ATRA誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo分化與凋亡

1、    ATRA誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo分化與凋亡        摘要：目的體外研究維甲類化合物的衍生物ATRA對(duì)LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞株的作用。方法觀察ATRA作用下LoVo細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果ATRA使細(xì)胞增殖抑制，細(xì)胞阻滯于G0/G1期，高濃度組出現(xiàn)亞“G0/G1”峰。ALP比值增高，高濃度組電鏡下見凋亡細(xì)胞，TDT法測(cè)凋亡細(xì)胞比例增高，但傳6代后不增加。結(jié)論提示ATRA可誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞分化及凋亡，但有一定限度；實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床應(yīng)用ATRA化學(xué)預(yù)防結(jié)腸癌提供理論

2、依據(jù)。關(guān)鍵詞：結(jié)腸腫瘤；細(xì)胞周期；凋亡；維甲酸；腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的分類號(hào)：R73-361文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-7431(2000)01-0004-04ALL-TRANS-RETINOIC ACID INDUCED DIFFERENTIATION AND APOPTOSIS OF COLORECTAL CANCER CELL LINE LoVoLU Ai-guo(Surgical Department, Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University，Shanghai 200025 China)YU Bo-ming(Surgical

3、 Department, Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University，Shanghai 200025 China)ZHENG Min-hua(Surgical Department, Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University，Shanghai 200025 China)Abstract：ObjectiveThe potential roles of all-trans-retinoic acid (ATRA) in colorectal cancer cell line LoV

4、o in vitro were studied.MethodsThe proliferation, the cell cycle and the apoptosis of LoVo cells were determined after treated with ATRA.ResultsATRA could significantly inhibit proliferation of LoVo and greatly increase ALP of the cells in time-dependent manner.In cytometry analysis,LoVo cells lines

5、 accumulated in G1 phase and appeared an extra “sub-G0/G1 peak” when higher dosage of ATRA was presented.Apoptotic cells only in 10-5mol ATRA were found by electronic microscopy.ConclusionATRA could both induce differentiation and apoptosis of LoVo cells.This observation may become an indicator for

6、clinical trials on prevention of colorectal cancer.Key words：Colorectal neoplasms;Cell cycle;Apoptosis;Retinoic acid;Tumor cell,cultured維甲類化合物在機(jī)體生長、發(fā)育、分化和致癌過程中起著重要作用1，ATRA是維甲類化合物的衍生物，在許多細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)具有抑制生長，誘導(dǎo)分化甚至凋亡作用13。在作者的研究中也發(fā)現(xiàn)ATRA有誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo分化作用4，但是否存在凋亡及分化和凋亡的聯(lián)系尚未見報(bào)道，我們就此作進(jìn)一步研究。材料和方法一、材料LoVo細(xì)胞株取自結(jié)

7、腸癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，由美國建株，從中國科學(xué)院細(xì)胞所購買。ATRA，上海第六制藥廠產(chǎn)品，無水乙醇溶解除菌過濾，實(shí)驗(yàn)及對(duì)照組乙醇濃度均為0.05 %。MTT(氮蘭四唑鹽)，d-UPT,FITC,RNase，堿性磷酸酶試劑盒，末端轉(zhuǎn)移酶購自Sigma公司。二、方法1.細(xì)胞培養(yǎng)LoVo細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10 %小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)中，48 h換液1次，換液時(shí)均在弱光下進(jìn)行。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.細(xì)胞計(jì)數(shù)及活性測(cè)定將10-6mol ATRA作用第6天及傳4代的LoVo細(xì)胞用0.25 %的胰酶消化成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)排染法測(cè)細(xì)胞活力，并用TDT法測(cè)凋亡細(xì)胞比例。3.細(xì)胞增殖測(cè)定采用MTT法5

