外源性TNF-α對(duì)bBMP異位誘導(dǎo)成骨的影響

1、    外源性TNF-對(duì)bBMP異位 誘導(dǎo)成骨的影響        摘要目的: 了解局部注射重組人腫瘤壞死因子(rhTNF-)對(duì)牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bBMP)在小鼠體內(nèi)異位誘導(dǎo)成骨的影響。 方法： 采用X線檢查成骨面積像分析、 堿性磷酸酶活性測(cè)定、 鈣含量測(cè)定和組織學(xué)檢查等方法， 對(duì)局部注射不同劑量rhTNF-后bBMP誘導(dǎo)成骨活性的變化進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果： bBMP5 mg植入小鼠肌袋內(nèi)可誘發(fā)一個(gè)完整的骨發(fā)育過(guò)程， 導(dǎo)致異位骨軟骨組織發(fā)生； 在bBMP植入?yún)^(qū)注射rhT

2、NF-后， bBMP誘導(dǎo)成骨活性受到干擾， 表現(xiàn)為成骨活性隨rhTNF-注射劑量的增加而減??； rhTNF-使bBMP誘導(dǎo)的間充質(zhì)細(xì)胞分化成骨過(guò)程受到影響， 導(dǎo)致成骨時(shí)間延長(zhǎng)或完全阻滯。 結(jié)論： rhTNF-在小鼠體內(nèi)可削弱bBMP的異位誘導(dǎo)成骨能力并抑制間充質(zhì)細(xì)胞分化成骨。關(guān)鍵詞腫瘤壞死因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白骨誘導(dǎo)骨發(fā)育The Effects of Recombinant Human Tumor Necrosis Factor- on Heterotopic Bone Formation Induced by Bovine Bone Morphogenetic ProteinGuo Zheng,

3、 Hu Yunyu, Lü Rong, et al. Institute of Orthopedics, Xijing Hospital of Fourth Military Medical University, Xian 710032AbstractObjective: In investigate the effects of local injection of recombinant human tumor necrosis factor-(rhTNF-) on heterotopic bone formation (HBF) induced by bovine bone

4、morphogenetic protein (bBMP) in the muscle porch of mice. Methods: In mice, bBMP-induced HBF receiving injections of different doses of rhTNF- were assessed quantitatively by computer x-ray image analysis, alkaline phosphatase activity, calcium content, and histological examination. Results:1. A nat

5、ural process of bone formation was induced by 5mg of bBMP. 2. The osteogenic ability of bBMP was interfered with injections of rhTNF-. The more rhTNF- injected, the less osteogenesis induced. 3. Local injections of rhTNF- inhibited the transformation of the mesenchymal cells into osteogenic cells an

6、d the bone development. The osteogenisis induced by bBMP was delayed or stopped. Conclusion: This study suggests that rhTNF- can reduce the bBMP-induced HBF and inhibit the process of bone development.Key wordsTumor necrosis factor-Bone morphogenetic proteinBone inductionBone developmentTNF-是調(diào)節(jié)植骨局部免

7、疫反應(yīng)的重要細(xì)胞因子， 又是局部骨吸收的有效刺激劑， 可直接參與骨代謝的調(diào)節(jié)13。 然而， TNF-在體內(nèi)對(duì)BMP誘導(dǎo)成骨過(guò)程的影響不清楚。 研究表明， 免疫反應(yīng)阻礙BMP的異位誘導(dǎo)成骨， 但免疫細(xì)胞因子是否在其中起調(diào)節(jié)作用未見(jiàn)證實(shí)。 本實(shí)驗(yàn)采用成骨活性定量分析方法， 研究小鼠體內(nèi)bBMP植入局部注射不同劑量的重組人TNF-(rhTNF-)后， bBMP異位誘導(dǎo)成骨活性的變化， 探討TNF-對(duì)BMP誘導(dǎo)成骨影響的可能機(jī)制。 材料與方法bBMP提?。?取新鮮小牛長(zhǎng)骨干， 機(jī)械粉碎， 經(jīng)脫脂、 脫鈣、 脫雜蛋白后， 行抽提、 透析、 離心， 得bBMP粗提物， 再將粗提物溶解， 離心去沉渣， 經(jīng)透

