第二章植物組織培養(yǎng)的基本原理

1、 講授內(nèi)容講授內(nèi)容n 1.1 細(xì)胞的全能性細(xì)胞的全能性n 1.2植物細(xì)胞分化與脫分化植物細(xì)胞分化與脫分化n 1.3植物的形態(tài)建成植物的形態(tài)建成n 1.4基因表達(dá)與位置效應(yīng)及器官分基因表達(dá)與位置效應(yīng)及器官分 化信息傳遞化信息傳遞第二章第二章 植物組織培養(yǎng)的基本原理植物組織培養(yǎng)的基本原理植物細(xì)胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整細(xì)胞核的植物細(xì)胞，都擁有形成一個(gè)完整植珠所必須的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。 （Haberlandt, 1902）1.1 植物細(xì)胞全能性1、細(xì)胞全能性（cell totipotency) ：植物體的每一個(gè)具有完整細(xì)胞核的細(xì)胞都具有該物

2、種全部遺傳的物質(zhì)，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)細(xì)胞全能性細(xì)胞全能性（紅蘿卜）1.1.分化分化differentiationdifferentiation： 細(xì)胞細(xì)胞在分裂過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的在分裂過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，從而在個(gè)體發(fā)育中形成各類改變，從而在個(gè)體發(fā)育中形成各類組織和器官完成整個(gè)生活周期。組織和器官完成整個(gè)生活周期。1.2 植物細(xì)胞的分化與脫分化植物細(xì)胞的分化與脫分化高等植物細(xì)胞分化示意圖高等植物細(xì)胞分化示意圖幼年細(xì)胞細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂多細(xì)胞團(tuán)形態(tài)建成完整植株細(xì)胞分化細(xì)胞分化2.脫分化dedifferentiation: 已分化好的細(xì)胞

3、在人工誘導(dǎo)條件下，恢復(fù)分生能力，回復(fù)到分生組織狀態(tài)的過程。3.再分化redifferentiation: 脫分化后具有分生能力的細(xì)胞再經(jīng)過與原來相同的分化過程，重新形成各類組織和器官的過程。1.2 植物細(xì)胞的分化與脫分化植物細(xì)胞的分化與脫分化離體的植物離體的植物器官、組織、器官、組織、細(xì)胞細(xì)胞脫分化脫分化愈愈傷傷組組織織再分化再分化根根芽芽再再生生植植株株植物組織培養(yǎng)過程植物組織培養(yǎng)過程（高等植物細(xì)胞脫分化和在分化示意圖）（高等植物細(xì)胞脫分化和在分化示意圖）1.3 植物的形態(tài)建成植物的形態(tài)建成1.3 植物的形態(tài)建成植物的形態(tài)建成細(xì)胞培養(yǎng)再生細(xì)胞培養(yǎng)再生完整的植株完整的植株莖芽分化（器官分化）莖

4、芽分化（器官分化）體細(xì)胞胚胎發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生外植體的成苗途徑外植體的成苗途徑試管苗試管苗外植體外植體愈傷組織愈傷組織根、芽根、芽芽芽根根根根 芽芽體細(xì)胞胚體細(xì)胞胚試管苗試管苗體細(xì)胞胚體細(xì)胞胚試管苗試管苗1.3.1愈傷組織的誘導(dǎo)與器官分化一、基本概念脫分化 ： 具有特定結(jié)構(gòu)與功能的植物組織，在一定條件下具有特定結(jié)構(gòu)與功能的植物組織，在一定條件下，細(xì)胞改變?cè)瓉淼姆只癄顟B(tài)，失去原有的結(jié)構(gòu)與功能，轉(zhuǎn)，細(xì)胞改變?cè)瓉淼姆只癄顟B(tài)，失去原有的結(jié)構(gòu)與功能，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹稚芰Φ募?xì)胞的過程變?yōu)榫哂蟹稚芰Φ募?xì)胞的過程 。愈傷組織： 植物各種器官的外植體在離體的條件下，細(xì)胞經(jīng)脫分植物各種器官的外植體在離體的條件下，

