膿毒癥動物模型的選擇與評價

1、膿毒癥(Sepsis作為急危重癥領域的棘手難題,日益引起臨床醫(yī)師及科研工作者的關注。近十年來,現(xiàn)代生物科技的飛速發(fā)展極大地促進了人們對膿毒癥發(fā)病機制的認識,并推動了膿毒癥治療措施的改進和更新。其中,膿毒癥動物模型的應用對此起到了十分重要的作用。膿毒癥動物模型的不斷發(fā)展也反映了人們對膿毒癥本質的認識正在逐漸深入,總結和分析現(xiàn)有動物模型,對于如何建立更貼近臨床實際的膿毒癥動物模型、合理設計實驗以及準確解釋動物實驗數(shù)據(jù)都具有重要意義。1應用膿毒癥動物模型的意義在過去的幾年中,人們對感染后炎癥反應分子機制的研究已取得顯著進展,其中很大部分是利用體外觀察的方法對細胞生理學研究的成果。應明確的是,盡管體外

2、實驗的手段先進而且方便,但要更好地了解膿毒癥時體內炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展過程和其他病理生理變化,還需采用臨床相關的膿毒癥或膿毒性休克動物模型進行深入的探討。一般認為,利用動物模型進行膿毒癥研究具有以下優(yōu)點。1.1在進行具有高度創(chuàng)傷性的操作或進行器官離體實驗時只能使用動物模型。特別是在研究膿毒癥的病理生理變化時通常需要采集組織標本(如肝、肺、腎等,而這些標本很難從臨床獲得。只有利用動物模型才可能方便地采取膿毒癥各個階段的組織標本。1.2臨床膿毒癥病因較復雜,難以判斷其確切的發(fā)病時間。很多患者還伴有其他嚴重的非相關疾病。并且,臨床的膿毒癥患者通常接受多種支持治療,這些治療不可避免地會影響對膿毒癥自然

3、病程的觀察。因此,直接探討人類膿毒癥的病理生理機制相當困難,而采用動物模型進行實驗則可免受上述因素的干擾。1.3由于臨床膿毒癥患者的遺傳學背景非常復雜,加之患者年齡、性別、同時存在的其他疾病以及支持治療等因素均可導致臨床資料的高度變異性。而要控制這種變異只能靠加大樣本量,這無疑將會耗費更多的時間并給臨床膿毒癥試驗帶來很大的經(jīng)濟壓力。由于動物模型的生物學差異較人類要小,因此所需的樣本量也明顯少于臨床觀察。1.4在探討膿毒癥的發(fā)病機制時經(jīng)常要使用一些藥物或試劑(如某種細胞因子的抗體或拮抗劑等,這些制劑可能具有毒性或未經(jīng)過臨床的安全性檢驗不能用于人體。因此,只有采用動物模型才能方便地利用這些制劑來了

4、解膿毒癥發(fā)病的分子機制。除此之外,應用膿毒癥的動物實驗模型還可對藥物進行臨床試驗前的篩選。由此可見,在探索膿毒癥發(fā)生、發(fā)展機制的過程中,選擇適宜的膿毒癥或膿毒性休克動物模型進行體內研究仍具有不可替代的地位。2膿毒癥動物模型的選擇及其局限性大量的臨床及實驗研究資料表明,盡管在過去十幾年中有關膿毒癥發(fā)病機制的認識已取得較大進展,但對于膿毒癥治療和新藥開發(fā)方面的研究卻不容樂觀。許多新的干預膿毒癥制劑雖然在動物實驗中表現(xiàn)出很好的應用前景,但其在臨床II期和III期試驗中均未取得顯著的臨床療效,甚至反而加重疾病的程度。迄今為止,嚴重膿毒癥或膿毒性休克的死亡率仍高達50%左右。造成這一現(xiàn)象的重要原因之一即