8、。細(xì)胞消化后培養(yǎng)在96孔板，每孔加細(xì)胞5×103。實(shí)驗(yàn)分1×10-5mol、1×10-6mol、1×10-7mol三組藥物濃度和對(duì)照及空白對(duì)照5組，分別于加藥后第2、4、6天進(jìn)行MTT測(cè)定。測(cè)定值用吸光率A表示。按方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。生長抑制率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)4.流式細(xì)胞儀(FCM)分析細(xì)胞周期分別在10-5、10-6mol ATRA作用下LoVo細(xì)胞于加藥后第2、4、6天、傳代2、4、6次后與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行FCM測(cè)定，采用單染色單激光法6。5.電鏡下觀測(cè)凋亡細(xì)胞LoVo細(xì)胞在1×10-5mol、

9、1×10-6mol ATRA作用6天后，同對(duì)照細(xì)胞用2% 戊二醛、鋨酸固定，酒精逐級(jí)脫水、滲透、618-環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、鈾鉛染色后在透射電鏡下觀察凋亡細(xì)胞。6.TDT法定量檢測(cè)凋亡細(xì)胞將貼壁細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，于沉淀細(xì)胞中加入含有1%甲醛的PBS 1 ml，30 min，加入0.5 g末端轉(zhuǎn)移酶，0.5 nmol/L b-16 dUTP，37，30 min取出，PBS洗滌后加入生物素標(biāo)記的FITC。室溫避光30 min。熒光顯微鏡下呈熒光陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分率的多少來判斷ATRA對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。每次測(cè)定時(shí)間對(duì)照及處理組各3個(gè)標(biāo)本，重復(fù)實(shí)

10、驗(yàn)2次。7.堿性磷酸酶比活性測(cè)定細(xì)胞消化離心后PBS洗滌3次，去上清液，加0.25 %脫氧膽酸鈉0.5 ml，液氮凍存以備測(cè)。堿性磷酸酶測(cè)定用堿性磷酸酶試劑盒(包括基質(zhì)緩沖液，終止液)采用磷酸苯二鈉法?？偟鞍诇y(cè)定采用紫外吸收法7。ALP比活性(IU/mg)=ALP值/總蛋白量結(jié)果一、MTT法測(cè)定細(xì)胞生長抑制MTT法測(cè)定反映活細(xì)胞量，通過比色方法測(cè)定吸光率了解細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是ATRA對(duì)LoVo細(xì)胞有生長抑制作用，并呈時(shí)間依賴關(guān)系，最高抑制率達(dá)48.86 %，三組藥物濃度與對(duì)照組比較在第6天時(shí)均有顯著差異，提示在10-510-7mol間均為有效藥物濃度(見表1)。表1MTT測(cè)細(xì)胞增殖(A值

11、)分組組數(shù)藥物作用時(shí)間第2天第4天第6天10-5mol ATRA120.6890±0.07330.7951±0.0627*0.8727±0.0468*10-6mol ATRA120.6462±0.10200.8178±0.1001*0.9203±0.449*10-7 mol ATRA120.6918±0.7560.8206±0.0676*1.0271±0.0796*對(duì)照組120.7220±0.07891.0908±0.11051.5166±0.1268*P0.05?*P0.0

12、1 二、10-6mol ATRA 作用下第6天及傳5代細(xì)胞其細(xì)胞活力均90 %，TDT測(cè)凋亡細(xì)胞比例未見增高，提示10-6 mol/L濃度并不促使細(xì)胞死亡。三、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期顯示藥物作用下，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增高，G2/M期+S期比例下降，10-5 mol組第6天及轉(zhuǎn)代2、4、6代細(xì)胞周期又開始發(fā)生變化。G0/G1期比例逐漸下降，S期細(xì)胞比例逐漸上升，同時(shí)直方上第6天出現(xiàn)亞“G0/G1”峰，而10-6組傳6代后直方上不出現(xiàn)“亞G0/G1”峰(見表2)。表2FCM測(cè)各期細(xì)胞比例(%)G0G1期S期G2+M期凋亡比例處理組對(duì)照組處理組對(duì)照組處理組對(duì)照組處理組對(duì)照組第2天A67.233