5、細(xì)胞經(jīng)脫分化等一系列過程，轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚?xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)變形成一種能化等一系列過程，轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚?xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)變形成一種能夠迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞團(tuán)夠迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞團(tuán) 一般低，植物各器官、組織都有被誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織的潛在可能性。 自然條件下的植物愈傷組織刺桐刺桐樹樹1.3.1愈傷組織的誘導(dǎo)與器官分化愈傷組織的誘導(dǎo)與器官分化一）、愈傷組織的誘導(dǎo) 誘導(dǎo)愈傷組織的成敗關(guān)鍵主要不是實(shí)驗(yàn)材料，而是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。1、 常用激素與濃度激素類型 激素濃度生長素類（2，4-D, IAA , NAA) 0.0110 mg/L細(xì)胞分裂素類（玉米素，6-BA ) 0.1

6、10 mg /L1）、激素： 多數(shù)情況下，單獨(dú)使用2，4-D可以成功誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生案例1：MS培養(yǎng)基含有不同濃度2，4-D時(shí)斑茅幼葉形成愈傷組織的誘導(dǎo)率（%） 不同濃度的2，4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率是不同的。一般情況下，2，4-D的濃度過低（低于10-9mg/L）時(shí)，愈傷組織生長緩慢；濃度過高（高于10 mg/L）時(shí)，就會(huì)抑制愈傷組織的生長。2、影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素：、影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素：二、愈傷組織的形成愈傷組織從增殖的組織細(xì)胞中產(chǎn)生，激素改變細(xì)胞的新陳代謝狀態(tài)，從生長靜止期到代謝旺盛。v從外植體脫分化形成愈傷組織大致可分為三個(gè)時(shí)期：起動(dòng)期 （誘導(dǎo)期）、分裂期和分化期。v三個(gè)時(shí)期愈

7、傷組織的代謝狀況、結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞的平均大小都有明顯的差別。 （1）誘導(dǎo)期誘導(dǎo)期（起動(dòng)期（起動(dòng)期、或起始期、或起始期）: : v起動(dòng)期： 細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時(shí)期，愈傷組織形成起點(diǎn)。 外植體細(xì)胞在完整植株中隨著細(xì)胞的分化過程而逐漸停止分裂，開始執(zhí)行它們各自不同的功能。外植體細(xì)胞一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，稱為靜止細(xì)胞。 在外源植物激素的作用下，處于靜止?fàn)顟B(tài)的植物細(xì)胞經(jīng)過復(fù)雜的脫分化過程恢復(fù)分裂能力轉(zhuǎn)化為分生細(xì)胞。此過程有人稱之為：細(xì)胞的誘導(dǎo)活化過程。 期，并發(fā)生同步分裂。期，并發(fā)生同步分裂。v在誘導(dǎo)期，代謝活化了，細(xì)胞內(nèi)的合成代謝加強(qiáng)，如合成代謝加強(qiáng)，迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的合成。但是細(xì)胞的大小仍然和外植體時(shí)一樣，

8、沒有多大改變。誘導(dǎo)期的長短v由一系列內(nèi)部（植物的種類、生理狀況）和外部（光照、外源激素）因素決定。 例如：菊芋的誘導(dǎo)期有時(shí)還不需要1天，胡蘿卜則要好幾天，而菊芋塊莖貯藏時(shí)間的改變，誘導(dǎo)期也發(fā)生改變。從11月到次年4月取菊芋塊莖進(jìn)行培養(yǎng)，則誘導(dǎo)期從22小時(shí)逐漸延長到40小時(shí)。 外植體外植體(explant)中中已分已分化的活細(xì)胞在外源激素化的活細(xì)胞在外源激素的作的作用下，外植體用下，外植體外層細(xì)胞外層細(xì)胞出現(xiàn)出現(xiàn)了分裂，由于外層細(xì)胞的了分裂，由于外層細(xì)胞的迅迅速分裂速分裂使得這些細(xì)胞的使得這些細(xì)胞的體積體積縮小，縮小，逐漸回復(fù)到逐漸回復(fù)到分生組織分生組織狀態(tài)，狀態(tài)，該時(shí)期細(xì)胞通過該時(shí)期細(xì)胞通過脫