5、是在藥物應用于臨床前的動物實驗觀察中所膿毒癥動物模型的選擇與評價姚詠明(解放軍總醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍燒傷研究所,北京,100037YAOYong-ming作者簡介姚詠明(1965-,男,湖北人,醫(yī)學博士后,教授,博士生導師。主要從事創(chuàng)傷休克、膿毒癥和多器官功能障礙綜合征發(fā)病機制及防治的研究?，F(xiàn)任解放軍總醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所副所長、中國微生物學會微生物毒素分會副主任委員、中國中西醫(yī)結合急救醫(yī)學分會常委、中國災害防御協(xié)會救援醫(yī)學會常務理事等職。選擇的動物模型不當。當然,許多膿毒癥或膿毒性休克動物模型盡管不適于藥物的臨床前研究,但它們在探索疾病的發(fā)病機制和機體的病理生理反應方

6、面發(fā)揮了重要作用。因此,在膿毒癥或膿毒性休克研究中如何選擇適宜的動物模型具有十分重要的意義。在通常的動物實驗中,一般盡可能地選用健康的相同性別的同系動物,且嚴格控制實驗條件以確保實驗結果的穩(wěn)定性。由于人類的遺傳背景極為復雜,加之膿毒癥的原發(fā)病因多樣且輔助治療手段多有不同。因此,將動物實驗的結果推廣到人類具有一定的困難。有學者根據(jù)多年的經(jīng)驗提出,在研究膿毒癥的治療手段特別是新藥開發(fā)的過程中應聯(lián)合使用幾種不同的膿毒癥動物模型。如果某種藥物在幾種膿毒癥動物模型中均安全、有效,那么該藥物的臨床應用前景將更為可信。由于種屬間存在的固有差異,在膿毒癥的實驗中除了動物模型種類的選擇外,對動物模型物種的選擇也

7、是一個值得注意的問題。多種因素影響著對實驗動物種屬的選擇,從經(jīng)濟方面考慮,小動物(如大鼠、小鼠、豚鼠等常適用于大批量動物實驗或死亡率的觀察;但有些實驗只能采用大動物(如豬、羊等的慢性模型,主要用于了解膿毒癥時動物的心血管及肺等器官的病理生理反應。動物實驗有可能得出與臨床觀察相矛盾或意料之外的結果,這些都促進研究者回過頭來對動物模型進行嚴格的分析再評價,從而逐漸明確二者之間的關系與差別。實際上,無論過去還是將來,我們都應該知道動物模型和臨床實際之間是存在明顯差別的?；蚨鄳B(tài)性和性別差異對臨床患者的病情有較大的影響,但這一點可能在動物實驗中卻沒有得到充分體現(xiàn)。例如,內毒素(L P S耐受的C3H/

8、H e J小鼠在受到L P S攻擊時不能分泌腫瘤壞死因子-(T N F-,因而可以耐受大劑量的LPS攻擊。但用有毒菌對其進行攻擊時,其死亡率高于LPS反應性的小鼠。大多數(shù)實驗都采用年輕、健康且沒有接受過打擊的動物。而且,在進行數(shù)據(jù)分析時必須考慮人和實驗動物的種屬差異。在臨床工作中,病人也不可能像實驗動物一樣在打擊前后立即接受處理措施。因此,使用預處理的動物模型應慎重?；蚯贸部梢钥闯墒且环N預處理手段,應用基因敲除,可以剔除或加強所研究的因素在實驗中的影響,是一種有效的實驗方法。在許多動物試驗,尤其是使用小動物的研究中,往往缺乏復蘇支持治療,這可能對實驗結果產生較大影響。例如,不能給予膿毒癥動

9、物充分的液體復蘇支持,可能影響其生存率;另一個重要的輔助治療是抗生素。如果利用感染模型觀察某一抗膿毒癥藥物(不具有對抗細菌作用的療效,應該同時使用抗生素,因為臨床病人在發(fā)生嚴重感染所致膿毒癥或休克時往往應用抗生素。實際上,如果這些新藥的療效不及抗生素的話,就沒有研發(fā)的價值。并且,抗生素也可通過影響LPS的釋放而影響膿毒癥的發(fā)展。因此,針對膿毒癥或膿毒性休克的動物實驗必須設立抗生素對照組。在進行臨床試驗之前,必須進行充分的動物試驗,應用不同的感染模型、不同種類動物進行觀察,明確所研究的藥物在什么情況下最有效,或者為什么無效甚至有害。另外,還要考慮到實驗模型與人類疾病的相關性,例如感染方式、劑量、