8、析、 再離心、 表面洗滌， 干燥后即為實(shí)驗(yàn)用bBMP。動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)處理： 取雄性BALB/c小鼠90只， 體重2022 g， 隨機(jī)分成A、 B、 C三組， 每組30只。 無(wú)菌條件下將bBMP5 mg植入小鼠右側(cè)股部肌間隙內(nèi)。 于術(shù)前1天、 手術(shù)當(dāng)日及術(shù)后第1、 2、 3、 7天， 在實(shí)驗(yàn)組(A組和B組)bBMP植入?yún)^(qū)， 分別注入rhTNF-溶液0.1 g和1.0 g； 在對(duì)照組(C組)注入人血清白蛋白(HSA)50 g。 術(shù)后5、 9、 14、 21和30天取材， 標(biāo)本均分成兩份， 用于生化學(xué)檢查和組織學(xué)觀察。檢查方法： X線檢查及計(jì)算機(jī)像分析： 選擇術(shù)后14天和21天觀察時(shí)間點(diǎn)， 處死動(dòng)物

9、后拍攝小鼠雙下肢X線片， 用攝像機(jī)采集像， 計(jì)算機(jī)像分析肌袋內(nèi)成骨面積。 堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定： 標(biāo)本稱濕重， 勻漿器勻漿， 離心取上清， 用生化分析儀檢測(cè)ALP活性， 結(jié)果為IU/L， 再除以標(biāo)本濕重(g)， 即得ALP單位IU/g組織濕重。 組織鈣含量測(cè)定： 取ALP活性測(cè)定時(shí)的離心沉淀物， 加消化液， 低溫消化至無(wú)炭化， 加水溶解殘?jiān)?再加5%鑭(La3+)溶液， 用去離子水定容， 原子吸收光譜儀測(cè)定鈣含量， 結(jié)果以g/mg組織濕重表示。 組織學(xué)觀察： 取材組織塊經(jīng)10%中性福爾馬林固定2436小時(shí)， 混合脫鈣液脫鈣12小時(shí)， 充分水洗， 逐級(jí)脫水、 浸蠟， 石蠟包埋。 切5

10、m厚切片， HE染色， 光鏡觀察。結(jié)果X線檢查及像分析： 術(shù)后14天時(shí)， A組和C組在bBMP植入部位可見(jiàn)邊界不甚清晰的橢圓形高密度骨質(zhì)影， 其密度大于肌肉組織， 小于股骨干； B組未見(jiàn)明顯成骨影。 術(shù)后21天時(shí)， A組和C組成骨影增大， 邊緣清晰， 密度增加， 其骨塊周邊密度近似于股骨干密度； B組仍未見(jiàn)成骨影出現(xiàn)。 X線檢查成骨面積像處理結(jié)果見(jiàn)表1。ALP活性測(cè)定： 結(jié)果見(jiàn)表2。組織鈣含量測(cè)定： 結(jié)果見(jiàn)表3。表1X線檢查成骨面積像分析結(jié)果(mm×mm, ±s)組別術(shù)后14天術(shù)后21天A4.53±1.00*16.63±2.46*B0.36±0

11、.06*0.34±0.11*C24.97±4.1334.39±4.61? A、B組與C組比較， P值均0.01； A組與B組比較， P值0.01。 表2標(biāo)本中ALP水平測(cè)定結(jié)果(IU/g, ±s)天A組B組C組53.23±0.561.56±0.43*3.16±0.82919.24±2.01*8.11±1.01*27.84±2.471424.83±3.34*12.22±1.65*39.48±2.462126.94±1.365.40±0.77*29.

12、72±3.903010.21±2.48*1.87±0.27*17.37±2.01* 與C組相比較， P值均0.01； 與B組比較， P值均0.01。 表3標(biāo)本中Ca含量測(cè)定結(jié)果(g/mg, ±s)天A組B組C組50.47±0.110.36±0.09*0.58±0.0993.06±0.60*1.55±0.20*4.14±0.731412.53±1.32*5.81±0.95*15.03±1.642116.69±1.24*5.78±0.53*

13、18.72±1.033017.69±1.456.75±1.04*19.32±1.72* 與C組比較， P值均0.05； * 與C組比較， P值均0.01； 與B組比較， P值均0.01 組織學(xué)檢查： 術(shù)后5天， 各組bBMP植入?yún)^(qū)均可見(jiàn)間充質(zhì)細(xì)胞及纖維母細(xì)胞增殖， 同時(shí)可見(jiàn)數(shù)量不等的單核淋巴細(xì)胞。 術(shù)后9天， C組見(jiàn)軟骨島形成， A組和B組未見(jiàn)典型軟骨細(xì)胞。 術(shù)后14天， C組見(jiàn)類骨組織形成， A組見(jiàn)少量軟骨形成， B組為纖維組織。 術(shù)后21天， C組見(jiàn)大量網(wǎng)織骨， 有豐富骨髓腔及原始骨髓， A組為大量軟骨和少量類骨組織， B組形成瘢痕組織。 術(shù)后30天