9、分脫分化化的起動(dòng)期而進(jìn)入的起動(dòng)期而進(jìn)入分裂，分裂，并并開始開始形成愈傷組織。形成愈傷組織。（2）分裂期：分裂期分裂期特征： 生理生化上分裂期的一個(gè)明顯特征是外層細(xì)胞進(jìn)行分裂，而中間的細(xì)胞不分裂。另外還有細(xì)胞數(shù)目增加，體積變?。患?xì)胞核和核仁增到最大，RNA含量達(dá)到最高等。 此時(shí)期的愈傷組織：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏散，缺此時(shí)期的愈傷組織：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏散，缺少組織的結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明。少組織的結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明。 分裂期愈傷組織分裂期愈傷組織v 細(xì)胞分裂從分裂期的周緣細(xì)胞分裂為主逐漸轉(zhuǎn)向內(nèi)部的組織細(xì)胞，愈傷組織表層細(xì)胞分裂減緩或停止，內(nèi)部深層細(xì)胞分裂并形成像維管束或類似于分生組織組成的鳥巢狀結(jié)構(gòu)的

10、次生組織。v 此時(shí)期中細(xì)胞的伸展和分裂處于平衡，故細(xì)胞的平均大小趨于穩(wěn)定。（3）形成期（形成期）： 生長旺盛的愈傷組織一般呈乳黃色或白色，有光澤；也有淺綠色或綠色；而老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色。形成期愈傷組織的特點(diǎn)：形成期愈傷組織的特點(diǎn)： 根據(jù)形態(tài)變化列出三個(gè)時(shí)期，實(shí)際上它們的界限并不分嚴(yán)格，特別是分裂期和分化期。一塊培養(yǎng)組織的細(xì)胞既有分裂的又有分化的。v 不同植物來源的愈傷組織，在質(zhì)地、形態(tài)和物理性狀方面均有明顯的差異。有的愈傷組織呈淡黃色或白色，有的愈傷組織呈綠色或紅色。 v 一般來說，來源于相同組織的愈傷組織含有的色素大致相同， 但經(jīng)過反復(fù)繼代培養(yǎng)后會(huì)失去色素。 愈傷組織的類型：

11、愈傷組織的類型：根尖愈傷組織根尖愈傷組織 （無色透明）（無色透明）莖尖愈傷組織莖尖愈傷組織 （淡綠色）（淡綠色）植物愈傷組織類型舉例：植物愈傷組織類型舉例：當(dāng)歸莖段愈傷組織（綠色） 香茶菜愈傷組織香茶菜愈傷組織 鎖陽愈傷組織（紅色）鎖陽愈傷組織（紅色）1.3.1.2 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生v愈傷組織培養(yǎng)物在某些條件下，可以再分化產(chǎn)生不定芽或根的分生組織甚至是胚狀體，繼之，由這些有結(jié)構(gòu)的組織而發(fā)育成苗或完整小植株。v 愈傷組織通過再分化形成再生植株的方式主要有三種：1)、先產(chǎn)生芽，后在莖的基部長根；2)先長根，再長芽；3)愈傷組織的不同部位分別形成根和芽。 一）、一）、 愈傷組織形

12、成愈傷組織形成1 、器官的形成 一般愈傷組織開始分化時(shí)，由大小不等的細(xì)胞開始逐漸形成大小均勻的細(xì)胞，保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。 在分化時(shí)，愈傷組織的表層和內(nèi)部都可形成分生中心。芽多發(fā)生在愈傷組織的表層，屬外起源。二）、激素對(duì)愈傷組織分化的影響v植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在分化過程中的作用是極為明顯的，合適的植物生長物質(zhì)配比在器官分化中起著重要的作用。 如仙人掌科的金牛掌莖段培養(yǎng)中，當(dāng)6-BA的濃度是NAA的50100倍時(shí)，莖段的愈傷組織可以再分化出仔球，而6-BA濃度過高(150倍)或過低(10倍)則無仔球形成。愈傷分化愈傷分化不同濃度的激素對(duì)煙草愈傷組織的影響器官分化的植物激素控制理論v大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