10、細菌的毒力等都需要考慮到。在休克模型中,使用控制性還是非控制性失血模型是考慮因素之一,此外還應考慮到對動物的打擊方式是一致的還是不統(tǒng)一的,因為臨床病人的致傷情況各不相同。最后,必須明確動物模型的發(fā)病過程與臨床患者的病情發(fā)展是有差別的。在動物實驗中,往往是在給予動物致命打擊后數(shù)小時或幾十小時就進行實驗終點或存活情況觀察;而在臨床實際當中,病人的病情發(fā)展系一個漸進性、相對緩慢的過程,刺激因素持久存在,生理功能的失代償、組織的損害及功能紊亂逐漸發(fā)展。因此,發(fā)展迅速而兇險的急性膿毒癥動物模型與相對緩慢的臨床相關性強的動物模型差別較大。不宜使用在612小時內即出現(xiàn)大量死亡的急性動物模型來模擬臨床膿毒癥發(fā)

11、展。在這種急性模型中,動物不可能有時間出現(xiàn)與臨床膿毒癥相似的全部特點,從而使實驗結果的分析顯得十分模棱兩可。同時,其他如肝素的使用、麻醉等因素都會影響實驗結果的分析,這些因素本身就可以抑制機體的免疫反應,影響心血管功能、器官的血流灌注等。3常用膿毒癥動物模型評價3.1腹膜炎模型目前應用較為廣泛的腹膜炎模型為盲腸結扎穿孔(CLP模型和腹腔植入含活菌纖維蛋白凝塊的模型。這兩種模型操作簡單、可重復性強,在大動物和小動物均適用。其主要優(yōu)點是動物具有與人類膿毒癥相似的高動力型心血管反應,即心輸出量升高、全身血管阻力降低。同時,動物體內的細胞因子反應也類似于臨床膿毒癥患者,使之可用于膿毒癥時機體炎癥反應平

12、衡和失控方面的研究。從總體來看,在進行了充分的液體復蘇和適當輔助治療(如抗生素治療時,這類模型與臨床膿毒癥有一定的相關性,可用于治療膿毒癥或膿毒性休克新藥的臨床前觀察。其優(yōu)點具體表現(xiàn)為:(1對于CLP模型而言,無須特意準備接種物(例如細菌的種類和數(shù)量;(2這兩種動物模型都發(fā)生菌血癥和漸進性膿毒癥癥狀及體征,幾天后可進一步出現(xiàn)心血管系統(tǒng)衰竭和死亡,其病理過程與臨床情況貼近;(3適用于大或小的動物;(4動物的癥狀和表現(xiàn)慢慢發(fā)生并逐漸惡化,最后導致膿毒性休克,于數(shù)天內死亡。發(fā)病過程較長,有利于觀察和進行各種干預;(5模型復制后即可誘發(fā)動物體內產生大量細胞因子,血中細胞因子水平改變的時機及維持時間與臨

13、床膿毒癥患者類似;(6可引起與人類膿毒癥或膿毒性休克相似的早期高動力型(高排低阻及晚期低動力型(低排高阻的血流動力學變化。當然,這兩種模型也存在著不足之處。例如,在血凝塊模型中,不能手術清除感染灶,這一點與臨床情況不太吻合。然而,當進行液體復蘇或抗生素等輔助治療時,這兩種模型與臨床情況比較貼近。CLP模型主要是使細菌從受損的內臟漏入腹腔引起腹腔內感染,其缺點主要是感染細菌的量難以控制。這可以通過應用大動物來解決,但同時又帶來另一個問題,即大動物個體差異較大,往往干擾實驗結果。而直接將含菌物接種到動物腹腔在一定程度上可以控制感染的嚴重程度。此外,如果動物太小,血量太少,有關血液檢測指標的測定有一

