于骨髓組織中的一類成體干細(xì)胞(adult stem cells，AS)，在一定的誘導(dǎo)條件下，BMSCs具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，骨骼肌、軟骨細(xì)胞平滑肌、肌腱細(xì)胞，造血支持基質(zhì)等中胚層細(xì)胞分化的能力；同時(shí)可以向外胚層的星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、血

7、管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞分化。BMSCs跨系、甚至跨胚層橫向分化的可塑性及其強(qiáng)大的分化潛能使得它可為組織修復(fù)提供可能性。Kinnaird等9認(rèn)為，干細(xì)胞可能通過(guò)旁分泌的機(jī)制來(lái)促使缺血局部的血管生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞在缺氧條件下，一系列有關(guān)血管生成的細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)且分泌在培養(yǎng)基中。內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增生在這種培養(yǎng)基中被加強(qiáng)。而當(dāng)這些培養(yǎng)基注射進(jìn)動(dòng)物的后肢缺血部位后，加速了缺血區(qū)的側(cè)枝建立，改善了局部功能，降低了肌肉萎縮。Ziegelhoeffer等10在給后肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ妥⑸銰FP陽(yáng)性干細(xì)胞后，沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)內(nèi)皮或平滑肌細(xì)胞標(biāo)記的GFP陽(yáng)性細(xì)胞，但在新生血管周圍有大量GFP陽(yáng)性細(xì)胞，

8、而且一些生長(zhǎng)因子染色陽(yáng)性。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在普通顯微鏡下呈現(xiàn)內(nèi)皮或平滑肌細(xì)胞標(biāo)記陽(yáng)性的GFP陽(yáng)性細(xì)胞，實(shí)際上是一種假陽(yáng)性現(xiàn)象。當(dāng)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察時(shí)，發(fā)現(xiàn)這種陽(yáng)性細(xì)胞實(shí)際上是兩類細(xì)胞，一類表現(xiàn)內(nèi)皮或平滑肌細(xì)胞標(biāo)記陽(yáng)性，另一類為GFP陽(yáng)性細(xì)胞。很明顯，一些結(jié)果之間差別很大，甚至是相互矛盾的。出現(xiàn)這樣的情況可能有幾種原因：（1）一般實(shí)驗(yàn)是將干細(xì)胞提取、體外培養(yǎng)后再注射到機(jī)體內(nèi)。這個(gè)過(guò)程中，干細(xì)胞所處的人為環(huán)境和機(jī)體內(nèi)環(huán)境相差很大，這就可能導(dǎo)致干細(xì)胞的生理功能受到影響，發(fā)生干細(xì)胞的分化,甚至失去分化的能力；（2）由于干細(xì)胞的數(shù)量很少，而且間充質(zhì)干細(xì)胞并沒有很特異的標(biāo)志這樣就有可能導(dǎo)致提取

9、的干細(xì)胞純度不高，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差；（3）一些研究表明，干細(xì)胞在不同的器官或組織以及在不同的損傷中可能有不同的表現(xiàn)11。也就是說(shuō)，干細(xì)胞完全有可能在不同的情況下表現(xiàn)出不同的分化方向。4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記移植細(xì)胞的標(biāo)記及在活體內(nèi)的跟蹤在此類研究中起著不可或缺的作用。目前的細(xì)胞標(biāo)記方法主要有酶聯(lián)標(biāo)記HTDR標(biāo)記，Brdu標(biāo)記法等。BrdU為HTDR的類似物(analogue)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是胸腺嘧啶的堿基嘧啶環(huán)與第五位氫原子被溴原子取代后的一種鹵代物，當(dāng)細(xì)胞處于DNA合成期，如有Brdu存在，會(huì)使其摻入新合成的DNA中，只要細(xì)胞不消亡，這種存留是永久的，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色后可直接觀