14、， C組出現(xiàn)板層骨， A組為網(wǎng)織骨， B組仍為瘢痕組織。討論研究證實(shí)， BMP具有異位骨誘導(dǎo)活性， 可誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞不可逆地分化為軟骨和骨組織，導(dǎo)致異位新骨形成4。 BMP誘導(dǎo)成骨活性受局部微環(huán)境的影響， 免疫反應(yīng)是影響骨誘導(dǎo)形成的重要因素。 研究表明， 同種異體或異種骨移植可誘發(fā)免疫排異反應(yīng)， 主要形式為細(xì)胞免疫反應(yīng)， 且與移植物的骨誘導(dǎo)活性呈負(fù)相關(guān)5。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)， bBMP植入小鼠肌袋內(nèi)可誘導(dǎo)異位骨形成， 而在bBMP植入局部注射rhTNF-干擾了這一誘導(dǎo)成骨過(guò)程， 使新骨形成面積明顯減少。 在誘導(dǎo)成骨過(guò)程的早期， 每日注射0.1 g rhTNF-， 14天時(shí)， 與對(duì)照

15、組相比， 成骨面積減少81.86%， 21天時(shí)減少51.64%。 而每日注射1.0 g rhTNF-導(dǎo)致bBMP誘導(dǎo)成骨能力完全喪失。 表明bBMP誘導(dǎo)成骨量與局部rhTNF-濃度有關(guān)， rhTNF-濃度越高， bBMP誘導(dǎo)成骨量就越少。TNF-可作為一種潛在性破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞增殖和分化的刺激因子， 刺激破骨性骨吸收， 從而使骨吸收大于骨生成6。 TNF-還可通過(guò)阻礙成骨樣細(xì)胞增殖、 型膠原合成及堿性磷酸酶活性等來(lái)抑制骨形成7。 人體內(nèi)許多伴發(fā)骨質(zhì)吸收的疾病與局部或全身TNF-含量增高有關(guān)810。 我所近期研究顯示， 某些溶骨性疾病， 病變組織中即有TNF-的高表達(dá)， 同時(shí)又有BMP表達(dá)的

16、增強(qiáng)， 由此推測(cè)， TNF-的過(guò)高表達(dá)可能會(huì)在局部造成一種不利于BMP或其他成骨細(xì)胞因子發(fā)揮效應(yīng)的環(huán)境， 使誘導(dǎo)成骨作用減弱， 最終導(dǎo)致骨吸收。本實(shí)驗(yàn)組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)， 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組術(shù)后9天在細(xì)胞分化和骨質(zhì)形成階段發(fā)生了變化， 表現(xiàn)為低劑量組bBMP誘導(dǎo)骨形成的時(shí)間晚于對(duì)照組， 高劑量組無(wú)新骨形成， 提示rhTNF-對(duì)bBMP誘導(dǎo)成骨過(guò)程的影響可能主要發(fā)生在細(xì)胞分化期和骨質(zhì)形成期， 而對(duì)bBMP的招募、 促分裂作用無(wú)明顯影響。 bBMP植入?yún)^(qū)注入rhTNF-后， 局部出現(xiàn)多量單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)， 提示rhTNF-也可能通過(guò)刺激炎性細(xì)胞增殖并產(chǎn)生其他的骨誘導(dǎo)抑制因子間接地干擾或阻斷bBMP的

17、誘導(dǎo)成骨作用。本研究結(jié)果提示， TNF-可在BMP誘導(dǎo)成骨的早期細(xì)胞分化階段發(fā)揮效能， 抑制異位骨化發(fā)生。 這也許為我們進(jìn)一步研究異位骨化的防治奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1Bertolini DR, Nedwin GE, Bringman TS, et al. Stimulation of bone resorption and inhibition of bone formation in vitro by human tumor necrosis factor. Nature,1986,319:516-518. 2Canalis E. Effects of tumor necrosis

18、 factor on bone formation in vitro. Endocrinology,1987,121:1596-1604.3Konig A, Muhlbauer C,Fleisch H. Tumor necrosis factor- and interleukin-1 stimulate bone resorption in vivo as measured by urinary (3H) tetratcyeline excretion from prelabeled mice. J Bone Mineral Res,1988,3:621-627.4Urist MR,Lietz

19、e A, Mizutani H, et al. A bovine low molecular weight bone morphogenetic protein (BMP) fraction. Clin Orthop,1982,162:219-232. 5Wlodarski KH,Kobus M. Association of giant multinucleated cells with deterioration of osteoinductive potency of bone matrix. Arch Immunol Ther Exp Warsz,1992,40:83-87.6Ming WJ, Bersani L,Mantovani A. Tumor necrosis factor is chemotactic for monocytes and polymorphonuclear leukocytes. J Immunol, 1987,138:1469-1474.7Pluijm G. Most W, Wee-pa