14、定困難。這兩種模型較適用于檢驗某藥物能否改善嚴重膿毒癥或膿毒性休克預后的臨床前期試驗。3.2血管內輸注活菌模型此模型優(yōu)點是一次性大量注入后可在短時間內出現(xiàn)血壓下降等休克癥狀,但與臨床情形還存在很大差別。盡管在膿毒癥的研究中許多實驗采用了一次性或短時間內(14小時經(jīng)靜脈輸注大量活菌1091010菌落形成單位(CFU/kg的動物模型,而且采用細菌攻擊制作模型具有操作方便、可重復性好等優(yōu)點,但血管內輸注模型與臨床膿毒癥有著明顯的差異。首先,在臨床膿毒癥中,大多數(shù)患者體內的細菌并不是一次性大量侵入的,而是在一定時期內從感染灶持續(xù)不斷地進入血循環(huán)。此外,在內毒素血癥時,炎癥反應對機體主要是損害效應。但臨

15、床病例中,大多數(shù)膿毒癥患者常存在侵入性細菌感染,而要控制和清除這些細菌則需要機體炎癥反應的幫助。因此,在探討膿毒癥的發(fā)病機制時,體內是否存在活菌將會對實驗結果帶來很大影響,甚至得出截然不同的結果。具體不足是: (1一次性大劑量靜脈注入細菌與臨床情況不符,膿毒癥患者細菌感染常常是由局部逐漸擴散入血的。類固醇、抗TNF-抗體等都在使用這些模型的靈長類動物上顯示出療效,但最后都沒有通過嚴格對照的臨床試驗;(2一次性大量細菌在短時間內進入血循環(huán),很快造成心血管系統(tǒng)功能紊亂,因此不出現(xiàn)膿毒癥患者特有的早期高排低阻型血流動力學特點,而是一開始即呈現(xiàn)低排高阻型血流動力學改變;(3病情發(fā)展快,存活時間短,很多

16、膿毒癥癥狀表現(xiàn)不明顯;(4一次性靜注大劑量活菌(1091011CFU/kg對機體的影響是中毒而不是感染,因為常用的大腸桿菌為086及0111菌株。此類菌株為血清敏感型,入血后很快就被血清滅活,失去在動物體內繁殖的能力。血中可出現(xiàn)與膿毒癥患者相似的細胞因子反應,但為時短暫,且產生量大,與臨床實際很不一致;(5動物體內糖異生水平下降,出現(xiàn)低血糖,而膿毒癥患者體內情況往往與此相反;(6經(jīng)這種模型證明有效的藥物還沒有能通過臨床多中心試驗的。因此,即使以靈長類動物作為實驗對象,使用該模型的臨床前期觀察對臨床試驗沒有多少幫助。目前,除腦膜炎球菌血癥外,這種模型并不能很好模擬其他臨床過程。3.3內毒素攻擊模

17、型LPS攻擊模型具有一些優(yōu)點,其中之一是這種模型較易復制。LPS(及其他細菌胞壁產物可誘導產生膿毒癥癥狀及體征。給健康志愿者注射小劑量L P S可誘導產生與膿毒癥患者類似的血流動力學、血液學及代謝改變。因此,在許多方面,內毒素血癥模型都可以稱得上是一種較理想的動物模型。有資料證實,輸注LPS動物實驗中血清細胞因子水平要遠遠高于膿毒癥病人,這就有助于解釋為什么細胞因子拮抗療法只能在動物實驗中取得很好的效果,而對于膿毒癥病人沒有明顯療效。然而,一些報道指出此動物模型在發(fā)生循環(huán)衰竭之前,出現(xiàn)過短暫的高動力循環(huán)狀態(tài)。這是通過減少細菌或LPS輸注用量,延長輸注時間,同時給予持續(xù)的液體復蘇實現(xiàn)的。我們認為,這些動物模型適合于模擬亞急性膿毒癥,此外,給予動物持續(xù)的液體復蘇學習提綱1.掌握常用的膿毒癥動物模型評價。2.熟悉膿毒癥動物模型的選擇及其局限性。3.了解利用動物模型進行膿毒癥研究的優(yōu)點?？裳娱L動物生存時間,并能幫助建立動物的高動力循環(huán)狀態(tài)。給予亞致死量的LPS可誘導動物產生高動力循環(huán)特點,而致死量L P