10、察其在細(xì)胞內(nèi)的摻人情況。20世紀(jì)80年代以來(lái)，國(guó)外對(duì)Brdu的標(biāo)記方法進(jìn)行了大量研究，已證明能與 HTDR標(biāo)記的結(jié)果有良好的相關(guān)12。機(jī)體組織和細(xì)胞中無(wú)內(nèi)源性BrdU存在，BIdU被引入機(jī)體后能代替胸苷，由處于細(xì)胞增殖期的s期細(xì)胞特異性地?cái)z入其細(xì)胞核。標(biāo)記brdu的細(xì)胞在不受到紫外線照射的情況下對(duì)細(xì)胞沒有功能損害。采用brdu標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并采用抗brdu單克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色，體外觀察顯示。48小時(shí)后細(xì)胞標(biāo)記率90%。細(xì)胞的形態(tài)，生長(zhǎng)，增殖及分化未受影響。細(xì)胞移植四周后，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)仍可檢測(cè)到標(biāo)記細(xì)胞的存在。研究表明，BrdU標(biāo)記結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和sHTDR放射自顯影技術(shù)兩

11、種方法的觀察結(jié)果十分相似，且前者具有無(wú)放射性污染、省時(shí)、操作簡(jiǎn)單、不需特殊設(shè)備，且迅速安全和標(biāo)記效率高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)13。5 臨床應(yīng)用目前組織工程中細(xì)胞移植成為重要研究?jī)?nèi)容，其中BMSCs是繼造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞后的又一研究熱點(diǎn)。BMSCs是比較原始的細(xì)胞，可被定向誘導(dǎo)分化為臨床所需的多種組織細(xì)胞?？扇∽宰泽w骨髓，取材方便，且體外易培養(yǎng)，增殖快。并且由于來(lái)源于自體，BMSCs免疫原性較弱，能夠抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，由它誘導(dǎo)而來(lái)的組織在進(jìn)行移植時(shí)不存在組織配型及免疫排斥等問(wèn)題，亦不涉及倫理道德問(wèn)題，因此通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后的BMSCs是組織工程中理想的種子細(xì)胞。異體BMSCs注射到異染性腦白質(zhì)

12、營(yíng)養(yǎng)不良患者發(fā)現(xiàn)沒有反應(yīng)性異常的T細(xì)胞出現(xiàn)和GVHD發(fā)生14 異體移植骨髓MSCs在重度特發(fā)性再生障礙性貧血患者中植活也被證明，具有改善骨髓基質(zhì)功能的作用15。6 存在問(wèn)題和展望盡管近年來(lái)對(duì)骨髓MSCs的研究取得了很大進(jìn)展，但仍然存在下列問(wèn)題有待解決:（1）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺少特異性表面標(biāo)志物，對(duì)其鑒定困難，只能結(jié)合其形態(tài)和部分表面標(biāo)志物進(jìn)行綜合判斷。目前對(duì)于干細(xì)胞也僅限于功能上的定義，而沒有足夠的形態(tài)學(xué)和表型上存在的證據(jù)。因此在分離提取間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，由于對(duì)干細(xì)胞的特性尚缺乏足夠的了解，使分離方法幾乎不可能達(dá)到完全純化；(2)BMSCs培養(yǎng)過(guò)程中的異質(zhì)性，影響了干細(xì)胞分離純化的效果。長(zhǎng)期培養(yǎng)

13、發(fā)現(xiàn)，BMSCs多次傳代后，并不能保留其分化能力。對(duì)于傳代后MSCs分化能力喪失的原因，近來(lái)有人認(rèn)為與端粒酶缺失有關(guān)，依據(jù)是端粒酶基因敲除后的小鼠骨髓BMSCs，即使是早期的BMSCs也不能分化為軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞16。盡管對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的特性還有很多未知，但由于BMSCs具有多向分化潛能和高增殖特性，取材容易，對(duì)機(jī)體損傷小，易于基因操作，組織相容性好等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是組織工程和基因工程理想的靶細(xì)胞。人們期望把BMSCs運(yùn)用于臨床疾病的治療，比如心血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及外科損傷等領(lǐng)域的治療。在這些領(lǐng)域的研究中有很多已經(jīng)獲得成功，因此BMSCs有著廣闊的臨床應(yīng)用前景?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】舒

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