13、.422.237.810.628.89.688.47B63.533.418.537.81828.83.298.47第4天A78.341.14.440.417.318.59.542.58B65.741.113.740.420.618.53.842.58第6天A57.448.928.037.214.613.921.54.95B78.514.95傳2代A42.546.145.338.712.115.321.232.9傳4代A50.954.732.527.416.517.933.79.98傳6代A48.351.338.123.513.625.327.22.5

14、0B74.051.315.823.510.325.38.682.50注：A為10-5 mol組；B為10-6 mol組 四、透射電鏡發(fā)現(xiàn)10-5mol組有特征性的凋亡細(xì)胞，其染色質(zhì)濃集，成新月形，核固縮，細(xì)胞膜完整，而10-6mol組及對(duì)照組未找到特征性凋亡細(xì)胞。五、TDT法可以定量測(cè)定凋亡細(xì)胞8，它是用生物素標(biāo)記的d-TUP在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下標(biāo)記到DNA的5端缺口上，再用親和素標(biāo)記的FITC與之結(jié)合使發(fā)生熒光，在熒光顯微鏡下即可觀察。在10-5mol/L ATRA作用下凋亡細(xì)胞逐漸增多，呈時(shí)間依賴關(guān)系，但傳4代以后凋亡細(xì)胞比例進(jìn)入平臺(tái)期。說明ATRA對(duì)LoVo細(xì)胞的凋亡作用有一定限度。10

15、-6mol組凋亡細(xì)胞比例未見明顯增高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與藥物濃度相關(guān)(見表3)。表3TDT測(cè)凋亡細(xì)胞比例(%)分組藥物作用時(shí)間第2天第4天第6天傳2代傳4代傳6代對(duì)照組6.67±0.5777±18.67±1.1556.67±1.1556.33±1.1558.33±0.577處理組*15.67±1.52821.67±3.21529.67±2.08234.67±2.51142.33±3.21539.67±2.517?處理組ATRA濃度為1×10-5mol/L 六、腸型ALP

16、是LoVo細(xì)胞成熟分化標(biāo)志酶7，該酶為熱不穩(wěn)定酶。在實(shí)驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)10-6mol/L ATRA作用下ALP比活性持續(xù)不斷增高，存在時(shí)間依賴關(guān)系，而且早期即升高。測(cè)65溫育后ALP值顯著下降，表明ALP為熱不穩(wěn)定酶即腸型ALP，是LoVo細(xì)胞成熟分化的表現(xiàn)。10-5mol組在第6天及傳4代后ALP比活性仍明顯高于對(duì)照組，提示誘導(dǎo)分化也發(fā)生在高濃度組(見表4)。表4腸型ALP比活性測(cè)定(10-2 IU/mg)分組藥物作用時(shí)間第2天第4天第6天傳2代傳4代傳6代10-6組4.622±0.2766.394±0.2768.640±0.41610.81±0.4641

17、4.77±0.66523.09±0.81110-5組8.23±0.46512.61±0.896對(duì)照組3.19±0.2343.191±0.1593.231±0.2683.079±0.1783.280±0.1663.276±0.108討論 分化和凋亡是腫瘤化學(xué)防治中的新思路，正越來越受到重視。誘導(dǎo)分化在治療急性早幼粒白血病的成功確立了其在腫瘤防治中的地位9。在實(shí)體瘤中，誘導(dǎo)分化在腫瘤的化學(xué)預(yù)防，尤其是來自上皮的惡性腫瘤，包括預(yù)防第二原發(fā)癌中有廣闊前景和潛在的意義1。凋亡近來更是成為研究熱點(diǎn)，眾多學(xué)者