13、大多數(shù)植物組織或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理論。 即：生長素與細(xì)胞分裂素的比例小時(shí)則產(chǎn)生苗，比例大時(shí)則生根，而兩種激素的比例適中時(shí)，則產(chǎn)生無結(jié)構(gòu)的愈傷組織。外植體外植體愈傷組織愈傷組織芽芽根根再生植株再生植株脫分化脫分化再分化再分化高生長素高生長素(1,2-D)高高(生長素生長素/細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素)低低(生長素生長素/細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素)器官發(fā)生途徑器官發(fā)生途徑木本植物愈傷組織形態(tài)發(fā)生的人為調(diào)控v第一步：利用分化培養(yǎng)基（含有6-BA、CPPU、KT）使愈傷組織形成不定芽，增加繁殖系數(shù)。v 第二步：當(dāng)不定芽長大出現(xiàn)葉片后，再將伸長的苗從基部切下轉(zhuǎn)入含生長素類（如IAA、NAA

14、）的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)根的生成。 四四 、 愈傷組織的培養(yǎng)愈傷組織的培養(yǎng)一）、培養(yǎng)基一）、培養(yǎng)基 培養(yǎng)基培養(yǎng)基一般包括一般包括大量大量元素、元素、微量微量元素和一種元素和一種碳水碳水化合物化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。，最常用的碳水化合物是蔗糖。 這樣簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基這樣簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基)只有很少幾種植只有很少幾種植物組織能夠培養(yǎng)和維持下去，大多數(shù)組織需要添物組織能夠培養(yǎng)和維持下去，大多數(shù)組織需要添加各種各樣的附加物（加各種各樣的附加物（完全培養(yǎng)基），完全培養(yǎng)基），如維生素如維生素、氨基酸、糖醇，生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、氨基酸、糖醇，生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、螯合劑如

15、、螯合劑如EDTA、各種營養(yǎng)性的提取物如椰子、各種營養(yǎng)性的提取物如椰子汁等。汁等。注意：注意： 選用完全已知的合成化合物，不大主張選用完全已知的合成化合物，不大主張用復(fù)雜的天然產(chǎn)物，如酵母提取物、番茄汁、用復(fù)雜的天然產(chǎn)物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。椰子汁等。必須強(qiáng)調(diào)：必須強(qiáng)調(diào)： 適合于誘發(fā)愈傷組織的培養(yǎng)基不一定適適合于誘發(fā)愈傷組織的培養(yǎng)基不一定適合于維持這些愈傷組織；適合于液體培養(yǎng)的合于維持這些愈傷組織；適合于液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基也不一定適合于固體培養(yǎng)。培養(yǎng)基也不一定適合于固體培養(yǎng)。 培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基中的N，大多數(shù)都用，大多數(shù)都用硝態(tài)氮硝態(tài)氮，只有，只有MS培養(yǎng)培養(yǎng)基和基和B5培養(yǎng)基中才用培養(yǎng)基中才用硝態(tài)和銨態(tài)硝態(tài)和銨態(tài)的混合物。的混合物。 K的水平在近代的培養(yǎng)基中有逐漸的水平在近代的培養(yǎng)基中有逐漸提高提高的趨勢(shì)。的趨勢(shì)。 實(shí)驗(yàn)表明：各種離子濃度大為不同的培養(yǎng)基往往能實(shí)驗(yàn)表明：各種離子濃度大為不同的培養(yǎng)基往往能使相同的組織快速生長。使相同的組織快速生長。 例如例如Hildebrandt培養(yǎng)基與培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基顯著不同，但培養(yǎng)基顯著不同，但二者都能培養(yǎng)煙草的愈傷組織。二者都能培養(yǎng)煙草的愈傷組織。二）、愈傷的培養(yǎng)方式：1、按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，愈傷組織培 養(yǎng)分為固體和液體培養(yǎng)兩大類。