18、認(rèn)為腫瘤發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)歸與凋亡的調(diào)控正常與否密切相關(guān)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡即可達(dá)到治療腫瘤目的10。眾多實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了許多誘導(dǎo)劑可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化或凋亡，更讓人高興的是有些誘導(dǎo)劑既可誘導(dǎo)分化又能誘導(dǎo)凋亡。如活性D3誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞分化和凋亡11，硒、5-FU誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞T29分化和凋亡12，13。維甲類許多制劑在眾多腫瘤細(xì)胞系中顯示明顯的誘導(dǎo)分化和凋亡作用。如ATRA，CRA對(duì)乳腺癌細(xì)胞株2，4-HPR誘導(dǎo)胚胎瘤細(xì)胞F9，SLCC等14，15。在作者的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ATRA作用下腸型ALP增加，提示LoVo細(xì)胞成熟分化，在高濃度組，電鏡下見典型凋亡細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定高濃度組出現(xiàn)“亞G0/G1凋亡峰”，TD

19、T法測(cè)凋亡細(xì)胞比例增加，有時(shí)間依賴關(guān)系，但傳6代后凋亡細(xì)胞比例不增加，說明ATRA也能使大腸癌細(xì)胞分化和凋亡。凋亡的發(fā)生與細(xì)胞增殖分化的不同狀態(tài)密切相關(guān)16。凋亡可以發(fā)生在細(xì)胞終末分化后，繼而細(xì)胞死亡，在許多細(xì)胞系內(nèi)終末分化等于死亡17。凋亡也可能和細(xì)胞分化同時(shí)發(fā)生，誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞正常分化，而不能分化的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，這是誘導(dǎo)分化和凋亡防治腫瘤的理想方式。作者的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10-6mol/L處理組ALP比活性持續(xù)升高，但凋亡細(xì)胞比例并不升高，藥物誘導(dǎo)細(xì)胞分化但不誘導(dǎo)凋亡。10-5mol/L處理組ALP比活性升高且凋亡細(xì)胞比例也升高，提示凋亡與分化同時(shí)存在，但凋亡與分化是獨(dú)立的兩種方式，凋亡并不繼

20、發(fā)于細(xì)胞終末分化而與誘導(dǎo)藥物濃度相關(guān)，推測(cè)高濃度ATRA觸發(fā)了誘發(fā)凋亡的啟動(dòng)點(diǎn)。目前也發(fā)現(xiàn)有些維甲酸衍生物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并不伴有誘導(dǎo)分化，兩者不相干，HPR誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤凋亡即為典型例子18。也有發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡取決于是否誘導(dǎo)成熟分化，誘導(dǎo)成熟分化時(shí)則不易誘導(dǎo)凋亡，而誘導(dǎo)凋亡則不能誘導(dǎo)成熟分化，誘導(dǎo)分化和凋亡經(jīng)過一條共同信息通路，bcl-2蛋白在其中起調(diào)節(jié)作用19。就維甲類化合物在抗實(shí)體瘤作用來看，盡管一些新合成藥物如HPR對(duì)NSLC，乳腺癌等體外有很強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尚無滿意效果，其他維甲類化合物包括ATRA誘導(dǎo)凋亡作用不強(qiáng)。作者的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞株凋亡有一定限度而且發(fā)生

21、較遲，因此用于化學(xué)治療難于取得滿意效果，維甲酸在大腸癌上的意義主要在化學(xué)預(yù)防上。維甲酸的誘導(dǎo)分化和凋亡改變了傳統(tǒng)化療對(duì)正常和腫瘤組織格殺勿論的缺陷，為腫瘤治療尋找新的靶點(diǎn)，值得深入研究。作者簡介：陸愛國，男，碩士，主治醫(yī)師。作者單位：陸愛國（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院外科，上海，200025）郁寶銘（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院外科，上海，200025）李東華（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院外科，上海，200025）崔?。ㄉ虾５诙t(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院外科，上海，200025）參考文獻(xiàn)：1Smith MA,Parkinson DR,Cheson BD,et al. Retinoids in ca

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